阿江欖仁酸由AMPK/mTOR/HO-1信號(hào)通路調(diào)控自噬對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變影響

蔣晨 萬新娟 王紹飛 王曉虹 丁琳

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥,已成為工作年齡段(18～65歲)人群的主要失明原因之一[1]。流行病學(xué)研究顯示,到2045年將有7億成年人患有糖尿病,其中35%的患者將并發(fā)DR[2]。研究發(fā)現(xiàn),糖尿病可通過抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬功能增加毛細(xì)血管和細(xì)胞的炎癥、晚期糖基化終末產(chǎn)物積累和氧化應(yīng)激,促進(jìn)細(xì)胞凋亡并造成視網(wǎng)膜損傷[3]。因此,抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬可能是治療DR的重要策略。根據(jù)中醫(yī)理論,“濕”和“熱”是糖尿病的主要病機(jī)[4]。阿江欖仁酸(arjunolic acid,AA)作為主要在青錢柳中發(fā)現(xiàn)的齊墩果酸類三萜化合物,在中國(guó)古代藥典《中華本草》具有“清熱解毒、生津止渴”的功效,發(fā)揮抗糖尿病、抗炎、抗氧化和抗凋亡活性的作用[5-6],提示AA可能是治療DR的一種有前景的候選藥物。本研究通過構(gòu)建DR大鼠和細(xì)胞模型,評(píng)估AA對(duì)DR的療效和潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:阿江欖仁酸(批號(hào):CAS:465-00-9,上海源葉生物科技有限公司);鏈脲佐菌素(STZ,貨號(hào):18883-66-4,美國(guó)Sigma公司);HE染色試劑盒(貨號(hào):C0105S,北京碧云天);二氫乙錠(DHE)染色試劑盒(貨號(hào):104821-25-2,美國(guó)Sigma公司);BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào):CW0014S-500T,中國(guó)康為世紀(jì)公司);抗LC3、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、GAPDH抗體(貨號(hào):4108、23214、5831、2535、2983、5536、92310,美國(guó)CST公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(貨號(hào):75920,美國(guó)CST公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠(體質(zhì)量180～200 g)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(上海)2020-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),12 h光暗交替,室溫(25±2)℃下自由標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)食水。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組處理:所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)組、模型(STZ)組、阿江欖仁酸低劑量(AAL)組和阿江欖仁酸高劑量(AAH)組,每組15只。通過單次腹腔注射溶于檸檬酸鈉緩沖液(pH值=4.5)的STZ(65 mg/kg)構(gòu)建大鼠糖尿病模型,對(duì)照組僅給予等體積檸檬酸鈉緩沖液。注射72 h后測(cè)量空腹血糖(FBG),以FBG>16.7 mmol/L為模型構(gòu)建成功。之后,AAL組和AAH大鼠分別給予AA(10 mg/kg和30 mg/kg)灌胃處理,Con組和STZ組大鼠給予等量PBS溶劑灌胃,1次/d,維持10周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,戊巴比妥鈉(100 mg/kg)過量麻醉處死所有大鼠并收集眼球和血樣,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.2 HE染色檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu):將用于病理學(xué)檢測(cè)的大鼠眼球在4%多聚甲醛中固定48 h,石蠟包埋并切片(5 μm)備用。利用蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒,按照說明書步驟,進(jìn)行染色,400倍光學(xué)顯微鏡下拍照記錄。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá):使用Total RNA Isolating Kit試劑盒分離視網(wǎng)膜組織總RNA,然后根據(jù)OneStep RT-PCR Kit試劑盒說明書利用相關(guān)引物將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒,按照制造商說明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)以檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(MPC)-1的相對(duì)mRNA表達(dá)。PCR反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94℃,10 s; 60℃,20 s;和72℃,30 s)。按照2-ΔΔCt公式計(jì)算,以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列如下:IL-1β引物F:5’-TTCAAATCTCACAGCAGCAT-3‘; R:5’-CACGGGCAAGACATAGGTAG-3‘; IL-6引物F:5’-AACTCCATCTGCCCTTCA-3’; R:5’-CTGTTGTGGGTGGTATCCTC-3’; MCP-1引物F:5’-TCGCTCAGCCAGATGCAATCAATG -3’; R:5’-CAGTTTGGGTTTGCTTGTCCAGGTG -3’;GAPDH引物F:5’-CGGCAAGTTCAACGGCACAG-3’; R:5’-CGCCAGTAGACTCC ACGACAT-3’。

