過氧化物酶體增殖物激活受體γ對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后大鼠認(rèn)知功能的影響*

陳筑梅, 黃淑花, 曾慶繁**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 麻醉科, 貴州 貴陽 550014; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院, 貴州 貴陽 550001; 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科, 貴州 貴陽 550001)

隨著時(shí)代的進(jìn)步和醫(yī)療技術(shù)的提高,越來越多的人愿意接受外科手術(shù)治療,然而有些患者在接受手術(shù)與麻醉后會(huì)出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知功能改變,例如注意力不集中、記憶力下降、焦慮、語言理解能力下降及學(xué)習(xí)能力降低等[1]。這一系列的改變可認(rèn)為是術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)導(dǎo)致的,許多研究認(rèn)為POCD的發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)相互交叉作用所導(dǎo)致的,包括手術(shù)方式、手術(shù)體位、手術(shù)時(shí)間、患者基礎(chǔ)情況、患者文化水平及麻醉方式等因素[2]。POCD與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的發(fā)病機(jī)制有著相似的病理基礎(chǔ),β-淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)聚集形成的可溶性寡聚體和不溶性腦淀粉斑塊被廣泛認(rèn)為是AD的潛在機(jī)制[3-4]。神經(jīng)元中有一種微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein,Tau),過度磷酸化Tau(phosphorylated Tau,P-Tau)可聚集為成對(duì)的螺旋狀纖維,誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡或死亡,導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂,引發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙[5]。近年研究表明,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptors γ,PPARγ)有神經(jīng)保護(hù)的作用,其水平與Aβ、Tau蛋白的聚集有著密切的聯(lián)系[6]。吡格列酮是PPARγ激動(dòng)劑,研究表明其有神經(jīng)保護(hù)作用[7];在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中長(zhǎng)時(shí)間大劑量的使用丙泊酚麻醉會(huì)引起學(xué)習(xí)和記憶行為的損害,麻醉和手術(shù)創(chuàng)傷更有可能協(xié)同誘發(fā)POCD[8]。然而,關(guān)于提高PPARγ是否對(duì)丙泊酚麻醉手術(shù)后患者的認(rèn)知功能障礙有保護(hù)作用,目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究采用丙泊酚麻醉誘導(dǎo)實(shí)施剖腹探查手術(shù)后的斯普拉格-道利(Sprague-Dawley,SD)大鼠,觀察PPARγ水平對(duì)大鼠海馬區(qū)Aβ的沉積和過度磷酸化Tau蛋白的影響,以及PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮和PPARγ抑制劑GW9662對(duì)術(shù)后神經(jīng)功能的作用,為臨床患者預(yù)防POCD提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來源 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)別健康雄性SD大鼠80只,18月齡,體質(zhì)量(450±50)g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司[SYXK(黔)2018-0001],于溫度(23±1)℃、濕度(50±10)%的房間內(nèi)正常飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

1.1.2主要藥品 鹽酸吡格列酮片(北京太洋藥業(yè)股份有限公司),GW9662(上海芮暉化工科技有限公司),丙泊酚中長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液(奧地利Fresenius Kabi),生理鹽水(貴州科倫藥業(yè)有限公司),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;德國(guó)Amresco),鹽酸利多卡因注射液(上海浦林州制藥有限公司),復(fù)方利多卡因乳膏(同方藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.1.3主要試劑及儀器 Aβ和P-Tau蛋白酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒(武漢賽培生物),PPARγ Western blot檢測(cè)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物),蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)試劑盒(博士德生物),4%水合氯醛和4%多聚甲醛(碧云天生物),75%酒精及碘伏(貴州鑫源生物)等;高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀),酶標(biāo)儀(上海塞默生),Morriz水迷宮裝置(上海吉良)。

1.2 研究方法

1.2.1分組及給藥 80只SD大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照(C)組、吡格列酮(P)組、GW9662(G)組及生理鹽水(N)組,連續(xù)處理5 d,各組給藥方式如下：C組大鼠生理鹽水10 mL/kg腹腔注射;P組大鼠吡格列酮溶解于生理鹽水后,10 mg/kg腹腔注射;G組大鼠GW9662抑制劑100 mg溶解于DMSO 100 mL中,2 mg/kg腹腔注射;N組大鼠生理鹽水10 mL/kg腹腔注射。

