N6-腺苷酸甲基化干預細胞增殖分化在神經系統疾病中的進展

候雅清 張雷雷 馮香瑞 馬晶瑩 馬旺然 常翔 楊琳

N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6A)通過重塑RNA的二級結構來改變其翻譯后的功能。甲基化轉移酶將供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基催化轉移至RNA腺嘌呤的第6個N元素上;去甲基轉移酶擦除該修飾,使得該過程具有動態可逆性;通過閱讀蛋白特異性識別修飾信號后發揮生物學作用[1]。迄今為止,生物體中已被鑒定的RNA修飾方式高達170多種[2],例如N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A),N6,2-O-二甲基腺嘌呤核苷(N6-2-dimethyladenosine,m6Am)以及假尿苷(Pseudouridine,ψ)[3]等,其中m6A約占RNA甲基化修飾的80%,并廣泛分布于各型RNA[4]。作為影響mRNA的“生命周期”的核心因子,在細胞增殖、分化、代謝、應激反應等生命活動發揮重要的作用,這種化學修飾調節人類發育、健康和疾病[5]。而在神經系統中,m6A水平升高與腦組織發育成熟高度相關,研究發現被抑制METTL14的小鼠胚胎模型中的NSCs自我更新與增殖分化同樣依賴于m6A修飾[6]。m6A水平失衡在中樞神經系統相關疾病中的重要性不容忽視,因此,本文綜述m6A甲基化干預細胞增殖分化在神經系統疾病中的作用,為精確干預病程和預后提供新的治療靶點。

1 m6A修飾的動態調控機制

m6A主要沉積在含有特殊序列RRACH(D=r=A/G/U,r=A/G,H=A/C/U)的終止密碼子、以及非翻譯區(UTR)的3’端[7]。m6A修飾的調節因子共同作用參與RNA的β折疊過程[8],維持RNA上m6A沉積的動態穩定并參與生物體中樞神經系統中更復雜的生理病理機制,參與修飾的相關蛋白見表1。

表1 m6A修飾相關蛋白的功能

編碼蛋白“Writers”通過在目標靶點上安裝甲基來實現甲基化,該過程是由甲基轉移酶復合物(MTC)操控,主要由METTL3/14(異源二聚體)、WTAP、KIAA1429、ZC3H13、RBM15/15B等構成。METTL3通過SAM結合域和一個DPPW基序(Asn-Pro-Pro-Trp)實現m6A的沉積[9];METTL14協助底物RNA識別。調控亞基WTAP協助穩定異源二聚體定位并與RBM15、ZC3H13、VIRMA相關轉錄因子結合形成一種新的蛋白復合物,精確定位靶點并參與m6A修飾的產生[10]。敲除ZC3H13導致WTAP、HAKAI和VIRMA發生易位,m6A水平顯著降低60%～70%,影響細胞的自我更新[11]。

消碼蛋白“Erasers”通過去除m6A修飾來實現甲基化逆轉。常見的RNA去甲基化酶 有ALKB 家族的肥胖相關蛋白(FTO)和ALKB同源蛋白5(ALKBH5)[12]。2011年Wei等[13]發現Exportin2蛋白引導FTO在細胞質和細胞核之間穿梭,通過在細胞中的定位來決定它對底物的偏好;敲除FTO導致m6A在mRNA中的數量增加,首次證明了FTO的去甲基效應。ALKBH5是第2個被發現的去甲基化酶,其定位在細胞核中,僅用于前體mRNA,并表現出去甲基化的能力。在HeLa細胞中,ALKBH5下調使總mRNA中m6A含量增加[14]。盡管FTO與ALKBH5為同族成員,二者以不同的機制清除甲基,分別發揮著不同的生物作用。

