14種喀斯特地區植物藥提取物的體外抗氧化活性比較*

鄒健, 鄧婕, 王道平, 吳昌學, 曾曉曉, 向潔, 冉龍艷, 肖霄,喻彥龍, 官志忠, ***

(1.貴州醫科大學 病理學教研室,貴州 貴陽,550004;2. 貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室,貴州 貴陽,550004;3.貴州省醫學分子生物學重點實驗室,貴州 貴陽,550004;4.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室,貴州 貴陽,550014)

喀斯特地區植物藥基于獨特的地理環境、氣候因素和土壤因素等,通過單一或相互作用影響著藥用植物的品質和療效,具有鮮明的地域性和民族特性[1];其含有的生物堿、黃酮類、皂苷、揮發油等有其獨特的藥理作用,對某些疾病的治療具有顯著優勢[2-3],在抗氧化、抗炎、改善微血管內皮炎癥損傷、抗白血病等方面有重要作用[4-5],其活性成分在抗氧化方面具有療效好、副作用少的優點。氧化應激與慢性氟中毒[6]、糖尿病[7]、高血壓[8]及肝纖維化[9]等疾病的發病機制密切相關,故抗氧化成為了治療的重要手段。但目前對藥物的抗氧化能力的評價沒有科學、有效的手段。以往的研究中,往往用單一抗氧化指標來評價藥用植物的抗氧化能力[10],或者雖然多種抗氧化指標評價,但沒有將各抗氧化指標聯系起來[11],這樣往往無法準確反映藥物的實際抗氧化能力。為解決這一情況,本研究選用了14種喀斯特地區具有經濟和生態保護價值、且推廣應用度較高的優勢植物藥品種。構建了體外抗氧化測定體系[12-15],分別檢測這些植物藥提取物的抗氧化能力,并且引入模糊數學中的隸屬函數分析法[16-17]的概念對植物藥和維生素C進行抗氧化能力的綜合評價并排序,篩選出具有抗氧化價值的藥物,為后續的體內藥物干預提供理論支持及指導作用,同時促進喀斯特地區特色藥用資源的開發利用,也為氧化應激相關疾病的藥物開發提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1植物藥提取物來源 選用14種植物藥(表1),仙桃草、錦茵陳、瓜子金、涼粉柴、響鈴草的供試部位為地上全株,吳茱萸、皂角、薏苡仁、菟絲子的供試部位為成熟果實,一朵云的供試部位為全株,玉竹、鎖陽、天冬、黃精的供試部位為塊莖,通過75%乙醇提取分別獲得這些藥物的提取物(由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室提供)。以上植物藥有效成分提取方法：藥材陰干,粉碎成大小約1 mm的粗粉,稱取約5 g,每次加10倍量75%乙醇溶液回流提取1.5 h,過濾待用。重復3次,合并提取液,減壓濃縮,蒸干乙醇,真空干燥得供試品。

表1 喀斯特地區植物藥的中、英文及拉丁文藥名Tab.1 Chinese, English, and Latin names of phytomedicines in Karst areas

1.1.2主要試劑和儀器 羥自由基清除能力檢測試劑盒(Micro Hydroxyl Free Radical Scavenging Capacity Assay Kit,貨號BCBC1325,中國SOLARBIO公司)、維生素C(ascorbic acid,貨號A8100,中國SOLARBIO公司)、大豆卵磷脂(L-α-Lecithin,貨號L8050,中國SOLARBIO公司)、2,2-聯苯基-1-苦基肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,貨號D807279-100 mg,中國MACKLIN公司)、鐵氰化鉀[potassium hexacyanoferrate(3-) ,貨號13746-66-2,中國天津致遠化學試劑有限公司],上述化學試劑均為分析純。所使用的主要儀器有Varioskan LUX多功能微孔讀數儀(Thermo Fisher公司,美國)、VCX750超聲破碎儀(Sonics公司,美國)、Exceed-AC-08型超純水儀(艾科公司,中國)、5424R型制冷微量高速離心機(Eppendorf公司,德國)。

1.2 研究方法

1.2.1喀斯特地區植物藥提取物的制備 取適量的14種植物藥提取物,分別加入去離子水制備成10 g/L的藥物混合液。將植物藥混合液經超聲充分混勻后,使用無菌針頭過濾器過濾,將得到的濾過液加入去離子水分別稀釋成不同濃度(0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L)[18-19]備用。

1.2.2清除羥自由基能力的測定 羥自由基可以使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質、核酸等物質發生氧化,遭受氧化性損傷和破壞,羥自由基清除能力是樣本抗氧化能力的重要指標之一。將實驗分為空白組、陽性對照組(維生素C)及實驗組,其中實驗組藥物濃度分別為0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L,實驗過程遵照羥自由基清除能力檢測試劑盒說明書操作。樣品混勻后37 ℃孵育60 min,10 000 r/min常溫離心10 min,取200 μL上清液于96 孔板中536 nm處測定其吸光度。空白管、對照管和測定管的吸光值分別記為A空、A對及A實。羥自由基清除率D(%)=(A實-A對)/(A空-A對)×100%。每組試驗重復3次,取平均值并求標準差[12]。