1.2.2丙泊酚麻醉手術(shù) 各組大鼠按“1.2.1”項(xiàng)下藥物處理后第6天,P組、G組、N組SD大鼠常規(guī)注射藥物后30 min,予丙泊酚75 mg/kg腹腔注射,待各組大鼠翻正反射消失后行剖腹探查術(shù),麻醉時(shí)間2～3 h,每40 min追加丙泊酚100 mg/kg維持麻醉;期間觀察各組大鼠呼吸、皮膚黏膜的顏色,切皮前以1%鹽酸利多卡因注射液局部注射浸潤(rùn)切口,術(shù)后以利多卡因乳膏涂抹大鼠傷口鎮(zhèn)痛,無菌紗布覆蓋傷口。C組不進(jìn)行麻醉和手術(shù)處理。

1.2.3ELISA檢測(cè)海馬區(qū)腦組織Aβ和P-Tau表達(dá) 取“1.2.1”項(xiàng)下術(shù)后24 h的各組大鼠8只,予4%水合氯醛腹腔注射,斷頭取海馬區(qū)腦組織,加適量生理鹽水搗碎,組織勻漿3 000 r/min離心10 min,取上清;設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL,再加樣本稀釋液40 μL;空白孔不加;除空白孔外,檢測(cè)Aβ的標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL,檢測(cè)P-Tau的標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL,封板膜封住反應(yīng)孔,37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min;棄液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙拍干,反復(fù)洗板5次;Aβ檢測(cè)孔中加入底物四甲替聯(lián)苯胺50 μL、P-Tau檢測(cè)孔中加入底物4-硝基酚磷酸鹽50 μL,37 ℃避光孵育15 min;每孔加終止液50 μL,于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定Aβ檢測(cè)孔的光密度(optical density,OD)值,于400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定P-Tau檢測(cè)孔的OD值。

1.2.4Western blot方法檢測(cè)海馬區(qū)腦組織PPARγ水平 取“1.2.3”項(xiàng)下的各組大鼠適量海馬組織均漿,預(yù)冷放射免疫沉淀測(cè)定蛋白抽提試劑(radio-immunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA),加蛋白酶抑制劑Protease inhibitor cocktail (roche體積比50∶1);5%牛血清蛋白緩沖液(bovine serum albumin-tris aminomethane hydrochloridel,BSA-TBST;NaCl,tween20)稀釋一抗(稀釋比例1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜;次日,洗膜;TBST洗3次,10 min/次;5%BSA-TBST稀釋二抗,山羊抗兔,山羊抗鼠IgG(H+L)HRP 1∶10 000,室溫孵育 40 min;TBST洗膜3次,10 min/次;化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence,ECL)滴加到膜的蛋白面,反應(yīng)3 min;膠片曝光10 s～5 min(曝光時(shí)間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整),顯影2 min,定影;使用Gel Image ststem ver.4.00軟件對(duì)圖像提供灰度分析。

1.2.5HE染色觀察大鼠海馬體細(xì)胞形態(tài) 取“1.2.1”項(xiàng)下術(shù)后第5天的各組大鼠2只,予以4%水合氯醛腹腔注射,斷頭取腦,取完整海馬區(qū),制備海馬體標(biāo)本石蠟切片,HE染色,觀察各組海馬細(xì)胞變化情況[10]。

1.2.6術(shù)后認(rèn)知功能評(píng)價(jià) 取“1.2.1”項(xiàng)下術(shù)后第7天的各組大鼠10只,采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(分為定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn))測(cè)試術(shù)后認(rèn)知功能情況。麻醉手術(shù)結(jié)束后,各組大鼠休息7 d后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),連續(xù)5 d,第1～4天為定位巡航實(shí)驗(yàn),第5天為空間探索實(shí)驗(yàn);定位巡航實(shí)驗(yàn)中逃逸潛伏期時(shí)間越長(zhǎng)代表空間學(xué)習(xí)記憶能力越弱,時(shí)間越短代表空間學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng);第5天空間探索實(shí)驗(yàn)中,大鼠穿越目標(biāo)平臺(tái)次數(shù)越多、目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)表示空間學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海馬區(qū)Aβ、P-Tau及PPARγ的表達(dá)