閱讀蛋白“Readers”利用特殊結構域識別m6A修飾后的堿基,從而使轉錄后調控具有真正意義上的生物學功能,常見的閱讀蛋白主要包括含YTH家族結合蛋白、IGF2BPs、eIF3、HNRNP等,糖皮質激素受體GR作為RNA結合蛋白和轉錄因子,也可結合m6A[15]。YTHDCs和YTHDFs在細胞中的定位不同,在轉錄產物的運輸過程及代謝中發揮不同作用。有研究發現IGF2BP家族通過KH結構域特異性地識別RNA上m6A修飾的UGGAC序列[16],并促進其翻譯和穩定性。這些隱藏在結合蛋白中特殊結構域的發現有助于理解m6A在生理病理中的作用。

2 m6A生物學功能

m6A修飾參與mRNA代謝的整個過程,如miRNA成熟體加工、可變剪接、核運輸、翻譯和穩定性等過程中發揮不可替代的作用[17]。通過調控基因的表達或結構,在各種生物過程中起著關鍵作用,包括組織發育、氧化應激、熱休克反應和DNA損傷反應,也可調控細胞的多種表型,如精原細胞分化和減數分裂的起始,影響造血干細胞(HSC)分化的命運,同樣m6A在神經細胞中也起著至關重要的作用[18]。

3 m6A在神經發育中的作用

3.1 m6A與腦組織發育 隨著大腦逐漸發育成熟,m6A修飾也相應增加,在敲低METTL3的小鼠神經系統中發現,小腦嚴重萎縮[19]。此外,ALKBH5在低壓低氧環境中存在缺陷,導致小腦發育相關基因m6A修飾紊亂,進一步表明m6A修飾與腦組織發育密切相關。FTO在神經發生晚期表達最高,ALKBH5表達在大腦發育過程中下降,這可能意味著去甲基化酶對神經發生的過程發揮調節作用。而不同腦區域中顯示m6A修飾水平有明顯差異,如小鼠小腦中m6A修飾濃度高于大腦皮層[20],這些結果表明甲基化水平的差異均可能影響腦組織的生物學功能。

3.2 m6A調控神經細胞 研究表明,m6A含量的動態穩定在神經細胞功能和活動中至關重要,Meyer等[6,21]在成人大腦中m6A可調控神經干細胞分化。YTHDF1促進m6A甲基化mRNA翻譯,刺激神經元促進學習記憶。Wang等[22]發現m6A修飾相關蛋白的失調與中樞神經系統發生有關聯。研究發現,FTO缺失導致海馬下顆粒區(SGZ)和側腦室下腦室區(SVZ)成體干細胞數量顯著下降,并損害成長階段神經元的分化能力[23]。而在小鼠胚胎模型中發現,低水平METTL14破壞皮質發育,導致小鼠過早死亡;METTL3缺失抑制了神經元發育成熟。另有研究中,果蠅神經元中缺失METTL3與YTHDF1/2/3任何一種,都會對其短期記憶造成嚴重損害[24]。YTHDF2參與小鼠皮質神經的發育,敲低水平后使得神經元分化受損,最終導致小鼠大腦皮層發育延遲和功能障礙。

4 在神經系統疾病中

m6A修飾調節人類發育、健康和疾病,由于在大腦中的含量較高,表明它腦血管和其他神經疾病中的重要性不容忽視[25]。異常水平的m6A與CNS疾病的發生發展以及預后相關,下文重點闡述m6A修飾及相關蛋白介導基因干預細胞增殖分化對CNS疾病的影響,并為疾病的預防提供治療靶點。

4.1 缺血性腦損傷 缺血性腦卒中(Ischemic stroke,IS)的致殘致死性對患者的生活及壽命造成了嚴重的損害。病理機制大致為缺血-再灌注(I-R)損傷導致廣泛的神經血管損傷。為了迅速介導卒中后的血管修復,需探索新的治療思路。

