載阿霉素納米粒溫敏凝膠的制備及評價*

杜華康, 陸苑, 金陽, 陳玉穎, 王永林,3, 李勇軍,3, 劉文**

(1.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫科大學 貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心, 貴州 貴陽 550004)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大常見癌癥,也是癌癥相關死亡的第二大常見原因[1]。早期HCC患者主要以手術切除治療為主,但HCC具有高度隱匿性,患者發現時通常是中晚期,已失去根治性手術切除的機會[2-3]。經肝動脈化療栓塞術(transarterial chemoembolization,TACE)是治療中晚期HCC的首選方法[4-6],通過血管栓塞實現局部腫瘤組織缺血壞死,同時釋放化療藥物殺傷腫瘤細胞[7-8]。傳統TACE是以碘油和化療藥物水溶液簡單混合得到的乳劑為栓塞載藥材料,在臨床上最為常用,但存在穩定性較差、釋藥快和末梢栓塞不完全的問題,一定程度上影響治療效果[9]。為解決傳統TACE的這些問題,現已開發和應用載藥微球[10-13]。載藥微球一般是由聚乙烯醇等有機材料構成,穩定性較好、能夠栓塞末梢小動脈且可實現化療藥物的局部緩釋,但載藥微球材料不可降解,這往往會導致嚴重的炎癥反應并阻礙后續治療[14]。HCC易復發,意味著患者可能需要多次TACE治療,因此載藥栓塞材料的生物可降解性就顯得尤為重要。因此,用于TACE治療的載藥栓塞材料需要具備可血管栓塞、長時間緩慢釋放藥物和體內可降解的特點。溫敏水凝膠是一類可響應外界環境溫度的變化,由液態轉變為固態的水凝膠,具有可注射、栓塞血管和長滯留特性,可通過局部注射到達靶部位形成藥物儲庫,實現緩慢釋藥[15]。其中以天然多糖聚合物,特別是以殼聚糖(chitosan,CS)為基質的溫敏水凝膠,因具有制備工藝簡單、成本較低、生物相容性好、生物可降解及抗菌等諸多優點而受到廣泛關注[16-17]。課題組前期采用CS、β-甘油磷酸鈉(β-sodium glycerophosphate,β-GP)和右旋酮洛芬氨丁三醇制備的右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏凝膠,具有良好的緩釋性能和生物相容性[18-19]。納米粒通常是指直徑在10～1 000 nm的粒子,其可通過增加藥物半衰期、提高藥物穩定性和延長藥物釋放時間來提高藥物的生物利用度[20]。腫瘤治療中可利用腫瘤組織的增強滲透和滯留效應,將化療藥物制備成納米粒(≤200 nm),使藥物具有一定靶向性[21]。乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid),PLGA)]是一種已通過FDA認證并廣泛應用于制藥領域的高分子材料,具有可降解性、良好的生物相容性和低毒性的特點[22]。近年來,一些研究結果表明通過將納米粒和溫敏凝膠相結合的方式,可實現藥物在局部的緩慢釋放[23-25]。因此,本研究以PLGA作為載體材料,以經典化療藥物阿霉素(doxorubicin,DOX)為研究對象,采用復乳法制備載阿霉素納米粒(doxorubicin-loaded nanoparticles,DOX-NPs),經冷凍干燥后得DOX-NPs凍干粉,再將其分散于CS/β-GP溫敏凝膠(thermosensitive gel,Gel)中,制備出具有可栓塞血管、皮下吸收和緩慢釋藥特性的TACE栓塞載藥材料,為肝癌的TACE治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器和試藥 Forma 905-ULTS1490醫用低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司),FDU-1100真空冷凍干燥機(日本東京理化器械株式會社),JY88-IIN細胞破碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司),90Plus激光粒度儀(美國布魯克海文儀器公司),R100旋蒸儀(瑞士步琦公司),Optima XPN-100超速離心機(美國貝克曼庫爾特公司),JEM 1200EX透射電鏡(日本電子株式會社),Merlin Compact掃描電鏡(德國蔡司公司),CS501A恒溫水浴槽(中國重慶銀河試驗儀器有限公司),MSC5R磁力攪拌器(群安實驗儀器有限公司),UV-2700紫外可見分光光度儀[(島津儀器(蘇州)有限公司)],IMS-20制冰機(常熟市雪科電器有限公司),EL204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司),2.7F SP微導管(日本泰爾茂株式會社)。酸多柔比星原料藥(DOX,含量>98.0%,批號N1111A,大連美倫生物技術有限公司),CS(脫乙酰度≥95%,批號RH209117,上海羅恩試劑有限公司),β-GP(含量≥98.0%,批號BCCC6949,美國西格瑪奧德里奇公司),PLGA(批號RJ0202007,相對分子量10 kDa,型號50∶50,西安瑞禧生物科技有限公司) ,卵磷脂(批號180701,供口服用藥用輔料,江蘇曼氏生物科技股份有限公司),聚山梨酯80(批號301C053,北京索萊寶科技有限公司),超濾管(截留分子量30 kDa,默克密理博公司),其余試劑均為分析純。