1.2.3清除2,2-聯苯基-1-苦基肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力測定 稱取4 mg DPPH,用無水乙醇100 mL配制成0.04 g/L的DPPH乙醇溶液。實驗分為空白組、陽性對照組(維生素C)及實驗組,其中實驗組濃度分別為0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L的待測藥物溶液500 μL,再加入DPPH 500 μL,充分混勻,室溫反應30 min后,取200 μL混合液于96 孔板內測其在517 nm處的吸光度。實驗組和陽性對照組的吸光值分別記為Ao和As(無水乙醇代替待測液)。DPPH自由基清除率=(Ao-As)/Ao×100%。每組試驗重復3次,取平均值并求標準差[13]。

1.2.4鐵氰化鉀還原能力測定 以維生素C為陽性對照,分別取0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L的待測藥物溶液200 μL于試管中,隨后加入PBS 500 μL,以保證溶液反應的PH環境。再加入質量分數為10%的鐵氰化鉀溶液500 μL,搖勻后于50 ℃水浴中反應20 min。冰水中快速冷卻后,加入質量分數為10%三氯乙酸500 μL,反應完全后,4 000 r/min常溫離心10 min。取上清液500 μL,依次加入去離子水500 μL和0.1%三氯化鐵(FeCl3)溶液100 μL,充分混勻后靜置10 min,取200 μL混合液于96孔板于700 nm處測定吸光值。每組試驗重復3次,取平均值并求標準差[14]。藥物中的抗氧化活性成分能使Fe3+還原成Fe2+,Fe2+進一步和FeCl3反應生成在700 nm處有最大吸收的藍色沉淀,通過測定吸光度值可間接評價抗氧化劑的還原能力。所測藥物的還原能力越強,測得的吸光度值越大。

1.2.5抑制脂質過氧化能力測定 稱取30 mg大豆卵磷脂(LLS)溶于30 mL pH7.4的10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,經超聲充分混勻后,冰水浴保存備用。將三氟乙酸(TFA)15 g、硫代巴比妥酸(TBA)0.375 g和濃鹽酸2.1 mL依次溶于100 mL去離子水,配制得TFA-TBA-HCl混合液。依次向試管中加入LLS溶液200 μL, 0.4 mol/L硫酸亞鐵200 μL和濃度分別為0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L的待測藥物溶液200 μL,混勻后37 ℃水浴避光反應60 min。隨后加入TFA-TBA-HCl混合液400 μL,于90～100 ℃水中反應15 min,冰水浴中迅速冷卻,終止反應。將混合液4 000 r/min離心10 min,取上清液200 μL于96孔板在532 nm處測定吸光值。每組試驗重復3次,取平均值并求標準差[14]。大豆卵磷脂可通過一系列反應后能生成粉紅色染料,抗氧化物與脂質過氧自由基反應從而抑制脂質過氧化的過程,表現為染料減少,吸光度值降低。即物質的抗氧化能力越強,測得的吸光度值越小。

1.3 統計學方法

采用Excel 2010和GraPhpad Prism 8軟件進行數據的統計分析,再利用隸屬函數法對14種喀斯特植物藥進行體外抗氧化能力的綜合評價及篩選。隸屬函數值計算公式：R (Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。式子中Xi為某藥物的某一指標的測定值,Xmax為所有品種該指標測定值中的最大值,Xmin為所有藥物該指標測量值中的最小值,若某一指標與藥物濃度呈負相關,則可通過反隸屬函數公式計算其抗氧化能力的隸屬函數值。

2 結果

2.1 喀斯特地區植物藥清除羥自由基能力測定

對14種喀斯特地區植物藥進行清除羥自由基能力進行檢測,其中有統計意義的結果如圖1所示,在0～10 g/L藥物濃度,錦茵陳、天冬、涼粉柴及瓜子金的藥物濃度與羥自由基清除率之間存在量效關系,除仙桃草和瓜子金外其余樣品都隨著濃度的增大,清除率逐漸增大。仙桃草和瓜子金在0.05 g/L時已達最大清除率,提示低濃度的仙桃草和瓜子金有較強的抗氧化能力,且能預測半抑制濃度(IC50)值小于涼粉柴,但瓜子金的羥自由基清除率隨著濃度增加而下降。以上藥物表現出了較強的羥自由基清除能力,且優于陽性對照組,其余藥物羥自由基清除率較低且弱于對照組。多種受測植物藥對羥自由基的清除能力強弱順序為仙桃草、瓜子金>涼粉柴>天冬>錦茵陳>維生素C>其余藥物(除仙桃草、瓜子金及其他藥物外,IC50依次為0.298、2.248、2.741、7.232 g/L)。

圖1 14種喀斯特地區植物藥、維生素C對羥自由基的清除率Fig.1 Hydroxyl radical scavenging rates of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.2 喀斯特地區植物藥清除DPPH自由基

