自噬對鋅指轉(zhuǎn)錄因子1及高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT的影響*

安小敏, 李清璇, 王彤, 龍?zhí)烊A, 楊鵬, 盧雨微, 張小龍, 郭兵,4, 石明雋,5***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 3.地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 4.貴州省常見重大慢性疾病發(fā)病機制及藥物開發(fā)應(yīng)用創(chuàng)新基地, 貴州 貴陽 550025; 5.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

隨著糖尿病發(fā)病率逐年升高,其并發(fā)癥糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)的發(fā)病率也逐漸增加,成為終末期腎功能衰竭的重要原因[1]。腎小管上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial- mesenchymal transition, EMT)能增加腎間質(zhì)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積、促進腎間質(zhì)纖維化及DKD的發(fā)生發(fā)展[2],但DKD時EMT的發(fā)生機制尚不十分明確。鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(zinc-finger transcription factor 1, Snail1)是上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化和癌癥相關(guān)成纖維細胞活化所必需的轉(zhuǎn)錄因子。Snail1可抑制E-鈣粘附素基因表達,誘導(dǎo)EMT[3]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),在高糖培養(yǎng)的原代大鼠腎小管上皮細胞中Snail1的表達明顯增多,并且在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中敲低內(nèi)源性Snail1能明顯降低其分泌ECM的能力[4],提示Snail1可能影響腎小管上皮細胞EMT而促進DKD時腎纖維化的發(fā)生。但在DKD中,腎小管上皮細胞內(nèi)Snail1蛋白增多的機制尚不清楚。自噬是細胞內(nèi)蛋白降解的兩種主要途徑之一,通過自噬小體與溶酶體的融合可降解自噬小體內(nèi)包裹的老化細胞器、侵入的病原體及蛋白質(zhì)等,從而實現(xiàn)細胞穩(wěn)態(tài)、能量的生成和細胞器的更新等作用。本課題組前期研究與國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病(DM)大鼠模型中,腎組織的自噬水平明顯受到抑制[5-6],而提高其自噬水平能明顯抑制DKD的發(fā)生發(fā)展[7],表明自噬與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Grassi等[8]發(fā)現(xiàn)在肝細胞中抑制自噬能明顯減少Snail1蛋白的自噬性降解,促進EMT的發(fā)生。但在DKD中,自噬是否通過調(diào)控Snail1的降解而影響腎小管上皮細胞EMT過程,目前尚不清楚。因此本研究擬以DM大鼠和高糖培養(yǎng)的大鼠NRK-52E細胞為研究對象,研究自噬對Snail1以及大鼠腎小管上皮細胞EMT的調(diào)控作用及機制,為進一步深入理解DKD腎纖維化發(fā)病機制、尋找治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠12只,體質(zhì)量180～220 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2009-0007],動物實驗規(guī)程已獲貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn),符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。NRK-52E細胞購自(上海中科院細胞庫),鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ;美國Sigma公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑(北京中杉公司),胎牛血清(FBS,以色列BIOIND公司),抗微管蛋白(β-Tublin)抗體、抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔和羊抗小鼠IgG(武漢普美克生物技術(shù)有限公司),兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3-Ⅱ/Ⅰ;北京博奧森生物技術(shù)有限公司),兔抗Snail1、鼠抗自噬降解底物蛋白1(sequestosome 1, SQSTM1/p62;美國Abcam公司)、兔抗自噬基因BECN 1(coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein, Beclin1;美國Abcam公司),二甲基亞砜(DMSO;北京索萊寶科技有限公司),雷帕霉素(RAP,蘇州碧云天有限公司),氯喹(CQ)、放線菌酮(CHX)及蛋白酶抑制劑(MG-132,美國ECM公司),雙標(biāo)熒光腺相關(guān)病毒(Lenti-mCherry-EGFP-LC3B,碧云天生物技術(shù))。所用引物由上海生物工程股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

