LncRNA TMPO-AS1調(diào)節(jié)miR-340-5p/RUNX1軸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

許漢兵 韓建濤 張成鵬

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一,位居我國惡性腫瘤病死率第三位,且發(fā)病率、病死率仍呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重危及國民的生命安全[1]。CRC早期診斷率低、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、化療耐藥導(dǎo)致其預(yù)后很差[2],因此了解其癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲對(duì)CRC患者至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,在多種疾病中異常表達(dá)[3],TMPO反義RNA1(TMPO antisense RNA1,TMPO-AS1)是一種lncRNA,有報(bào)道表明其在多種癌癥中高表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)展[4],如在肺癌細(xì)胞中,沉默TMPO-AS1上調(diào)miR-143-3p表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[5],但TMPO-AS1在CRC發(fā)展中的作用尚未闡明。miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子,能夠與特定的mRNA結(jié)合,并在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控基因的表達(dá),其大小為18～25個(gè)核苷酸[6]。有研究表明,miR-340-5p在多種癌癥中低表達(dá),上調(diào)后可抑制癌細(xì)胞的侵襲,轉(zhuǎn)移等[7],利用軟件分析發(fā)現(xiàn)TMPO-AS1與miR-340-5p有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。miRNAs能夠與特定的mRNA結(jié)合,并在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控基因的表達(dá),RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Runt-associated transcription factor 1,RUNX1)是RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,該家族進(jìn)化高度保守[8],有研究表明RUNX1在CRC組織中高表達(dá),促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移[9],利用軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-340-5p與RUNX1存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述,對(duì)其機(jī)制做出以下推測(cè):LncRNA TMPO-AS1調(diào)節(jié)miR-340-5p/RUNX1軸影響CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiC、人CRC細(xì)胞SW480、HCT116、LOVO、HT-29均購自普諾賽生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 Firefly &Renilla Dual Luciferase Assay Kit購自蘇州宇恒生物;Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑購自默克;CCK-8試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)公司;EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自銳博生物;RUNX1、PCNA、MMP-2抗體購自CST公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將HCoEpiC、SW480、HCT116、LOVO、HT-29細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)HCoEpiC、多種CRC細(xì)胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達(dá) Trizol試劑提取不同細(xì)胞中的總RNA,將獲得RAN逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。TMPO-AS1、RUNX1以GAPDH為內(nèi)參,miR-340-5p以U6為內(nèi)參,使用2-△△Ct方法計(jì)算TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:TMPO-AS1:正向5-TTAGGATTCTTGCGGGTGGT-3;反向5-AGCCAGACCTCTACAATCGG-3’;RUNX1:正向5-GTTTGTCGGTCGAAGTG-GAAGA-3;反向5-AGGGTTAAAGGCAGTG-GAGTGG-3’;GAPDH:正向5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’;反向5’-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3’;miR-340-5p:正向5-GCGGTTAAAGCAATGAGA-3;反向5-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’;U6:正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將HCT116細(xì)胞分為si-ctrl組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-ctrl)、si-TMPO-AS1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-TMPO-AS1)、mimics NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics NC)、miR-340-5p組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340-5p mimics)、si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-TMPO-AS1和anti-miR-ctrl)、si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-TMPO-AS1和anti-miR-340-5p)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達(dá) 方法同1.4。

1.7 CCK-8法檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞活力 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,換取新鮮的培養(yǎng)基并向每個(gè)孔中加入CCK-8溶液。孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)450 nm處吸光度。