對14種喀斯特地區植物藥進行清除DPPH自由基能力檢測,其中有統計意義的結果如圖2所示,所測藥物均表現出DPPH自由基清除活性,隨著濃度的增加,清除能力增強。在0～10 g/L藥物濃度范圍內,DPPH自由基清除能力稍遜或與對照組相當。多種受測植物藥對DPPH自由基的清除能力強弱順序為維生素C>鎖陽>吳茱萸>響鈴草>皂角>薏苡仁>仙桃草>其余藥物(除其他藥物外,IC50依次為0.222、0.224、0.226、0.687、0.919、1.183、1.999 g/L)。

圖2 14種喀斯特地區植物藥、維生素C對DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rates of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.3 喀斯特地區植物藥的還原能力

對14種喀斯特地區植物藥進行還原能力檢測,其中有統計意義的結果如圖3所示,所測藥物均具有一定的還原能力,在0～10 g/L藥物濃度范圍內,與羥自由基清除率之間存在量效關系。隨著藥物濃度的增加其在700 nm處的吸光度也逐漸增加,即還原能力增強。吳茱萸、仙桃草、鎖陽、錦茵陳及菟絲子的還原能力比陽性對照組強,響鈴草和皂角的還原能力與陽性對照組相近,其余植物藥的還原能力弱于陽性對照組。

圖3 14種喀斯特地區植物藥、維生素C的還原能力Fig.3 Reducing ability of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.4 喀斯特地區植物藥抑制脂質過氧化的能力

14種喀斯特地區植物藥進行抑制脂質過氧化能力檢測,其中有統計意義的結果如圖4所示,在0～10 g/L藥物濃度范圍內,所測藥物均具有一定的抑制脂質過氧化的能力且優于陽性對照組。存在一定的量效關系,隨著藥物濃度的增加其抑制脂質過氧化的能力越強。多種受測植物藥抑制脂質過氧化能力強弱順序為涼粉柴>仙桃草>響鈴草>吳茱萸>菟絲子>玉竹>瓜子金>天冬>維生系C>其他藥物(除其他藥物外,IC50依次為0.122、0.250、0.256、0.471、0.590、1.318、3.381、4.100、8.915 g/L)。

圖4 14喀斯特地區植物藥、維生素C對脂質過氧化的抑制率Fig.4 Inhibition activity on lipid peroxidation of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.5 隸屬函數分析對喀斯特地區植物藥抗氧化活性的綜合評價

由表2可以看出14種植物藥按隸屬函數加權值大小排列分別為仙桃草>吳茱萸>維生素C>涼粉柴>響鈴草>鎖陽>天冬>皂角>瓜子金>薏苡仁>菟絲子>錦茵陳>黃精>一朵云>玉竹,反映了這些藥物抗氧化能力的強弱順序。這些藥物中仙桃草和吳茱萸的加權值高于維生素C,展現出較強的抗氧化能力。

表2 14種植物藥和維生素C的隸屬函數值Tab.2 Membership function values of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

3 討論

本研究對14種喀斯特地區優勢植物藥提取物進行了清除自由基、還原金屬離子和抑制脂質過氧化等抗氧化能力的綜合檢測,結合隸屬函數分析,對14植物藥和維生素C的抗氧化能力強弱進行了綜合客觀的評價及排序。目前隸屬函數多用于對農作物的抗逆性進行綜合評價[16,20],鮮見用于植物藥的抗氧化能力評價。引入隸屬函數分析,提供了一條在多指標測定的基礎上對藥物抗氧化能力進行綜合評價的途徑,更具科學性和信服力。解決了單一指標或者多指標評價但無整體分析對比抗氧化能力的局限性,結果發現仙桃草的抗氧化能力最為顯著。

仙桃草為玄參科植物蚊母草的帶蟲癭的全草,其性味甘、苦,其主要含黃酮類和酚酸類成分[21-22],多用于外傷止血[23]、促進骨愈合[24],仙桃草中的活性物質具有抗癌作用[25-26]。但有關仙桃草抗氧化應激的文獻報道較少,有學者從仙桃草中提取了8個環烯醚萜苷和4個酚類化合物,發現部分成分具有較強的抗氧化活性[27]。本實驗亦證實了仙桃草具有較顯著的抗氧化能力,此外天然抗氧化活性成分與合成的抗氧化劑相比,具有毒性小活性強等優點[28],具有極大的發掘潛力。

本研究處于對植物藥提取物的抗氧化能力的初步研究階段。植物藥提取物是化合物,其成分繁雜,各組成成分之間的功效及抗氧化作用不甚清楚[29-30]。明確有效的抗氧化單體成分(如多酚類、維生素類、多糖類等)是極為必要的,不同的抗氧化成分之間可具有協同性,聯合使用時能更好地增加療效和降低成本[31]。后續可通過高通量分子篩選[32]等手段,從分子、細胞水平對仙桃草和吳茱萸等進行檢測,以期發現抗氧化的新靶標或潛在的有效成分,最終用于以氧化應激升高為主要發病機制的疾病的干預治療。綜上所述,喀斯特地區植物藥是我國醫藥的重要寶庫,對其有效成分的研究應不僅僅局限于抗氧化功效,在抗炎、抗菌、抗腫瘤等方面可能有著巨大潛力,值得進一步深入研究。