1.2 研究方法

1.2.1動物模型建立、分組和動物標(biāo)本采集 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機抽查大鼠血糖均<8 mmol/L,隨機分為正常對照(NC)組和DM組,每組6只。模型復(fù)制方法參照文獻[8],禁食不禁水6 h后,乙醚麻醉大鼠,DM組予尾靜脈注射2%的STZ(53 mg/kg,用高壓后的0.1 mol/L、pH 4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配置,即配即用),NC組注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后測大鼠血糖,以空腹血糖≥16.7 mmol/L判斷為DM模型復(fù)制成功,2周后行醋酸法進行尿蛋白定性測試,尿蛋白陽性者判斷腎功能損害,發(fā)生DKD。造模成功后第24周末處死兩組大鼠,處死前1 d收集24 h尿液,記錄24 h尿量。處死前禁食不禁水6 h,股動脈取血,室溫離心(1 000 r/min,5 min)后取上清,-20 ℃保存。處死大鼠后取腎組織,冠狀切面約2 mm厚片,部分于4%甲醛溶液中固定,其余部分凍在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2生化指標(biāo)檢測 收集的血清送至貴陽金域檢驗中心進行生化指標(biāo)檢測(雅培2000全自動生化檢測儀)檢測血糖、血尿素氮(BUN)和尿白蛋白(UAlb)計算24 hUAlb(24 h尿量和尿白蛋白的乘積)。

1.2.3細胞培養(yǎng)及分組 NRK-52E細胞置于二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基,10%FBS,5%CO2,37 ℃),待細胞密度達到50%時,加入無血清的DMEM培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)細胞12 h后,將細胞分為正常糖組(NG,5.5 mmol/L)、高糖組(HG,30 mmol/L)、高滲組(HM,30 mmol/L)和高糖+藥物組(HG+自噬激動劑RAP或抑制劑CQ),含1%FBS相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞蛋白和/或RNA標(biāo)本進行相關(guān)檢測。

1.2.4免疫熒光化學(xué)染色觀察P62、Snail1、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達 將NRK-52E細胞在12孔板中進行爬片,根據(jù)分組分別用相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)基,PBS洗滌,4%多聚甲醛室溫固定15 min,預(yù)冷的PBS洗滌(5 min×3次),加入0.2%TritonX-100室溫放置6 min,PBS洗滌(5 min×3次),3%BSA室溫孵育封閉30 min,滴加一抗,4 ℃冰箱孵育過夜;次日室溫復(fù)溫30 min,PBS洗滌(5 min×3次),加入熒光二抗37 ℃避光孵育1 h,PBS洗滌(5 min×3次),抗熒光猝滅劑封片后,激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝保存圖像。

1.2.5Western blot法檢測自噬、EMT、纖維化相關(guān)指標(biāo) -80 ℃冰箱凍存的大鼠腎組織,每只鼠取100 mg腎皮質(zhì)加蛋白裂解液1 mL,高通量研磨機研磨;細胞樣本則根據(jù)細胞量多少加入適量蛋白裂解液,用細胞刮刮取細胞。組織或細胞樣本置于4 ℃裂解30 min后離心(4 ℃,12 000 r/min,15 min),取上清液變性制備蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入抗體[小鼠抗β-Tublin抗體(1∶1 000)、兔抗α-SMA(1∶1 000)、兔抗collagen Ⅲ(1∶1 000)、鼠抗E-cadherin抗體(1∶1 000)、兔抗Snail1(1∶1 000)、兔抗p62(1∶1 000)、兔抗LC3(1∶1 000)、兔抗Beclin1(1∶1 000)],4 ℃冰箱孵育過夜;TBST洗膜,加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠Ⅱ抗(1∶10 000)、山羊抗兔Ⅱ抗(1∶10 000),室溫?fù)u床孵育1 h;TBST洗滌,Smart-ECL發(fā)光試劑在凝膠成像儀進行化學(xué)發(fā)光曝光,以β-tubulin作為內(nèi)參,實驗重復(fù)3次,用蛋白條帶結(jié)果用Image Lab5.0軟件進行分析各個條帶灰度值,計算相對表達量后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.6免疫共沉淀實驗驗證P62與Snail1之間相互作用 NRK-52E細胞密度達到50%時,加入無血清的DMEM培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)細胞12 h后,將NG組和HG組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液,PBS清洗3遍,加入細胞裂解液500 μL,冰上裂解30 min,把裂解好的細胞刮下來,冰上超聲：強度37%,4 s、3次,離心取上清(4 ℃,15 min,12 000 r/min),每500 μL裂解液加入ProteinA+G磁珠20 μL,室溫翻轉(zhuǎn)搖床上緩慢翻轉(zhuǎn)1 h。NG組又分為全蛋白組(Input組)和IP組(IP組又分為陰性對照IgG組和實驗組Snail1/P62)。磁分離取出磁珠后按IP實驗中所需抗體稀釋比例加對應(yīng)的抗體,4 ℃翻轉(zhuǎn)搖床上緩慢翻轉(zhuǎn)過夜。用預(yù)冷的細胞裂解液500 μL洗3次磁珠,最后1次按照初始體積加入裂解液,每400 μL裂解液加入100 μL 1×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液,100 ℃金屬浴10 min,磁分離把磁珠離心至管底,取上清進行Western blot。