1.1.2實驗動物 本研究動物實驗方案通過了貴州醫科大學實驗動物倫理委員會審查批準(編號2201022)。雄性ICR小鼠24只,體質量(20±2)g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,生產許可號SCXK(京)2019-0010。新西蘭大白兔3只雌雄隨機,體質量(2.8±0.2)kg,購于貴州醫科大學實驗動物中心,生產許可證號SCXK(黔)2018-0001。

1.2 研究方法

1.2.1DOX-NPs的制備 采用復乳法[26]制備DOX-NPs：稱取 PLGA 25 mg、卵磷脂30 mg溶解于3 mL二氯甲烷作為油相,將0.2 mL內水相(4 g/L的DOX溶液)滴入油相后,冰水浴條件下探頭超聲1 min即得初乳,將初乳轉移至9 mL聚山梨酯80溶液(20 mg含聚山梨酯80)中,超聲3 min即得復乳,減壓蒸餾除去二氯甲烷后即得DOX-NPs混懸液。將DOX-NPs混懸液于31 200 r/min下離心1 h,吸除上清液后收集底部DOX-NPs加入凍干保護劑蔗糖(蔗糖終濃度50 g/L),真空冷凍干燥后得到DOX-NPs凍干粉。

1.2.2DOX-NPs的粒徑測定及形態觀察 按照最優處方工藝制備DOX-NPs,采用激光粒度儀對其粒徑和Zeta電位進行檢測。吸取少量DOX-NPs溶液,用蒸餾水稀釋后,直接用掃描電鏡觀察、拍照;取 DOX-NPs溶液1滴,滴于300目的電鏡制樣銅網上,2%磷鎢酸負染色50 s,濾紙除去多余的液體,室溫下自然干燥后,透射電鏡下觀察、拍照。

1.2.3包封率和載藥量的測定 精密稱取適量DOX-NPs凍干粉于EP管中,用DMSO溶解后,通過紫外分光光度計測定484 nm處的吸光度,計算凍干粉中DOX的量,通過公式計算樣品的包封率和載藥量。包封率(%)=凍干粉中DOX的量/投藥量)×100% ,載藥量(%)=(凍干粉中DOX的量/DOX-NPs的重量)×100%。DOX-NPs的重量=凍干粉的量-蔗糖的重量。

1.2.4空白Gel、空白NPs-Gel和DOX-NPs-Gel的制備 空白Gel的制備：在實驗室前期研究基礎[18-19]上制備CS/β-GP溫敏凝膠。將CS 1.0 g 溶于50 mL濃度為0.1 mol/L的冰乙酸溶液中,磁力攪拌至其完全溶解,得澄清透明的CS溶液;稱取β-GP 溶于10 mL濃度為0.02 mol/L的NaOH溶液中,得56%的β-GP溶液;于玻璃小瓶中加入2 mL上述CS溶液,隨后置于冰浴下攪拌,用注射器將56%β-GP 0.5 mL溶液極緩慢注入CS溶液中,繼續在冰浴下攪拌30 min,即空白Gel。空白NPs凍干粉的制備：除將內水相改為純水外,其他步驟與DOX-NPs凍干粉制備一致。空白NPs-Gel或DOX-NPs-Gel的制備：于玻璃小瓶中加入適量空白NPs凍干粉或DOX-NPs凍干粉(含DOX 5 mg)后繼續加入2 mL上述CS溶液,隨后置于冰浴下攪拌,用注射器將56%β-GP 0.5 mL溶液極緩慢注入CS溶液中,繼續在冰浴下攪拌30 min,即得空白NPs-Gel或DOX-NPs-Gel。