有研究表明,m6A為新的IS的治療靶點和診斷生物標志物,通過基因干預NSCs參與IS的發生和發展及預后[26]。Xu等[27]在大鼠模型中發現,大腦中動脈閉塞后的皮層和I-R后的初級神經元中,m6A水平隨著ALKBH5的升高和FTO表達的下降而連續升高,敲除ALKBH5會加重神經元損傷。Chokkalla等[28]觀察局灶缺血神經元發現,FTO的表達在mRNA和蛋白水平上都被下調,這可能導致卒中后大腦中m6A標記RNA的去甲基化降低,同時發現總m6A去甲基酶活性的下降。Li等[29]在大鼠模型中發現,敲低YTHDC1可加重缺血性腦損傷,過表達YTHDC1促進RNA降解,增加Akt磷酸化,從而促進神經元存活,尤其是保護缺血后腦損傷。內源性NSCs應答腦損傷時,分泌神經營養因子等可以刺激NSCs損傷后的增殖和分化,從而促進早期缺血性中風的內源性修復機制。相較NSCs移植治療缺血性腦損傷,靶向調控m6A相關蛋白,間接調節NSCs的分化,避免了移植過程中的問題。

m6A甲基化的研究將為理解IS機制提供新的見解,可能成為IS的一個前瞻性治療靶點。但m6A在IS中的具體作用機制還有待進一步探討。

4.2 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD) AD是一種以病理性大腦皮層萎縮為典型特征的不可逆的神經系統變性疾病。發病機制尚未完全確定,目前認為細胞外Aβ淀粉樣蛋白沉積和細胞內τ蛋白過度磷酸化導致神經纖維纏繞[30]。

研究發現高濃度FTO通過激活雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,mTOR)信號通路,加快神經元τ蛋白磷酸化[29]。Huang等[31]在AD患者死后的腦樣本中發現高濃度的METTL3,推測AD患者海馬內異常表達的METTL3可能參與了與AD的發病;而后在研究AD患者mRNA水平時發現RBM15B含量增加,這一結果可能說明m6A相關酶含量下降后的代償反應。Han等[32]對比APP/PS1雙轉基因小鼠與正常小鼠的大腦皮質和海馬區m6A的含量,結果發現模型組表達較高,其中Mettl3高表達而FTO表達降低;進一步測序分析基因發現,AD模型小鼠與正常小鼠參與突觸生長的基因AMPA和NMDA基因甲基化水平升高,而SEMA基因甲基化水平明顯降低。

盡管AD的具體機制仍未明確,但至少證明m6A可能參與了AD的病理過程。目前無論是逆轉AD病理產物的藥物設計,還是靶向淀粉樣蛋白或τ蛋白的免疫療法,臨床試驗未證明療效顯著的方案。從理論上講,使用基因靶向調控NSCs來恢復受損的膽堿能神經元和大腦連接,可能會為AD提供新的治療選擇。然而,在臨床使用前,仍然存在需要克服的障礙。

4.3 帕金森病 帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD) PD是一種常見的年齡相關性神經退行性疾病。目前大多認為,發病過程與α-突觸核蛋白(α-synuclein)過度聚集和紋狀體黑質DA壞死相關, 近年來,m6A與PD病理機制的聯系成為了研究熱點。

m6A維持正常成年小鼠紋狀體功能和學習能力,而在PD模型中,大腦紋狀體區m6A水平明顯降低,導致DA表達降低;敲低METTL14不改變小鼠紋狀體大小,但可提高神經元興奮性。Koranda等[33]發現,紋狀體中METTL14的缺乏增加了對DA藥物的敏感性,如D1R激動劑SKF-81297。研究發現PD患者紋狀體區域m6A水平的明顯降低與FTO濃度有關,認為FTO過表達加重線粒體損傷和多巴胺能神經元細胞損傷[34]。Chen等[35]在神經毒素6-羥多巴胺誘導的PC12(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的分泌DA的細胞系)細胞和PD大鼠腦紋狀體時發現,抑制多巴胺能細胞內m6A水平,可誘導N-甲基-d-天冬氨酸受體1的表達,促進氧化應激和Ca2+內流,最終導致DA凋亡。而在藥理研究中發現,可卡因可能通過降低FTO的表達來調節突觸的成熟和定位,抑制DA再攝取來放大DA信號,緩解臨床癥狀[34]。

目前PD病患者的治療主要包括多巴胺類藥物代替治療、肉毒素治療及腦深部電刺激術等,均不能阻止疾病發生發展,若利用m6A與這些受體的聯系,或干預產生正常功能的DA,可能開發出增加受體數量、促進DA在腦內擴散的相關藥物來治療PD。