1.2.4 二氫乙錠(DHE)染色評(píng)估視網(wǎng)膜組織ROS產(chǎn)生:參考先前文獻(xiàn)研究方法[7],將視網(wǎng)膜組織切成10 μm厚的切片,使用DHE試劑盒并根據(jù)制造商說明書進(jìn)行染色。將每個(gè)切片與DHE試劑在37 ℃黑暗環(huán)境中孵育30 min,PBS洗滌3次。超氧化物在DHE染料存在下顯示紅色熒光。用DAPI(40,6-二脒基-2-苯基吲哚,藍(lán)色熒光)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。熒光顯微鏡下拍照記錄,并使用Image J定量。

1.2.5 Western blot檢測(cè):視網(wǎng)膜組織在RIPA裂解液中勻漿裂解后,4℃下14 000 r/min離心30 min,獲取上清總蛋白,并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒定量。將等量(10～20 μg/泳道)的蛋白樣品在8%～15% SDS-PAGE凝膠上分級(jí)分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在室溫下浸入5%(m/V)脫脂牛奶中1 h,隨后在4℃下用以下稀釋的一抗處理過夜:p62(1∶1 000)、LC3Ⅱ/Ⅰ(1∶1 000)、Beclin-1(1∶500)、HO-1(1∶500)、p-AMPK(1∶500)、AMPK(1∶500)、p-mTOR(1∶500)、mTOR(1∶400)和GAPDH(1∶10 000)。用TBST洗滌后,將膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)二抗在37℃溫育1 h。通過ECL系統(tǒng)對(duì)膜蛋白條帶進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響 Con大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整,層次清晰規(guī)則,細(xì)胞排列規(guī)則有序;STZ組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)腫脹和空泡樣變化,中央視網(wǎng)膜ONL層厚度和細(xì)胞核計(jì)數(shù)明顯降低(P<0.01);而AAL組和AAH組大鼠視網(wǎng)膜ONL厚度和細(xì)胞核計(jì)數(shù)逐漸升高,結(jié)構(gòu)相對(duì)規(guī)整(P<0.05)。見表1,圖1。

圖1 AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響(HE×400)

表1 4組大鼠ONL層厚度和細(xì)胞核計(jì)數(shù)比較 n=5,

2.2 AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示,與Con組比較,STZ組大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA水平顯著增高(P<0.05);與STZ組比較,AAH組IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05),而STZ組和AAL組之間3者表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠視網(wǎng)膜組織炎性因子mRNA表達(dá) n=5,

2.3 AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激的影響 DHE染色結(jié)果顯示,與Con組比較,STZ組大鼠視網(wǎng)膜外核層(ONL)、內(nèi)核層(INL)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)中ROS產(chǎn)生增加(P<0.01);與STZ組比較,AAL組和AAH組視網(wǎng)膜ONL、INL和GCL中ROS產(chǎn)生逐漸降低(P<0.01)。見圖2,表3。

圖2 DHE染色檢測(cè)AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激的影響

表3 4組大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激和自噬比較 n=5,

2.4 AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜自噬和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響 Western blot結(jié)果顯示,與Con組比較,STZ組大鼠視網(wǎng)膜中LC3Ⅱ/Ⅰ比率和HO-1表達(dá)顯著降低,p62表達(dá)升高(P<0.01);與STZ組比較,AAL和AAH組大鼠視網(wǎng)膜組織LC3Ⅱ/Ⅰ比率和HO-1表達(dá)逐漸升高,p62表達(dá)逐漸降低,具有濃度依賴性(P<0.01)。見圖3,表3。

圖3 Western blot檢測(cè)AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜自噬和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

2.5 AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜AMPK/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與Con組比較,STZ組大鼠視網(wǎng)膜組織p-AMPK蛋白表達(dá)顯著降低,p-mTOR表達(dá)明顯升高(P<0.01);與STZ組比較,AAL和AAH組大鼠視網(wǎng)膜組織p-AMPK表達(dá)逐漸升高,p-mTOR表達(dá)逐漸降低,具有濃度依賴性(P<0.01)。而3組間AMPK和mTOR蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4,表4。

圖4 Western blot檢測(cè)AA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜AMPK/mTOR相關(guān)蛋白的影響

表4 4組大鼠視網(wǎng)膜組織AMPK/mTOR相關(guān)蛋白表達(dá) n=5,

3 討論

AA是從青錢柳中分離得到的一種主要的活性三萜類化合物(C.paliurus triterpenoids,CPT),具有多種生物學(xué)效應(yīng),包括降糖、降血脂、抗氧化和抗炎等[8]。AA已被揭示為糖尿病和糖尿病腎病的潛在治療藥物,但其對(duì)DR的影響有待探索。據(jù)報(bào)道,自噬激活對(duì)DR具有有益作用[9],并且AA可以促進(jìn)自噬[10]。因此,本研究探索了AA對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷中細(xì)胞自噬的影響。之前的研究表明,AA占青錢柳三萜類的(44.88±2.17)%,而CPT降低糖尿病大鼠血糖的有效劑量為40 mg/kg。因此本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇AA的濃度為10和30 mg/kg。