1.8 EDU法檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞增殖 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,每孔加入EDU培養(yǎng)基,孵育2 h,PBS清洗細(xì)胞,根據(jù)EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明依次進(jìn)行固定、通透、洗滌、染色,最后進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.9 Transwell檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲 轉(zhuǎn)染48 h后,制成細(xì)胞懸液,加入Transwell上室,下室加入完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,擦去未遷移的細(xì)胞,固定,結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)需提前包被基質(zhì)膠,其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.10 Western blot檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞RUNX1、PCNA、MMP-2表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后,細(xì)胞棄去上清,加入RIPA裂解液獲得蛋白,將蛋白用BCA法進(jìn)行定量后,進(jìn)行Western blot檢測(cè),具體操作為電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育一抗(RUNX1、PCNA、MMP-2、GAPDH),孵育二抗,ECL顯色,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,Image J軟件將蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.11 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建TMPO-AS1野生型質(zhì)粒(TMPO-AS1-WT)和突變型質(zhì)粒(TMPO-AS1-MUT),將TMPO-AS1-WT和TMPO-AS1-MUT分別與mimics NC或miR-340-5p mimics共轉(zhuǎn)染于HCT116細(xì)胞,48 h后,檢測(cè)熒光素酶活性。構(gòu)建RUNX1野生型質(zhì)粒(RUNX1-WT)和突變型質(zhì)粒(RUNX1-MUT),將RUNX1-WT和RUNX1-MUT分別與mimics NC或miR-340-5p mimics共轉(zhuǎn)染于HCT116細(xì)胞,48 h后,檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 HCoEpiC細(xì)胞與多種CRC細(xì)胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達(dá)比較 與HCoEpiC細(xì)胞比較,不同CRC細(xì)胞中TMPO-AS1、RUNX1 mRNA表達(dá)顯著性升高,miR-424-5p表達(dá)顯著性降低(P<0.05),且HCT116細(xì)胞變化結(jié)果更顯著,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HCT116細(xì)胞。見表1。

表1 HCoEpiC與CRC細(xì)胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達(dá)比較 n=6,

2.2 6組HCT116細(xì)胞TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1 mRNA水平比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細(xì)胞TMPO-AS1、RUNX1 mRNA水平顯著性降低(P<0.05),miR-340-5p mRNA水平顯著性升高(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細(xì)胞RUNX1 mRNA水平顯著性降低(P<0.05),miR-340-5p mRNA水平顯著性升高(P<0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細(xì)胞RUNX1 mRNA水平顯著性升高(P<0.05),miR-340-5p mRNA水平顯著性降低(P<0.05)。見表2。

表2 6組HCT116細(xì)胞TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1 mRNA水平比較 n=6,

2.3 6組HCT116細(xì)胞活力比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細(xì)胞活力A值顯著性降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細(xì)胞活力A值顯著性降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細(xì)胞活力A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細(xì)胞活力A值顯著性升高(P<0.05)。見表3。

表3 6組HCT116細(xì)胞活力A值比較 n=6,A值,

2.4 6組HCT116細(xì)胞增殖能力比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細(xì)胞EDU陽性細(xì)胞率顯著性降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細(xì)胞EDU陽性細(xì)胞率顯著性降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細(xì)胞EDU陽性細(xì)胞率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細(xì)胞EDU陽性細(xì)胞率顯著性升高(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 EDU染色檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞增殖(×200)

表4 6組HCT116細(xì)胞增殖能力比較 n=6,

2.5 6組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著性降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著性降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著性升高(P<0.05)。見圖2、3,表5。

圖2 Transwell檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞遷移(×200)

圖3 Transwell檢測(cè)6組HCT116細(xì)胞侵襲(×200)

表5 6組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 n=6,個(gè),

2.6 6組HCT116細(xì)胞RUNX1、PCNA、MMP-2表達(dá)比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細(xì)胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細(xì)胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細(xì)胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細(xì)胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平顯著性升高(P<0.05)。見表6,圖4。

圖4 6組HCT116細(xì)胞中RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)比較;A si-ctrl組;B si-TMPO-AS1組;C mimics NC組;D miR-340-5p組;E si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組;F si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組

表6 6組HCT116細(xì)胞中RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)比較 n=6,

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果 軟件分析發(fā)現(xiàn)LncRNA TMPO-AS1與miR-340-5p、miR-340-5p與RUNX1均有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與TMPO-AS1-WT+mimics NC組比較,TMPO-AS1-WT+miR-340-5p mimics組HCT116細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與RUNX1-WT+mimics NC組比較,RUNX1-WT+miR-340-5p mimics組HCT116細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。見圖5、6,表7、8。

圖5 TMPO-AS1與miR-340-5p的結(jié)合位點(diǎn)

圖6 miR-340-5p與RUNX1的結(jié)合位點(diǎn)