4.4 膠質母細胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM) GBM是一種神經膠質細胞來源惡性腫瘤,患者常表現為頭痛、記憶力減退或思維混亂等。研究發現,膠質母細胞瘤干細胞(GSCs)選擇性地依賴于特殊結合位點促進腫瘤代謝,因此,靶向GSCs可能改善腫瘤結局[36]。

Huff等[37]認為m6A修飾中任何部分的失調都與多種癌癥的不良預后和腫瘤發生有關;Gao等[38]在實驗中無論抑制METTL3/14或FTO/ALKBH5過表達都可以加快GSCs自我更新并促進腫瘤的生長。Visvanathan等[39]發現METTL3過表達后m6A水平上升,損害了體外多個GSC系的腫瘤增殖。Zhang等[40]研究闡明m6A甲基化的缺失促進了體外和體內腫瘤的生長,敲低GSC來源的小鼠中的ALKBH5可以阻礙腫瘤惡性增殖。還有研究顯示,YTHDF2或YTHDFs可能對癌基因MYC表達和腫瘤生長抑制產生更強的影響,可作為GBM中干擾MYC信號通路的一個廣泛治療靶點[41-42]。

盡管近年來針對GBM有很多新穎治療方案,但由于95%的療法仍無法穿透血腦屏障使得治療幾乎沒有進展。通過靶點調控m6A相關蛋白水平精準阻止GSC的惡性增殖,或植入“清除因子”對惡意增殖的癌細胞進行定向清除。

4.5 重度抑郁癥(major depression disorder,MDD) MDD是一種復發風險高的嚴重精神疾病,發作期存在明顯的情感、認知和軀體癥狀,發作間期癥狀緩解。盡管MDD的發病機制尚不清楚,多認為數個影響基因表達的效應變異結合與環境等因素相互作用,可能導致MDD的病理進展。控制基因表達的m6A甲基化,以一種大腦區域和基因特異性的方式對環境刺激做出動態反應,其調節異常可能導致壓力相關疾病,MDD中許多失調的系統被發現是通過m6A介導的,而越來越多的證據表明FTO在抑郁癥病理中存在失調[43-45]。因此,這可能對理解MDD的分子機制有重要意義。MDD與情緒調節和認知功能相關的大腦區域內和跨區域的神經元通信中斷有關。Liu等[43]研究發現MDD患者和抑郁小鼠模型海馬區FTO含量下降,繼續分析3種抑郁癥小鼠模型中(慢性不可預測輕度應激(UCMS)、慢性克制應激(CRS)和社會失敗應激(SDS)模型)m6A修飾酶的表達,UCMS小鼠模型中FTO和ALBKH5的mRNA表達較對照組明顯下調,而RNA甲基轉移酶的表達水平保持不變,并檢測到多個情緒調節相關區域mRNA表達明顯活躍。Samaan等[44]報道了FTO中等位基因rs9939609A與MDD呈正相關。Du等[45]分析了參與RNA修飾的5個基因(METTL3/14、WTAP、ALKBH5和FTO)內的23個SNP,結果發現ALKBH5基因與MDD相關;此外,編碼m6A系統的基因內的許多SNPs與MDD的焦慮、發育遲緩和認知障礙等臨床癥狀相關。下丘腦垂體腎上腺軸、嗜神經因子等生物系統作為基因調節器的m6A化學修飾,可以調控相關蛋白含量應答壓力刺激和環境因素。基因編輯誘導并產生神經細胞,可建立起正常功能的神經元信號通路,從而有效地代表神經精神疾病的相關方面,這一策略可以為個體化疾病開辟新的途徑。