1.2.5空白Gel、空白NPs-Gel和DOX-NPs-Gel的膠凝時間與溫度考察 采用倒瓶法[27]考察溫敏凝膠溶液37 ℃下的膠凝時間：將“1.2.4”項中制備的3種溫敏凝膠從冰浴轉移至室溫靜置10 min后置于37 ℃的恒溫水浴槽中,每隔5 s傾斜瓶子,觀察液態凝膠是否變為固態。如此反復直至固態,記錄時間,即為37 ℃條件下溫敏凝膠溶液的膠凝時間。平行測定3次,取平均值。使用試管翻轉法[28-29]測定溫敏凝膠溶液膠凝溫度。“1.2.4”項中制備的3種溫敏凝膠置于水浴中并在4 ℃下平衡10 min,然后以1 min/℃的速度程序升溫,每個溫度下放置1 min。將樣品小瓶倒置后,如果溫敏凝膠1 min內不發生通過流動,則認為其完成膠凝化,該溫度即為溫敏凝膠的膠凝溫度。平行測定3次,取平均值。

1.2.6Gel和DOX-NPs-Gel的掃描電鏡考察 按照“1.2.4項”所述制備空白Gel和DOX-NPs-Gel待其充分膠凝化后,-20 ℃下冷凍過夜,-40 ℃真空干燥24 h,將干燥后的凝膠通過液氮脆斷、噴金塑形后,通過掃描電鏡觀察其微觀形態結構。

1.2.7空白NPs-Gel血管栓塞性能和皮下吸收特性考察 由于DOX會導致嚴重的局部炎癥反應,本部分實驗采用空白NPs-Gel進行栓塞性能和皮下吸收特性的考察[30]。取3只新西蘭大白兔進行兔耳中動脈血管栓塞實驗,從兔耳中動脈遠心端向近心端緩慢注入空白NPs-Gel 0.2 mL。分別在注射后10 min、第1、5、8天時仔細觀察兔耳的缺血情況。在24只ICR小鼠的右后腿部皮下分別注射0.3 mL空白NPs-Gel,分別注射后1、3、5、10、15、20、25和30 d脫頸處死3只小鼠,觀察皮下凝膠的吸收情況并拍照記錄,隨后小心取下空白NPs-Gel用濾紙擦干表面后稱重,計算其吸收量。吸收量=(原始重量-剩余重量)/原始重量×100%。

1.2.8空白Gel和DOX-NPs-Gel體外微導管推注實驗 由于血管栓塞及皮下吸收特性考察中注射所用的針頭與TACE中實際注射所用的微導管存在較大區別,為更好的模擬TACE的使用環境,本實驗通過使用2.5 mL注射器分別抽取適量空白Gel和DOX-NPs-Gel,連接2.7F微導管后向盛有37 ℃生理鹽水的燒杯內推注,觀察其導管內流通性和導管外的膠凝化行為。

1.2.9DOX-NPs-Gel體外釋放考察 采用無膜溶出法[31]考察DOX-NPs-Gel的體外釋放：吸取1 mL上述DOX-NPs-Gel于5 mL EP管中,置于37 ℃恒溫水浴槽中待其完全膠凝后取出加入3 mL 體積分數為1% 的DMSO水溶液作為釋放介質,避光置于37 ℃恒溫振蕩儀(50 r/min),分別在0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144及168 h時取樣2 mL,同時補充相同體積和溫度的釋放介質。取出的釋放介質平均分成兩份;一份1 mL為樣品A,包含DOX和DOX-NPs,用于計算DOX總釋放率;另一份1 mL置于超濾管中,8 000 r/min離心15 min,下層濾液為樣品B,為釋放出的DOX,用于計算DOX釋放率。樣品A和B凍干后用2 mL DMSO溶解,通過紫外分光光度計測定484 nm處吸光度,計算各樣品中DOX的濃度,計算DOX總釋放率和DOX釋放率。DOX總釋放率減去DOX釋放率為DOX-NPs釋放率。

