體外沖擊波療法對膝關節骨性關節炎大鼠滑膜和軟骨組織炎癥因子的影響及機制*

楊興月, 黃圓月, 安松松, 毛冬梅, 黃媛馨, 楊俊龍, 于子龍, 秦樂, 王林, 沃春新***

(1.貴州醫科大學 麻醉學院, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學附屬醫院 疼痛科, 貴州 貴陽 550004)

膝關節骨關節炎 (knee osteoarthritis, KOA),也稱為慢性退行性關節炎,是一種常見的關節疾病,會導致嚴重的關節功能障礙[1]。KOA患者的主要癥狀包括疼痛、膝關節活動受限,晚期還會導致關節畸形,甚至關節出現嚴重的內翻、外翻畸形或屈曲攣縮畸形,降低患者的生活質量[2]。有數據顯示,全球患KOA人數已達2.5 億[3]。研究表明,促炎細胞因子作為KOA的生化標志物,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及IL-6等在患者膝關節內明顯升高[4];膝關節疼痛是KOA患者的主要癥狀,非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)和阿片類藥物可以緩解此疼痛癥狀,但NSAIDs易導致消化道潰瘍、出血和血小板下降、肝毒性等副作用,阿片類藥物則易產生藥物成癮、認知障礙、譫妄、跌倒和骨折等風險[5-6]。KOA 疼痛的發生機制較為復雜,可能與炎性疼痛(外周敏化)和中樞神經系統內神經的敏感性改變(中樞痛覺敏化)有關[7];滑膜炎通過炎癥介質引起疼痛,膝關節疼痛與 KOA患者滑膜炎的程度之間存在關聯[8];MIA誘導的KOA大鼠膝關節軟骨分解,軟骨下骨暴露并且損傷,支配軟骨下骨的神經活動和敏感性發生變化,會導致晚期骨關節炎的疼痛[9];軟骨降解產物可以促進炎癥因子和化學物質的釋放,這些物質通過直接刺激傷害感受器、降低其疼痛閾值引發疼痛,炎性介質也可刺激暴露的軟骨下骨內的神經而產生疼痛[10]。目前許多治療方法對KOA患者疼痛癥狀均未達到滿意的治療效果,減輕KOA患者痛覺敏化、防止KOA患者疼痛癥狀從急性疼痛向慢性持續性疼痛的轉變將是緩解KOA患者疼痛的一種潛在有效的、新穎的方法;減輕KOA患者的滑膜與軟骨組織的炎癥可能會延緩痛覺敏化,從而減輕KOA患者疼痛癥狀。許多臨床研究表明,體外沖擊波療法(extracorporeal shockwave therapy,ESWT)可以減輕KOA患者疼痛癥狀,改善膝關節功能[11-12],但其機制尚不清楚。因此,本研究欲探討ESWT對 KOA大鼠滑膜及軟骨組織炎癥因子的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠30只,體質量300 g,購自北京華阜康科技股份有限公司[許可證號SCXK(京)2019-0008],飼養于室溫(23±1)℃的房間,12 h/12 h明暗循環,自由進食進水;適應飼養2周后進行實驗。

1.1.2主要試劑和儀器 碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate,MIA;貴陽超研遠誠生物科技有限公司),多聚甲醛溶液(貴州偉博鑫生物科技有限公司),兔多克隆抗體 Anti-IL-1β抗體、兔多克隆抗體 Anti-TNF-α抗體、兔多克隆抗體 Anti-IL-6抗體(Affinity生物技術有限公司),免疫組織化學二抗辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白 G(immunoglobulin G,IgG ;武漢塞維爾生物科技有限公司);病理切片機(上海徠卡儀器有限公司),脫水機(意大利迪佩斯公司),PL-200熱刺痛儀(成都泰盟軟件有限公司),Von Frey纖維絲、電子測痛儀足底刺痛儀(ZS-PM,上海玉妍科學儀器有限公司),包埋機(武漢俊杰電子有限公司),其余試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1造模及實驗分組 大鼠隨機均分為對照組(n=10)、模型組(n=10)及沖擊波組(n=10),均予10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,于右側膝關節處剃毛器備皮、碘伏消毒;對照組大鼠右側膝關節腔注射0.9%生理鹽水50 μL,模型組和沖擊波組大鼠右側膝關節腔注射2 mg/50 μL MIA構建KOA大鼠模型;造模后第14天,沖擊波組大鼠內側軟骨下骨區域涂適量耦合劑后行體外沖擊波治療(1.0 bar,6 Hz,800 次;治療探頭為15 mm發散式;1次/周、共4次),對照組與模型組大鼠不予沖擊波干預,僅予沖擊波聲音刺激。