表7 驗(yàn)證TMPO-AS1與miR-340-5p的靶向關(guān)系 n=6,

表8 驗(yàn)證miR-340-5p與RUNX1的靶向關(guān)系 n=6,

3 討論

CRC是臨床上常見的惡性腫瘤,常出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10],因此需要為CRC的診斷和治療確定新的高效分子靶點(diǎn)。最近研究表明,LncRNA TMPO-AS1是一種癌基因,參與多種癌癥的發(fā)展,比如在胃癌組織中TMPO-AS1高度表達(dá),調(diào)節(jié)miR-140-5p/SOX4軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移,侵襲[11];在宮頸癌細(xì)胞中TMPO-AS1過度表達(dá),調(diào)節(jié)miR-143-3p和ZEB1軸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[12]。而筆者發(fā)現(xiàn)關(guān)于LncRNA TMPO-AS1在CRC中發(fā)揮作用尚無報(bào)道,因此本文首先檢測(cè)LncRNA TMPO-AS1在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞比較,多種CRC細(xì)胞中TMPO-AS1高度表達(dá),且HCT116細(xì)胞TMPO-AS1水平更高,因此選擇HCT116細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。沉默TMPO-AS1后發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲均被抑制,表明TMPO-AS1促進(jìn)HCT116細(xì)胞細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA是內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,通過與其靶mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合來介導(dǎo)mRNA降解或翻譯抑制[13]。近年來研究表明miR-340-5p與癌癥進(jìn)展密切相關(guān),如過表達(dá)miR-340-5p后可逆轉(zhuǎn)FGF23對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的促進(jìn)作用,表明miR-340-5p抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14];過表達(dá)miR-340-5p可抑制喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15];在CRC一篇研究中表明,miR-340-5p在CRC中低表達(dá),circN4BP2L2通過下調(diào)miR-340-5p水平,促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[16];miR-340-5p通過直接靶向ANXA3在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑瘤作用,推測(cè)可作為結(jié)直腸癌預(yù)后的標(biāo)志物[7]。因此猜測(cè)miR-340-5p抑制CRC發(fā)展。

本文發(fā)現(xiàn)與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞比較,CRC細(xì)胞中miR-340-5p表達(dá)下調(diào),將HCT116細(xì)胞過表達(dá)miR-340-5p后發(fā)現(xiàn),HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲均被抑制,表明miR-340-5p抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。接著軟件分析發(fā)現(xiàn)LncRNA TMPO-AS1與miR-340-5p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TMPO-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-340-5p表達(dá),為了進(jìn)一步驗(yàn)證此想法,將細(xì)胞沉默TMPO-AS1并且抑制miR-340-5p表達(dá),結(jié)果表明抑制miR-340-5p后,可逆轉(zhuǎn)沉默TMPO-AS1對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲抑制作用,上述研究表明沉默TMPO-AS1靶向上調(diào)miR-340-5p表達(dá),從而抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

有趣的是,本文觀察到與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞比較,RUNX1在CRC細(xì)胞中高表達(dá),且與miR-340-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。RUNX1被證明在多種癌癥中過表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)展,與癌癥患者預(yù)后密切相關(guān),比如在食管癌中,RUNX1a促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[17];在乳腺癌中,SNORA71C和RUNX1相互作用促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[18];在CRC中也有相應(yīng)的研究,如異常升高RUNX1有助于CRC癌變,有學(xué)者使用PrognoScan數(shù)據(jù)庫觀察到RUNX1的表達(dá)在CRC中起有害作用[19];RUNX1通過激活Hedgehog信號(hào)通路和ABCG2表達(dá)來促進(jìn)CRC增殖和化學(xué)抗性[20],上述研究表明RUNX1促進(jìn)CRC發(fā)展。

本文發(fā)現(xiàn)與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞比較,多種CRC細(xì)胞中RUNX1表達(dá)上調(diào),沉默TMPO-AS1或過表達(dá)miR-340-5p時(shí),RUNX1 mRNA和蛋白水平均被抑制,從而抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,表明RUNX1促進(jìn)HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。接著本文軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-340-5p與RUNX1存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),根據(jù)上述結(jié)果綜合分析猜測(cè)miR-340-5p靶向調(diào)控RUNX1表達(dá),為進(jìn)一步驗(yàn)證此猜想,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-340-5p靶向負(fù)調(diào)控RUNX1表達(dá),即表明miR-340-5p通過靶向負(fù)調(diào)控RUNX1從而抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜合分析,沉默TMPO-AS1靶向上調(diào)miR-340-5p表達(dá),從而下調(diào)RUNX1表達(dá),抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究尚存在不足之處,僅在細(xì)胞水平驗(yàn)證LncRNA TMPO-AS1調(diào)控miR-340-5p/RUNX1軸對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。