楮實(shí)子預(yù)處理對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致L02 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

韓世誠(chéng) 王婷婷 張一昕 王 茜 柴天川

1.河北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050091；2.河北省中醫(yī)院制劑科，河北石家莊 050091

藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）是由藥物引起的常見不良反應(yīng)之一，據(jù)報(bào)道，對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是引起肝衰竭的主要因素之一[1]。長(zhǎng)期大量使用APAP，過量產(chǎn)物N-乙酰苯醌亞胺攻擊線粒體，破壞其結(jié)構(gòu)，增加通透性，降低膜電位；損傷活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的防御體系，增加線粒體ROS 生成，激活線粒體內(nèi)c-jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK），促進(jìn)線粒體不斷產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過氧化[2-5]。ROS的過量產(chǎn)生又可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而激活增強(qiáng)子CCAAT 結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步誘發(fā)肝損傷。楮實(shí)子味甘，氣寒，無(wú)毒，入腎、肝二經(jīng)。具有滋腎益陰、清肝明目等功效。前期研究證實(shí)，楮實(shí)子能夠改善APAP 所致肝損傷大鼠的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，并對(duì)線粒體形態(tài)損傷有一定的修復(fù)作用[6-7]。為了進(jìn)一步探究其基于線粒體損傷的護(hù)肝作用機(jī)制，本研究采用APAP 損傷人正常胚胎肝細(xì)胞株L02 后，用楮實(shí)子水提物加以干預(yù)，通過檢測(cè)細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)ROS 水平、線粒體膜電位水平、JNK、GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)水平，在體外分子水平驗(yàn)證楮實(shí)子護(hù)肝作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人正常肝細(xì)胞L02 細(xì)胞，河北醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 主要藥品與試劑

楮實(shí)子提取物（1 g 水提物=10 g 飲片），西安匯林生物科技有限公司提供，批號(hào)：HL- 210120；楮實(shí)子粉碎后、加熱煎煮，過濾得到藥液，通過噴霧干燥設(shè)備霧化后在熱風(fēng)作用下快速蒸發(fā)和凝固，得到楮實(shí)子提取物，密封容器保存，按照需要的濃度稀釋于RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。JNK 抗體、GRP78 抗體、p-JNK抗體（批號(hào)：GB12002、GB11098、GB13019-1）；CHOP 抗體（批號(hào)：15204-1-AP）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 楮實(shí)子水提物安全劑量的篩選 將細(xì)胞分為正常組，對(duì)照組和不同濃度（0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 mg/ml）的楮實(shí)子水提物溶液，每組6 個(gè)復(fù)孔，選用CCK-8 計(jì)算細(xì)胞存活率，選取存活率適宜的楮實(shí)子濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-正常組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-正常組OD 值）×100%。

1.3.2 APAP 損傷致L02 細(xì)胞損傷條件的篩選 將細(xì)胞分為正常組、對(duì)照組、不同濃度（5、10、20、40、80 mmol/L）APAP 損傷組，選用CKK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率，選擇導(dǎo)致50%細(xì)胞存活率的APAP 濃度建立體外肝細(xì)胞損傷模型[8]。

1.3.3 楮實(shí)子水提物對(duì)APAP 損傷的L02 細(xì)胞的干預(yù) 對(duì)楮實(shí)子水提物有效劑量及APAP 致L02 肝細(xì)胞損傷劑量進(jìn)行篩選后，在96 孔板中接種L02 細(xì)胞，每孔100 μl，分為正常組、APAP 組和楮實(shí)子干預(yù)組，每組6個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。APAP 組和楮實(shí)子干預(yù)組加入40 mmol/L 的APAP 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。楮實(shí)子干預(yù)組加入含生藥量1 mg/ml 的楮實(shí)子水提物，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 細(xì)胞凋亡情況觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L02 細(xì)胞以1×106個(gè)/ml 的濃度接種于6 孔板中，按“1.3.1”培養(yǎng)方法和藥物干預(yù)。添加Hoechst 33258 染液（每孔1 ml），CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。吸除染液，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次2 min。在熒光顯微鏡下拍攝熒光圖片（激發(fā)波長(zhǎng)352 nm，發(fā)射波長(zhǎng)461 nm）比較細(xì)胞凋亡情況。

1.4.2 ROS 含量檢測(cè) DCFH-DA 法測(cè)定L02 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。將細(xì)胞按“1.3.1”培養(yǎng)方法和藥物干預(yù)接種于6 孔板中，PBS 洗滌3 次。加入1.5 ml 終濃度為10 mol/L 的DCFH-DA 溶液。對(duì)照組添加活性氧供氫體。在37 ℃培養(yǎng)箱中處理30 min。去除DCFH-DA 溶液，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，離心后用PBS 懸浮細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 和發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）。

1.4.3 JNK、p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表達(dá) 超低溫下提取蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗GAPDH（稀釋比為1∶2 000）、p-JNK（稀釋比為1∶800）、JNK、GRP78、CHOP（稀釋比為1∶1 000）4 ℃過夜。洗膜，加入二抗（稀釋比：1∶3 000），在室溫下孵育30 min，顯影，獲取圖像。

1.4.4 線粒體膜電位表達(dá) 將細(xì)胞接種于6 孔板中的載玻片上，按“1.3.1”培養(yǎng)方法和藥物干預(yù)。PBS 沖洗3次，將羅丹明母液加入培養(yǎng)基制成染液，加入6 孔板中，37 ℃避光孵育15 min。吸出染液，用PBS 沖洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 楮實(shí)子水提物有效劑量篩選