4.6 癲癇 癲癇(epilepsy,EP)是由腦部神經元高度同步化異常放電所致的慢性短暫性腦功能障礙綜合征[46]。由于病變部位與傳導范圍不同,癲癇的臨床表現復雜多樣,越來越多的研究將癲癇歸因于具有表觀遺傳功能的基因變異,這些基因的產物包括表觀遺傳標記的編碼、消除和讀取,以及其他表觀遺傳過程等。成熟的miRNA與mRNA形成堿基對。Rowles等[47]發現miRNA-134含有一個潛在的m6A位點,在癲癇(TLE)動物模型的顳葉皮層組織以及在顳葉癲癇和海馬硬化患者的海馬組織中一致上調,抑制LIM激酶1(Limk1),從而抑制翻譯,導致癲癇。Zheng等[48]在研究新型脯氨酰-4-羥化酶抑制劑時,發現其可以抑制FTO,提高m6A甲基化水平,并抵抗小鼠驚厥。低氧誘導因子(HIF)干預促紅細胞生成素表達,降低FTO水平,促進m6A合成,發揮抗癲癇作用[49]。Tan等[50]發現丙戊酸鈉治療可增加海馬區FTO的表達,經過復雜的生物過程,抑制癲癇的發生。這些結果表明m6A與癲癇之間存在關聯,若通過靶向調控分子水平,保護受損區域的神經元穩態,可有效阻止癲癇的發生,這將為臨床治療癲癇提供新的思路。

4.7 肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS) ALS又稱為“漸凍癥”,是上下運動神經元損傷之后,四肢軀干肌肉逐漸無力或萎縮的運動神經元病[51]。ALS的發病機制目前尚不明確,可能與遺傳、自身免疫力等原因有關,臨床、生化和遺傳特征的顯著變異性也使治療靶點的鑒定復雜化。Yoneda等[52]發現結合蛋白TLS/FUS不包含YTH特殊結構域,核定位信號(NLS)突變,迫使TLS/FUS液-液相分離(LLPS),通過LLPS形成的細胞毒性聚集物引起神經元細胞凋亡或壞死以及神經元系統的紊亂。Mcmillan等[53]不僅發現大多數結合蛋白TDP43底物攜帶m6A修飾,而且YTHDF2在小鼠模型和成人神經元ALS模型中促進了TDP43相關的毒性。另外,在散發性ALS患者死后脊髓組織中檢測到廣泛的RNA高甲基化。這些研究數據強調了m6A修飾與ALS發病機制之間的基本聯系,假設通過靶向促進神經細胞分化成可代替受損神經元的新生神經元,這將為臨床治療ASL提供新的診療途徑。

4.8 腦動靜脈畸形(Brain arteriovenous malformations,AVMs) AVM是一種危及生命的先天性腦血管疾病,臨床以腦出血、癲癇和中風為特征。通過對腦動靜脈畸形患者的轉錄組學因子水平分析,Wang等[54]發現METTL3在較大的腦動靜脈畸形病理組織中表達水平降低;同年研究發現WTAP及其靶基因DSP在m6A修飾腦動靜脈畸形患者中表達減少,促進DSP mRNA降解,從而抑制血管生成[55]。此過程中,IGF2BP1/3蛋白可以提高DSP mRNA的穩定性。WTAP缺乏引起的WT1活性增加導致β-catenin的大量降解,這也可能抑制內皮細胞的血管生成[55]。m6A修飾可調控細胞的分化方向,控制腦血管生成,為預防腦型AVM的形成和發展提供合適的藥理學靶點。

RNA甲基化修飾在調節哺乳動物發育階段的細胞維持、分化、重新編程和控制中起著重要作用。m6A甲基化相關蛋白通過靶向調節細胞增殖周期與定向分化、轉錄翻譯、特殊結合位點以及藥物敏感等,在疾病治療、病情延緩、預后改善等過程中發揮關鍵作用。這些發現為各種疾病的臨床治療開辟了新的方向。一個或多個甲基化調控因子的異常表達可能有助于開發靶向修飾蛋白的調節劑,以進一步探索在生理學和病理學中調控細胞基因表達的潛在機制。然而,在通過靶向RNA甲基化治療疾病時,仍然有許多困難需要克服。此外,雖然RNA甲基化涉及多種模式,但對體外細胞與m6A模式結構研究有限,隨著外延組學的發展,RNA中m6A修飾對于惡性疾病療效以及預后中有望實現新的突破。