1.2.2右后爪熱縮爪潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)檢測 各組大鼠于術前 (baseline, BL)和術后第3、7、14、21、28、35及42天測量PWTL。各組大鼠置于PL-200熱刺痛儀的實驗反應箱,待其適應安靜后,記錄大鼠右后爪從開始加熱到抬起或舔后爪的間隔時間,測量時間不超過20 s;每只大鼠測量3次,間隔時間>15 min/次,取平均值做為PWTL。

1.2.3右后爪足底機械刺激縮足閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)檢測 各組大鼠于BL和術后第3 、7、14、21、28、35及42天測量MWT。采用足底刺痛儀(ZS-PM)測量MWT,將各組大鼠放置于底部為網格的有機玻璃箱內適應20 min,四肢不頻繁活動后開始測定。觀察者未知測試時大鼠的分組。用標準化的纖維絲馮弗雷刺激大鼠右后爪中部足底,從2 g開始,纖維絲彎曲至“C”或“S”型并維持4～8 s,觀察各組大鼠縮足反應并記錄,陰性反應則給予大一級力度纖維絲進行刺激,陽性反應則給予小一級力度纖維絲進行刺激,出現陰性到陽性或陽性到陰性變化時的最小陽性纖維絲力度為MWT,以g為單位。

1.2.4右膝關節X線檢查 各組大鼠于術后第42天給予10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥位于檢查臺,調整大鼠右側膝關節置于檢查臺中央十字線中點處,行X線檢查。

1.2.5免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)檢測右側膝關節滑膜組織IL-1β、IL-6及TNF-α 表達 取“1.2.4”X線檢查后各組大鼠,予2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,開胸經心臟灌注4% 多聚甲醛,取右側膝關節置于4%多聚甲醛固定24 h,置于20%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)脫鈣液(25～30 ℃)中脫鈣,每2天觀察1次;至針可扎動骨頭時(約1個月)取出,脫水,石蠟包埋、切片,滴加pH為8.0的EDTA抗原修復液至完全覆蓋組織,37 ℃烤箱孵育30 min,自然冷卻,玻片置于pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)中于脫色搖床上晃動,洗滌3次、5 min/次;切片放入3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min,洗滌,加3%牛血清白蛋封閉30 min,分別加兔抗鼠抗體IL-1β、IL-6及TNF-α的一抗抗體,濕盒內4 ℃孵育過夜;加入HRP標記的山羊抗兔二抗IgG,室溫孵育50 min;洗滌,滴加新鮮配制二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色液,蘇木素復染3 min、水洗,沖洗,蘇木素返藍液返藍,沖洗,切片依次放入梯度酒精、二甲苯Ⅰ中脫水透明,取出晾干,封片,置于白光顯微鏡下進行觀察滑膜組織,使用Image J軟件(美國National Institutes of Health 公司)分析免疫組織化學平均光密度(mean optical density,MOD)值。

1.2.6免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)檢測右側膝關節軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α 表達 取“1.2.4”X線檢查后各組大鼠,予2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,經4%多聚甲醛心臟灌注后,取右側膝關節置于4%多聚甲醛固定24 h,于20% EDTA脫鈣液中脫鈣,脫鈣完成后取出脫水,石蠟包埋、切片后,滴加pH為8.0的EDTA抗原修復液修復30 min,洗滌后切片放入3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min,洗滌,加3%牛血清白蛋封閉30 min,分別加兔抗鼠抗體IL-1β、IL-6及TNF-α的一抗抗體,濕盒內4 ℃孵育過夜;加入HRP標記的山羊抗兔二抗IgG,室溫孵育50 min;洗滌后滴加DAB顯色液,蘇木素復染3 min,水洗后蘇木素返藍液返藍,沖洗,切片依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、正丁醇5 min、二甲苯Ⅰ5 min 中脫水透明,取出晾干,封片,置于白光顯微鏡下進行觀察軟骨組織,使用Image J軟件分析免疫組織化學MOD值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PWTL

術后第3、7、14、21、28、35及42天,模型組與沖擊波組大鼠PWTL較對照組時間縮短,差異有統計學意義(P<0.05);術后第21天,沖擊波組大鼠PWTL時間較模型組延長,差異無統計學意義(P>0.05),但術后第28～42天時2組比較、差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠術后各時點Tab.1 PWTL in three groups at each time

2.2 MWT

術后第3～42天,模型組與沖擊波組大鼠MWT均較對照組降低(P<0.05);術后第21～42天,沖擊波組大鼠與模型組相比MWT值升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠術后各時點Tab.2 MWT in three groups at each time

2.3 右膝關節X線特征

對照組大鼠右膝關節的關節間隙均勻,膝關節對線良好,關節面平整光滑,關節邊緣整齊規則、無骨贅,關節內無游離體;模型組大鼠右膝關節的關節間隙明顯狹窄,膝關節對線不齊,關節面粗糙變形,關節邊緣有骨贅形成;沖擊波組大鼠右膝關節的關節間隙狹窄較模型組改善,膝關節對線不齊且較模型組輕,關節面粗糙變形且較模型組改善,關節邊緣骨贅形成且較模型組減少。見圖1。