1.2.7Lenti-mCherry-EGFP-LC3B檢測自噬流 共聚焦皿中培養(yǎng)NRK-52E細胞,細胞密度達50%時,更換培養(yǎng)液(約加入正常培養(yǎng)體系的1/2體積),然后根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果加入相應(yīng)體積的病毒液培養(yǎng)6 h后,補充培養(yǎng)液至正常體系,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,激光共聚焦顯微鏡觀察自噬流情況并拍攝保存圖像。所有操作均需避光。

1.2.8驗證上調(diào)或抑制自噬后對Snail1蛋白降解作用的影響 CHX作為蛋白合成抑制劑,加入后可阻斷蛋白合成的來源,MG-132作為泛素-蛋白酶體降解途徑的阻斷劑,可以阻斷蛋白通過泛素途徑的降解,聯(lián)合CHX與MG-132處理后,可將蛋白通過自噬降解的多少作為單一變量進行觀察。在正常糖中聯(lián)合CHX和MG-132處理NRK-52E細胞,收集0、1、2、4、6、8及10 h的蛋白;在HG條件下分別使用RAP上調(diào)自噬或CQ抑制自噬48 h,再聯(lián)合使用CHX+MG-132處理細胞,分組為HG+DMSO/RAP組、HG+DMSO/CQ組,收集0、6及10 h的蛋白,Western blot觀察Snail1的衰減速率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況及生化指標(biāo)

造模后72 h,DM組大鼠血糖≥16.7 mmol/L,提示糖尿病模型復(fù)制成功。造模第2周后,每周監(jiān)測大鼠血糖、體質(zhì)量,NC組大鼠血糖正常,體質(zhì)量穩(wěn)定增加,DM組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,體質(zhì)量增長減慢甚至減輕。24周時處死大鼠,血和尿生化檢測結(jié)果顯示,與NC組相比,DM組大鼠血糖、BUN、24 h UAlb升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 NC和DM組大鼠血糖、BUN、24 h UAlb的變化Tab.1 The changes of rat blood glucose, BUN, and 24 h UAbl in NC and DM

2.2 DM大鼠腎組織和高糖培養(yǎng)的NRK-52E中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達減少,p62表達增加

Western blot結(jié)果顯示(圖1),在DM組大鼠腎組織和高糖培養(yǎng)的NRK-52E中,p62表達增加,LC3-Ⅱ/Ⅰ減小,Beclin1表達減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示高糖環(huán)境中腎小管上皮細胞自噬受到抑制。

注：A為大鼠腎組織結(jié)果,B為高糖刺激NRK-52E細胞結(jié)果;(1)與NC組比較,P<0.05。

2.3 高糖培養(yǎng)的NRK-52E細胞中自噬流受阻

如圖2結(jié)果所示,HG培養(yǎng)的NRK-52E中自噬流阻滯在自噬溶酶體融合(晚期)之前。

2.4 在高糖培養(yǎng)的NRK-52E中上調(diào)自噬可緩解EMT、減少ECM沉積,抑制自噬時結(jié)果相反

Western blot結(jié)果顯示,RAP刺激后,與HG組相比,HG+RAP組中p62表達降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ增加,Beclin1表達升高(P<0.05,圖3A);提示自噬水平提高;HG+RAP組中α-SMA、Collagen Ⅲ的表達減少,E-cadherin表達增多(P<0.05,圖3B);提示提高自噬水平后抑制了腎小管上皮細胞EMT,且ECM減少。CQ刺激后,與HG組相比,HG+CQ組中LC3-Ⅱ/Ⅰ增加,p62表達增多,Beclin1表達減少(P<0.05,圖3C);提示自噬溶酶體降解受到抑制;HG+CQ組中α-SMA、Collagen Ⅲ的表達增多,E-cadherin表達減少(P<0.05,圖3D);提示抑制自噬后加劇了EMT,且ECM沉積增多。

注：A為RAP刺激后LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1的表達變化,B為RAP刺激后α-SMA、E-cadherin以及Collagen Ⅲ的表達變化;C為CQ刺激后LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1的表達變化;D為CQ刺激后α-SMA、E-cadherin、Collagen Ⅲ的表達變化;(1)與HG組比較,P<0.05。