2 結果

2.1 DOX-NPs的表征、載藥量和包封率

從圖1中可以看出本研究制備的DOX-NPs的粒徑主要在100～200 nm,且成均勻球形,形態規則無粘連,粒徑分布均勻;通過激光粒度儀測定DOX-NPs的粒徑為(186.68±5.99) nm,多分散系數(PDI)為(0.17±0.01),Zeta電位為(-23.33±1.54) mV,粒徑分布見圖2。紫外分光光度計測得DOX-NPs的包封率和載藥量分別為(70.75±2.11)%和(2.70±0.29)%。

注：A為掃描電鏡結果,B為透射電鏡結果。

圖2 DOX-NPs粒徑分布情況Fig.2 Distribution diagram of DOX-NPs particle size

2.2 膠凝化時間與溫度的測定

空白Gel平均膠凝時間為(65±5) s,膠凝前后性狀對比分別見圖3。空白NPs-Gel和DOX-NPs-Gel平均膠凝化時間均為(165±15)s,膠凝前后性狀對比見圖4和圖5。試管翻轉法測得膠凝化溫度,空白Gel、空白NPs-Gel和DOX-NPs-Gel的膠凝溫度分別為(27.67±0.94)℃、(34.44±0.47)℃和(34.67±0.47)℃。空白NPs凍干粉和DOX-NPs凍干粉的加入均使得膠凝溫度上升約7 ℃。

注：A為液態凝膠,B為固態凝膠。

2.3 空白Gel和DOX-NPs-Gel掃描電鏡考察

空白Gel和DOX-NPs-Gel掃描電鏡圖見圖6,所有凍干凝膠都呈層狀結構,與空白Gel和DOX-Gel不同的是DOX-NPs-Gel孔道更加密集完整,層狀結構孔洞上均勻分布著納米粒,因而證明復合體系是納米粒嵌合到溫敏凝膠的多孔結構中形成的較均勻狀態。

注：A為空白Gel(200×),B為空白Gel(80 000×), C為DOX-NPs-Gel(200×),D為DOX-NPs-Gel(80 000×)。

2.4 空白NPs-Gel血管栓塞考察

如圖7所示空白NPs-Gel室溫下呈液態,黏度合適,易于注射(圖7A);兔耳中動脈栓塞前,血管呈紫紅色,觸摸感軟有彈性(圖7B);注射空白NPs-Gel后10 min,兔耳中動脈血管發白,觸摸感硬,說明空白NPs-Gel可以迅速凝固,能栓塞血管(圖7C);栓塞后1 d,兔耳呈現缺血紫紅色狀態,兔耳中動脈血管觸摸感硬(圖7D);栓塞后第5天時,兔耳中動脈出現輕微壞死現象(圖7E);栓塞后第8天時,兔耳明顯發黑壞死,說明溫敏凝膠的血管栓塞性能良好(圖7F)。

注：A為凝膠呈液態,B為栓塞前,C為栓塞后10 min,D為栓塞后1 d,E為栓塞后5 d,F為栓塞后8 d。

2.5 空白NPs-Gel皮下吸收特性考察

皮下注射空白NPs-Gel后小鼠精神狀況良好,實驗期間注射部位未見任何異常。空白NPs-Gel的外觀和剩余質量的變化見圖8(圖中紅色虛線與X軸平行)。第1 天時空白NPs-Gel外觀為直徑約1.3 cm的圓餅狀,到第5天時直徑縮小(不足1 cm),后續變化緩慢,第30天時直徑約0.7 cm。第1和第5天時空白NPs-Gel分別被吸收43.13%和58.27%,后續變化緩慢,直到第30天時剩余(38.27±2.41)%。說明空白NPs-Gel可被緩慢吸收。

圖8 空白NPs-Gel在小鼠皮下吸收量 Fig.8 Blank NPs-Gel absorbed subcutaneously in mice

2.6 空白Gel和DOX-NPs-Gel微導管推注考察

經2.7F微導管向盛有37 ℃生理鹽水的燒杯內推注,觀察其導管內流動性和導管外溶膠-凝膠轉變行為,結果見圖9。空白Gel和DOX-NPs-Gel均可順利通過體外微導管注入37 ℃的生理鹽水后會形成凝膠條帶,未出現導管堵塞現象。