在0.1 mg/ml 濃度下，楮實(shí)子水提物對(duì)細(xì)胞存活率的影響較小，隨著濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。在0.3 mg/ml 及更高的濃度下，存活率受到更大的抑制。與0.1 mg/ml 楮實(shí)子水提物比較，0.3、1.0、3.0、10.0 mg/ml 楮實(shí)子水提物細(xì)胞活性降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。楮實(shí)子水提物為1 mg/ml 時(shí)，細(xì)胞存活率開始趨于平緩，因此以生藥量1 mg/ml 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 楮實(shí)子水提物對(duì)L02 細(xì)胞存活率的影響

2.2 APAP 致L02 肝細(xì)胞損傷劑量篩選

細(xì)胞存活率隨APAP 濃度增加而降低，當(dāng)APAP給藥濃度為40 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率為50%，因此，以APAP 濃度為40 mmol/L 進(jìn)行后續(xù)造模實(shí)驗(yàn)。見圖2。

圖2 APAP 對(duì)各組L02 細(xì)胞存活率的影響

2.3 各組細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡平均熒光強(qiáng)度值比較

與正常組比較，APAP 組細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡平均熒光強(qiáng)度值升高（P＜0.05）；與APAP 組比較，1 mg/ml 楮實(shí)子水提物細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡平均熒光強(qiáng)度值降低（P＜0.05）。見圖3、表1。

表1 各組細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡平均熒光強(qiáng)度值比較（±s）

表1 各組細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡平均熒光強(qiáng)度值比較（±s）

注與正常組比較，aaP＜0.01；與APAP 組比較，bbP＜0.01。APAP：對(duì)乙酰氨基酚。

圖3 各組L02 細(xì)胞凋亡情況（200×）

2.4 各組L02 細(xì)胞ROS 含量比較

APAP 組ROS 熒光強(qiáng)度值為（65.02±5.43），高于正常組的（16.87±3.85），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.719，P＜0.01）；楮實(shí)子組ROS 熒光強(qiáng)度值為（21.19±3.25），低于APAP 組的（65.02±5.43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.965，P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組L02 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量變化（200×）

2.5 各組L02 線粒體膜電位平均熒光強(qiáng)度值比較

APAP 組線粒體膜電位平均熒光強(qiáng)度值為（25.67±3.78），低于正常組的（58.36±2.54），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.582，P＜0.01）；楮實(shí)子組線粒體膜電位平均熒光強(qiáng)度值為（42.18±2.83），高于APAP 組的（25.67±3.78），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.564，P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組L02 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化（200×）

2.6 各組L02 細(xì)胞JNK、p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)水平比較

各組JNK 蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，APAP 組p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與APAP 組比較，楮實(shí)子組p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組L02 細(xì)胞內(nèi)JNK、p-JNK、GRP78 和CHOP的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

研究顯示，肝細(xì)胞受損的核心機(jī)制是氧化應(yīng)激，ROS 作為氧化反應(yīng)的副產(chǎn)物是氧化應(yīng)激啟動(dòng)和加重的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，ROS 過度產(chǎn)生引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥等致使肝損傷的發(fā)生[7，9]。本研究采用人肝細(xì)胞作為體外模型的細(xì)胞系，探討藥物的肝毒性和治療藥物的有效性[10]。熒光顯微鏡下觀察熒光變化，反映ROS 含量，結(jié)果顯示APAP 組L02 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，細(xì)胞存活率降低；楮實(shí)子組L02 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞存活率升高。提示楮實(shí)子能降低ROS 含量，從而緩解APAP 對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS 的主要地點(diǎn)，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）下降與細(xì)胞凋亡相關(guān)[11-14]。同時(shí)，過量的ROS 還可激活JNK 信號(hào)通路，加劇氧化應(yīng)激ROS 的產(chǎn)生，另一方面激活JNK 可誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變，加重線粒體損傷[15-16]。本研究結(jié)果顯示，APAP 組L02 細(xì)胞pJNK表達(dá)升高；楮實(shí)子組pJNK 表達(dá)降低，表明楮實(shí)子可通過減少ROS 產(chǎn)生，抑制JNK 活化，修復(fù)線粒體膜通透性，減少ROS 產(chǎn)生，抑制肝細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在氧化應(yīng)激引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色，在多種肝臟疾病中均有所存在[17-20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78 的表達(dá)，是評(píng)價(jià)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的指標(biāo)，能促進(jìn)肝細(xì)胞功能的修復(fù)[21]。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78 的表達(dá)并非恒定。在對(duì)抗肝細(xì)胞損傷過程中，GRP78 表達(dá)量先升高，到峰值后逐漸下降，為細(xì)胞凋亡做準(zhǔn)備[22-23]。與此同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的促凋亡蛋白CHOP，在ROS 增多時(shí)被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24-25]。本研究結(jié)果顯示，APAP 組中GRP78 和CHOP蛋白表達(dá)高于正常組，提示凋亡途徑被啟動(dòng)。楮實(shí)子組中GRP78 和CHOP 蛋白表達(dá)低于APAP 組，提示楮實(shí)子可以拮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并減緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，楮實(shí)子可能通過減少ROS 含量，抑制JNK 活化，修復(fù)線粒體膜通透性，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)L02 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，但尚有待深入系統(tǒng)的研究明確其作用靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。