DR是一種病因復(fù)雜的多因素疾病,高血糖引起視網(wǎng)膜損傷的確切機(jī)制尚不清楚[11]。眾所周知,由于視網(wǎng)膜中含有大量多不飽和脂肪酸,其氧耗和葡萄糖氧化水平較高。此外,高血糖可促進(jìn)視網(wǎng)膜中晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)的形成,從而促進(jìn)ROS產(chǎn)生和毒性蛋白積累,對(duì)周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞造成直接損傷[3]。因此,近年來如何降低過量ROS,抑制氧化應(yīng)激并改善DR病理?yè)p傷受到廣泛關(guān)注。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種抗氧化酶,不僅能催化血紅素分解,還能清除活性氧和炎性因子,維持病理?xiàng)l件下的機(jī)體自穩(wěn)態(tài)[12]。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素和藍(lán)莓花色素苷可通過增加HO-1的蛋白表達(dá)水平,抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)[13-14]。與我們的結(jié)果一致,AA治療在減輕DR大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷的同時(shí),可抑制ROS產(chǎn)生和HO-1蛋白表達(dá),并呈劑量依賴性。以上結(jié)果提示,AA對(duì)DR患者氧化應(yīng)激具有顯著抑制作用。

通常認(rèn)為炎癥主要在DR早期階段發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵致病因素,多種促炎性細(xì)胞因子水平在DR患者和動(dòng)物模型的玻璃體液和視網(wǎng)膜中增加[15]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了炎癥在DR發(fā)生發(fā)展中的重要性。臨床研究發(fā)現(xiàn),DR患者的高血糖可增加ROS的產(chǎn)生,從而促進(jìn)一些炎性細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放[16]。與上述研究相似,我們的數(shù)據(jù)顯示AA治療可以呈劑量依賴性地下調(diào)糖尿病大鼠IL-1β、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。先前的研究已經(jīng)報(bào)道,自噬功能障礙是DR發(fā)病機(jī)制中存在的早期事件[17]。自噬途徑的抑制使視網(wǎng)膜細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥更敏感,從而加重細(xì)胞損傷[18]。Shi等[19]研究發(fā)現(xiàn),3-甲基腺嘌呤對(duì)自噬的抑制促進(jìn)了視網(wǎng)膜中ROS的積累和DLRP3炎癥小體活化,促進(jìn)DR惡化。Taki等[20]發(fā)現(xiàn),雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬激活可有效抑制視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中的超氧化物形成。由于LC3Ⅱ/Ⅰ比率和Beclin-1表達(dá)增加以及p62水平降低是自噬有效激活的標(biāo)志[21]。這與我們的結(jié)果一致,說明AA治療可增強(qiáng)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的細(xì)胞自噬水平,其對(duì)炎癥和氧化應(yīng)激的抑制可能與自噬激活有關(guān)。因此,有必要進(jìn)一步探索AA對(duì)DR自噬激活的具體作用機(jī)制。

ROS是重要的信號(hào)分子,通過細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路參與信息的傳遞。研究發(fā)現(xiàn),過量ROS可通過激活A(yù)MPK/mTOR等通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬和自噬性死亡,從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。Kim等[23]報(bào)道,鹽霉素可通過增加ROS產(chǎn)生,激活PI3K/AKT/mTOR和ERK/p38 MAPK信號(hào)通路來促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡。李丹等[24]發(fā)現(xiàn),DOCK1通過抑制AMPK/mTOR通路激活,抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡和自噬。蘇俐丹等[25]發(fā)現(xiàn),血根堿可能通過激活A(yù)MPK/mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,從而抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn),DR大鼠視網(wǎng)膜組織p-AMPK表達(dá)明顯升高,p-mTOR表達(dá)顯著降低;AA治療可呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)AMPK和mTOR的磷酸化水平,提示AA可能通過調(diào)控AMPK/mTOR通路進(jìn)而調(diào)節(jié)DR視網(wǎng)膜組織細(xì)胞自噬。然而DR發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,AA調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路對(duì)DR的治療機(jī)制還需更進(jìn)一步的研究去證實(shí)。

綜上所述,AA可通過激活A(yù)MPK/mTOR/HO-1通路促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病理?yè)p傷、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)產(chǎn)生保護(hù)作用。因此,AA可能是早期DR治療的理想策略。