2.5 免疫熒光觀察到在高糖培養(yǎng)的NRK-52E中上調(diào)自噬可緩解EMT,抑制自噬時結(jié)果相反

如圖4結(jié)果所示,細胞免疫熒光觀察到,與HG組相比,HG+RAP組中p62、α-SMA表達減少,E-cadherin表達增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而HG+CQ組中結(jié)果相反,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示上調(diào)自噬可以延緩EMT的發(fā)生,抑制自噬則可促進EMT的發(fā)生。

注：A、B、C分別為各組NRK-52E中p62、α-SMA和E-cadherin的表達;(1) 與HG組相比,P<0.05;(2) 與HG組相比,P<0.05。

2.6 DM大鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中Snail1的表達及自噬對Snail1的調(diào)控

在DM大鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的NRK-52E中,與NC組相比,DM組Snail1蛋白增多(P<0.05);與NG組相比,HG組Snail1蛋白增多(P<0.05,圖5A);在NRK-52E細胞中,使用自噬激動劑RAP刺激后,與HG組相比,HG+RAP組Snail1的蛋白表達減少,而使用自噬抑制劑CQ刺激后,與HG組相比,HG+CQ組Snail1的蛋白表達增多(P<0.05,圖5B);免疫共沉淀結(jié)果顯示,Snail1與p62之間存在蛋白相互作用(圖5C);免疫熒光結(jié)果觀察到Snail1與p62存在共定位現(xiàn)象(圖5D)。以上結(jié)果提示在高糖環(huán)境中Snail1表達增多,且可能通過p62連接,進入到自噬途徑降解。

注：A為Western blot測定DM大鼠及高糖培養(yǎng)的NRK-52E中Snail1表達;(1) 與NC組相比,P<0.05;(2) 與NG組相比,P<0.05;B為Western blot測定RAP/CQ組中Snail1的蛋白水平;(1) 與HG組相比,P<0.05;(2) 與HG組相比,P<0.05;C為免疫共沉淀結(jié)果;D為細胞免疫熒光結(jié)果(400×)。

2.7 自噬對高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞Snail1降解的作用

Western blot結(jié)果顯示：CHX、MG-132合并刺激NKR-52E不同時間,在NG組中觀察到Snail1蛋白半衰期約為6 h(在第6小時衰減到51%),而在第10小時則減少到11%(圖6A),故后續(xù)實驗采用0、6及10 h這3個時間點作為Snail 1蛋白衰減的觀察時間。在HG條件下分別使用RAP上調(diào)自噬或CQ抑制自噬48 h,再聯(lián)合使用CHX+MG-132處理細胞,結(jié)果顯示,與HG+DMSO組相比,在HG+RAP組中上調(diào)自噬后第6小時Snail 1蛋白衰減速率明顯較DMSO組加快(42%比89%),10 h時Snail1的衰減速率更快(16%比86%);與HG+DMSO組相比,HG+CQ組中抑制自噬后第6小時Snail 1蛋白衰減速率較DMSO組無明顯變化(97%比98%),而10 h時Snail 1蛋白衰減較DMSO組更慢(96%比89%)。提示Snail1通過自噬途徑降解,而調(diào)控自噬水平可以調(diào)控Snail1蛋白的降解速率。

注：A為Snail1蛋白衰減時間點的摸索,線圖中方框表示在CHX+MG-132聯(lián)合處理下,Snail1蛋白半衰期約為6 h(在第6小時衰減到51%);B為RAP刺激后Snail 1蛋白的衰減速率變化;C為CQ刺激后Snail1蛋白的衰減速率變化。

3 討論

目前我國DM患者人數(shù)居世界首位,在我國20～79歲成年人中,發(fā)病率高達10%[1],DKD是糖尿病最普遍且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,是DM患者終末期死亡的主要原因[2-3]。腎間質(zhì)纖維化是引發(fā)DKD終末期腎功能衰竭的主要原因[4,9-10],腎間質(zhì)纖維化時正常的腎小管和腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)被大量聚集的ECM所代替,最終引起腎功能衰竭[5]。腎小管EMT能增加腎間質(zhì)內(nèi)ECM的沉積、促進腎間質(zhì)纖維化及DKD的發(fā)生發(fā)展[11-15]。本研究結(jié)果證實在DM大鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的NRK-52E細胞中α-SMA、Snail1表達均增高,E-cadherin表達降低,Collagen Ⅲ的表達增高,高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞發(fā)生了EMT、ECM沉積增多;細胞免疫熒光實驗也證實了上述結(jié)果。