圖1 各組大鼠右膝關節的X線檢查結果Fig.1 X-ray examination results of right knee joint of rats in each group

2.4 滑膜組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達

與對照組比較,模型組、沖擊波組大鼠膝關節滑膜組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達增加(P<0.05);與模型組比較,沖擊波組大鼠膝關節滑膜組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達減少(P<0.05)。見圖2。

2.5 軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達

與對照組比較,模型組與沖擊波組大鼠膝關節軟骨組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,沖擊波組大鼠膝關節軟骨組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A、B分別為軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的染色結果和定量結果;(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

3 討論

KOA是一種高發病率的慢性進行性疾病,可嚴重影響患者的生活質量,其中疼痛是最常見癥狀,易發展為慢性疼痛[13]。KOA病理改變主要包括軟骨退化、軟骨下骨硬化、骨贅形成、滑膜炎癥及韌帶鈣化[14],其中滑膜炎癥是其病理變化的重要特征[15]。林璐璐等[16]認為KOA疼痛的原因包括外周和中樞敏化,炎癥反應是KOA患者膝關節疼痛的驅動因素,巨噬細胞、肥大細胞、炎癥介質等均參與了KOA疼痛致敏的發生,導致了外周傷害感受器和脊髓神經元的敏化。 痛覺敏化在慢性疼痛中扮演著至關重要的角色,如在KOA的病理過程中,關節內的結構、生物力學、細胞及生化均會發現變化,易引起傷害性輸入的增加,從而導致痛覺敏化[17];臨床上KOA患者約20%可出現痛覺敏化現象,與單側或雙側受累無關[18-19]。Neogi等[20]研究表明,滑膜炎癥與KOA疼痛致敏有關,早期靶向炎癥是預防KOA致敏的治療方法,可減輕疼痛嚴重程度;也有研究顯示,滑膜炎癥與膝關節疼痛有關,滑膜炎是膝關節炎抗炎療法的候選治療靶點,可發揮鎮痛作用[21]。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠隨著造模時間的延長,PWTL時間逐漸縮短,MWT閾值逐漸降低,表明KOA大鼠在形成慢性疼痛的過程中出現了痛覺敏化,ESWT可延長降低KOA大鼠的PWTL,升高其MWT,從而改善其痛覺過敏。

KOA炎癥產生的IL-1β、IL-6及TNF-α不僅是關節炎癥和進一步變性的介質,還可激活傷害感受器,誘導或促進炎癥性疼痛以及神經性疼痛,從而導致痛覺敏化[22]。有研究顯示,KOA患者滑液、滑膜及軟骨的IL-1β、IL-6及TNF-α水平升高[23],提示IL-1β、IL-6及TNF-α是KOA炎癥產生的主要促炎細胞因子。IL-1β可刺激IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的釋放[24];IL-1β、IL-6及TNF-α可直接作用于關節傷害性感受器導致疼痛癥狀,也可影響沿神經軸的多個點的疼痛反應,增加感覺神經的興奮性導致慢性疼痛[25]。本研究結果顯示,ESWT可降低KOA大鼠膝關節滑膜和軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子水平。

ESWT是一種將機械性脈沖聲波轉換為彈道式沖擊波,進而作用于人體局部組織的物理療法,是肌肉骨骼系統疾病的許多病理改變的安全有效的治療方法,已用于許多肌肉骨骼疾病,具有無創、安全及有效等特點[26]。沖擊波可以產生間質和細胞外反應,如緩解疼痛、血管形成、蛋白質生物合成、細胞增殖、神經和軟骨保護以及破壞肌肉骨骼結構中的鈣沉積[27];沖擊波具有組織損傷修復重建、組織粘連松解、擴張血管和血管再生作用、鎮痛及神經末梢封閉作用、高密度組織裂解、炎癥及感染控制等生物作用[28]。Abe等[29]研究顯示,低能量ESWT在急性心肌梗死大鼠模型中除血管生成作用外,還有抗炎作用;多數臨床研究亦表明,ESWT對KOA患者具有治療作用[30-32]。本研究結果顯示,ESWT可降低KOA大鼠膝關節滑膜和軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達。

綜上所述,ESWT可降低KOA大鼠膝關節滑膜和軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達,從而改善KOA炎癥;還可緩解KOA大鼠痛覺敏化癥狀,其機制可能與沖擊波改善局部炎癥因子的分泌、減少炎癥反應有關。因此,本研究表明了ESWT對KOA具有治療作用,從而有助于推動ESWT用于KOA的臨床治療。