與C組比較,N組大鼠海馬區(qū)Aβ、P-Tau表達(dá)水平增加(P<0.05);與N組比較,P組大鼠海馬區(qū)Aβ、P-Tau表達(dá)水平減少(P<0.05),G組大鼠海馬區(qū)Aβ沉積、P-Tau表達(dá)水平增加(P<0.05);與N組比較,P組大鼠海馬區(qū)PPARγ表達(dá)增加(P<0.05),G組大鼠海馬區(qū)PPARγ表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)PPARγ蛋白的電泳Fig.1 PPARγ protein electrophoresis in hippocampus of each group

表1 各組大鼠海馬區(qū)Aβ、P-Tau及PPARγ的表達(dá)Tab.1 Expressions of Aβ, P-Tau, and PPARγ in

2.2 認(rèn)知功能評(píng)價(jià)

與C組比較,N組大鼠逃逸潛伏期延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)減少、目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間較短(P<0.05);與N組比較,P組大鼠逃逸潛伏期縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)較多、目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)(P<0.05),G組大鼠逃逸潛伏期延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)減少、目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間較短(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The result of Morris maze test of each

2.3 海馬區(qū)HE染色

HE染色觀察各組大鼠海馬體細(xì)胞損傷情況,與G組和N組相比,C組和P組大鼠海馬體細(xì)胞相對(duì)排列緊密,膜清晰,而G組與N組的大鼠海馬體細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核核固縮。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬體的病理組織特點(diǎn)(HE,×400)Fig.2 Pathological characteristics of hippocampus of each group(HE,×400)

3 討論

有研究表明,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,吸入麻醉后實(shí)施剖腹探查手術(shù)會(huì)引起SD大鼠的認(rèn)知功能障礙[11]。七氟烷使大鼠海馬區(qū)Aβ和P-Tau蛋白沉積增加,而提高PPARγ水平減輕Aβ和P-Tau對(duì)神經(jīng)的損傷[7]。本研究使用臨床上常用于老年麻醉的靜脈麻醉藥物丙泊酚來實(shí)施麻醉[12]。丙泊酚是一種常用于臨床的鎮(zhèn)靜催眠藥物,通過激活γ-氨基丁酸A受體(γ-aminobutyric acid A,GABAA)維持麻醉[13]。Zhou等[14]研究顯示,丙泊酚可通過對(duì)N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)-絡(luò)氨酸蛋白激酶B(tyrosine related receptor kinase B,TrkB)-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)信號(hào)通路的相互作用損害大鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力,并誘導(dǎo)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。也有研究顯示[15],丙泊酚可能對(duì)支持記憶功能的神經(jīng)基質(zhì)產(chǎn)生了短暫的“藥理損害”,它干擾了人類海馬體對(duì)陳述性記憶(即指人對(duì)事實(shí)性資料的記憶)的完整性。丙泊酚麻醉也可能會(huì)使細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加[16]。近年來研究表明,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,丙泊酚麻醉后實(shí)施手術(shù)更易使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)認(rèn)知功能的改變和海馬體的病理性病變[17]。接受手術(shù)與麻醉的N組大鼠認(rèn)知功能較C組減弱,N組、P組和G組之間比較發(fā)現(xiàn),吡格列酮干預(yù)后的P組大鼠其認(rèn)知功能得到明顯改善,G組大鼠認(rèn)知功能損害最嚴(yán)重;由此說明,上調(diào)PPARγ水平有助于減輕麻醉和手術(shù)引起的認(rèn)知功能障礙程度。