近年來有研究發(fā)現(xiàn),自噬與EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-18]。除了泛素-蛋白酶體降解途徑外,自噬是細胞中蛋白質(zhì)降解的另一種主要途徑。在自噬過程中,LC3-Ⅰ會先經(jīng)自噬相關(guān)基因 7(autophagy-related gene 7, ATG7)和自噬相關(guān)基因3(autophagy-related gene 3, ATG3)等蛋白修飾和加工,再與磷脂酰乙醇胺(PE)相偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ,并定位于自噬體內(nèi)外膜上。因此,即可通過觀察LC3-Ⅱ/Ⅰ的變化可預(yù)測自噬水平的高低;除LC3之外,p62是目前研究較廣泛的另一個自噬底物。在自噬體形成過程中,p62可標(biāo)記需被降解的蛋白并鏈接到LC3上,繼而將其包裹入自噬體,再進入溶酶體中降解,所以p62蛋白的表達量與自噬活性呈負(fù)相關(guān)[19]。Beclin1是調(diào)節(jié)自噬的主要分子之一[20],上調(diào)Beclin1的表達能提高細胞自噬水平、抑制EMT發(fā)生[21],而敲低Beclin1則能明顯抑制細胞自噬水平促進EMT的發(fā)生[22]。前期研究發(fā)現(xiàn)DKD大鼠模型及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞模型中Beclin1表達明顯降低,自噬受到抑制[7,23]。本研究結(jié)果顯示,在高糖環(huán)境中p62蛋白表達增多,LC3、Beclin1表達減少,進一步證實在高糖環(huán)境的腎小管上皮細胞中自噬受到抑制;使用LC3雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,在高糖培養(yǎng)的NRK-52E細胞中自噬流被阻滯。RAP刺激是較為常用的自噬活化方法,而CQ是一種常用的自噬抑制劑,可以通過提升溶酶體內(nèi)pH值進而阻斷細胞自噬活性。有研究人員發(fā)現(xiàn),在HK2細胞中使用CQ可拮抗由膽固醇誘導(dǎo)的EMT[24];而使用RAP提高自噬水平可明顯延緩EMT的發(fā)生[25-27]。本實驗使用CQ和RAP刺激高糖培養(yǎng)的NRK-52E,觀察調(diào)節(jié)自噬對EMT的影響,結(jié)果證實RAP上調(diào)自噬可以部分逆轉(zhuǎn)高糖下的EMT發(fā)生和ECM沉積增多,而在CQ組中呈現(xiàn)出了相反的結(jié)果。但自噬對EMT調(diào)控的機制尚未明確。

Zou等[28]發(fā)現(xiàn)在人心臟微血管內(nèi)皮細胞中,缺氧能抑制p62與Snail1蛋白的相互作用,從而減少自噬-溶酶體途徑對Snail1蛋白的降解,促進心內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生;RAP刺激則能增強自噬-溶酶體途徑對Snail1蛋白的降解,抑制缺氧誘導(dǎo)的心內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。另有研究發(fā)現(xiàn),提高乳腺癌細胞的自噬水平能明顯增強自噬-溶酶體途徑對Snail1蛋白的降解,從而減少EMT的發(fā)生[29]。Snail1屬于鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,在EMT過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可與E-cadherin啟動子的E-box序列結(jié)合,抑制E-cadherin的表達,從而啟動EMT進程。本研究免疫共沉淀結(jié)果顯示,Snail1與p62之間存在蛋白相互作用;免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),Snail1與自噬小體在細胞中存在共定位。提示Snail1可能通過p62被攜帶入自噬體中,再與自噬體融合進入溶酶體被降解。因此擬觀察在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中,調(diào)控自噬水平對Snail1降解速率變化的影響。CHX作為蛋白合成抑制劑可以阻斷蛋白的生成,而CHX MG-132則可阻斷蛋白通過泛素-蛋白酶體的降解,因此使用CHX和MG-132刺激細胞后,可觀察Snail1蛋白通過自噬降解的情況。與對照組相比,上調(diào)自噬后Snail1蛋白降解加快,抑制自噬后Snail1蛋白降解減慢,提示Snail1可能通過與車載蛋白p62結(jié)合,進入到自噬小體當(dāng)中,跟隨自噬小體進入到溶酶體被降解,并且受到自噬狀態(tài)的影響。

綜上,在DM大鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中自噬受到抑制,Snaill通過自噬途徑降解減少,從而促進了EMT發(fā)生,最終導(dǎo)致DN腎纖維化。以上結(jié)果對進一步明確EMT的發(fā)生機制,從而為尋找抑制其啟動、減少ECM的沉積及找尋DKD腎間質(zhì)纖維化的防治靶點提供了實驗基礎(chǔ)。