注：A為空白Gel推注中,B為空白Gel條帶,C為DOX-NPs-Gel推注中,D為DOX-NPs-Gel條帶。

2.7 DOX-NPs-Gel體外釋放性能考察

第7天時,DOX-NPs-Gel中DOX的總釋放率(包含DOX和DOX-NPs)為(53.41±6.09)%,其中DOX釋放率為(6.16±0.19)%,DOX-NPs釋放率為(47.25±7.29)%,結果見圖10。

圖10 DOX-NPs-Gel的體外釋放率 Fig.10 In vitro release of DOX-NPs-Gel

3 討論

前期摸索實驗已通過單因素考察法對DOX-NPs制備中的初乳和復乳超聲時間、卵磷脂用量、聚山梨酯80用量、外水相體積和投藥量進行篩選,并篩選出最優凍干保護劑的種類及濃度。制備出的DOX-NPs粒徑適宜,載藥量較高,DOX-NPs凍干粉復溶前后粒徑、PDI和Zeta電位無明顯差異;DOX-NPs凍干粉穩定性較好,在-20 ℃下儲存30 d,粒徑、電位和PDI未發生明顯變化。制得的空白NPs粒徑為(176.19±2.36) nm,PDI為(0.17±0.01)。相較于DOX-NPs粒徑略有減小,凍干前后粒徑及PDI無明顯變化,可以用于本實驗。DOX-NPs-Gel與Gel相比表現為膠凝時間延長和膠凝溫度升高,可能原因為引入了DOX-NPs和蔗糖。目前相關研究表明陰離子聚合物的引入有利于殼聚糖溫敏凝膠膠凝的發生[32-34]。本文制備的DOX-NPs Zeta電位顯示為(-23.33±1.54) mV,可以近似看作一種陰離子聚合物,理論上是有利于CS/β-GP溫敏凝膠膠凝的發生。其機理為在CS/β-GP溫敏凝膠膠凝過程中陰離子為質子的轉移提供了更多選擇,使得CS支鏈更快的析出和交聯。前期預實驗中,在空白Gel中添加相同量(與DOX-NPs-Gel一致)的蔗糖后,膠凝時間延長、膠凝溫度升高,可能是因為蔗糖通過羥基與水的氫鍵增強了CS鏈的水化作用,同時蔗糖作為非電解質并不利于CS析出和交聯,進而不利于膠凝行為的發生。因此推測DOX-NPs-Gel膠凝時間延長、膠凝溫度升高是DOX-NPs和蔗糖共同作用結果。

掃描電鏡考察結果中,與空白Gel 相比DOX-NPs-Gel的微觀層狀多孔結構更加整齊緊密,提示DOX-NPs凍干粉的摻入可能有助于多孔結構的建立。延長DOX的釋放時間,從而增加治療時間。血管栓塞與皮下吸收特性考察及微導管推注實驗說明該復合體系可通過微導管注射、可栓塞血管、在體內可被緩慢吸收,可滿足TACE給藥要求。與目前常用的載藥微球相比,本研究制備納米粒溫敏凝膠復合體系所用材料CS、β-GP和PLGA均具有良好的生物相容性和生物可降解性[35-37]。

在進行體外釋放考察時,曾采用常規的PBS(pH7.2)作為釋放介質,但釋放1天后PBS中出現紅色絮狀沉淀。分析原因這可能是DOX·HCl在PBS中發生脫鹽反應導致析出,這與相關研究一致[38]。后續根據文獻[39]方法,采用以1% DMSO溶液為釋放介質進行體外釋放考察。DOX-NPs-Gel無明顯突釋現象且DOX主要以DOX-NPs形式從DOX-NPs-Gel中釋放。以上結果均表明1%DMSO為釋放介質并未造成DOX-NPs中藥物的泄露。同時證明DOX-NPs可以從DOX-NPs-Gel中釋放出來,基于PLGA優異的可修飾性,后續還可以引入甘草次酸或半乳糖衍生物等使DOX-NPs對肝癌細胞具有主動靶向性[40-42]。

綜上所述,本研究制備的DOX-NPs-Gel具有可栓塞血管、皮下吸收和緩慢釋藥特性,具有一定的TACE應用前景,值得進一步研究。