Aβ在海馬體中沉積導(dǎo)致POCD,麻醉和手術(shù)會(huì)使Aβ在腦組織中的聚集增加[18]。Aβ在淀粉樣變途徑中是由β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,BACE1)催化生成的[19]。Aβ在腦組織中能干擾突觸與神經(jīng)元之間的通信,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20-21];Wang等[22]研究顯示,減少海馬體中的Aβ生成和抑制神經(jīng)元凋亡有助于降低老年大鼠發(fā)生POCD的概率,起到神經(jīng)保護(hù)作用;有研究表明,PPARγ可通過抑制Aβ生成途徑的關(guān)鍵酶BACE1的活性來減少Aβ的生成。本研究結(jié)果表明,與P組比較,N組和G組大鼠海馬中Aβ的表達(dá)較高,又以G組最高;PPARγ表達(dá)水平在P組中最高,G組中最低。Katsouri等[23]將過氧化物酶增殖物激活受體γ共激活因子1α(PPARγ-coactivator-1α,PCG-1α)的基因轉(zhuǎn)移到小鼠的大腦皮質(zhì)層和海馬中,觀察4個(gè)月后發(fā)現(xiàn)小鼠的空間記憶能力提高,Aβ沉積顯著減少;通過上調(diào)PPARγ水平而減少Aβ沉積的機(jī)制是由于在BACE1基因的啟動(dòng)子中有過氧化物酶體應(yīng)答原件(peroxisome proliferator-response element,PPRE),PPARγ與PCG-1α可通過與PPRE結(jié)合,阻斷BACE1的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而抑制了BACE1的活性,減少Aβ的生成[24]。也有學(xué)者研究顯示,PPARγ還可通過提高胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)的活性促進(jìn)Aβ的降解[3];PPARγ在受到配體激活后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中,通過與IDE基因啟動(dòng)子區(qū)的響應(yīng)元件結(jié)合,從而激活I(lǐng)DE基因的轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)Aβ降解,減少Aβ沉積[25]。

除此之外,本研究還檢測(cè)P-Tau。在AD小鼠大腦中,Tau蛋白被過度磷酸化并形成纖維,在軸突與樹突之間表現(xiàn)為神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)[26]。P-Tau沉積形成成對(duì)的螺旋絲,以NFTs的形式沉積,損害神經(jīng)元細(xì)胞[27]。在本研究中N組SD大鼠海馬體中P-Tau濃度比C組高,有研究發(fā)現(xiàn)自噬功能障礙,會(huì)延遲Tau聚集物的清除和降解,使Tau蛋白磷酸化[28]。由此推斷手術(shù)與麻醉可能是導(dǎo)致海馬體中P-Tau聚集的危險(xiǎn)因素。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在Tau蛋白磷酸化中有著重要作用[29]。GSK-3β可通過磷脂酰脂醇3-肌酶(phosphatidylinositol 3- kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog,Akt)信號(hào)通路被激活,GSK-3β是Tau蛋白在絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)上磷酸化的中介[28]。在Tau蛋白磷酸化損傷神經(jīng)細(xì)胞的過程中,有學(xué)者認(rèn)為可能是通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase5,CdK5)激活Tau/GSK-3β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[30]。而PPARγ激動(dòng)劑是GSK-3β的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,提高PPARγ水平可抑制GSK-3β的活性,從而減少Tau蛋白的磷酸化。從N組、P組及G組大鼠的組間比較顯示,使用PPARγ激動(dòng)劑的P組大鼠海馬中P-Tau較其他2組減少,使用PPARγ抑制劑的G組大鼠海馬中P-Tau蛋白最多。提高PPARγ水平可減少海馬中Tau蛋白的磷酸化。

綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)由丙泊酚麻醉誘導(dǎo)實(shí)施剖腹探查手術(shù)后的SD大鼠,其大腦海馬區(qū)的Aβ和過度磷酸化的Tau蛋白沉積增加,引起海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的退行性變和死亡,導(dǎo)致其認(rèn)知功能損害。本研究分別對(duì)大鼠腹腔注射PPARγ激動(dòng)劑和PPARγ抑制劑后,發(fā)現(xiàn)上調(diào)PPARγ水平減少了Aβ和P-Tau在大鼠海馬區(qū)的沉積,減輕了由丙泊酚麻醉手術(shù)后帶來的神經(jīng)損傷,可降低POCD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),為臨床POCD的預(yù)防提供一個(gè)新的方向和理論依據(jù),但對(duì)于徹底闡述清楚丙泊酚麻醉與手術(shù)所帶來的認(rèn)知功能障礙的機(jī)制仍然需進(jìn)一步探索;由于大多數(shù)研究結(jié)果都是從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得出的,還需在臨床上進(jìn)一步探索研究。