電針預處理對脂多糖誘導的認知障礙小鼠線粒體動力學的影響

陳夢潔 丁玲玲 炎茹玉 羅見生 寧甲齊 周瑞玲 于 波

首都醫科大學附屬北京中醫醫院麻醉科，北京 100010

圍手術期神經認知障礙（perioperative neurocognitive disorder，PND）指術前和術后1 年內出現的認知功能改變，會導致患者術后癡呆癥狀和死亡率增加，且尚無有效治療措施。神經炎癥是PND 的關鍵驅動因素，多種促炎性細胞因子，如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）已被證實與其密切相關[1-3]。小鼠腦室內注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）通過激活小膠質細胞增加促炎性細胞因子表達，最終引發認知障礙，此方法可有效建立炎癥相關PND 模型[4]。研究證實，電針預處理抑制神經炎癥、線粒體功能障礙和小膠質細胞活化，可有效減輕PND[5-7]。也有研究表明，術前針刺干預降低老年患者PND 發生率[8]。線粒體動力學指線粒體通過持續的分裂融合改變自身形態和數量以滿足細胞能量代謝及其他生物學功能的過程[9]。發動蛋白相關蛋白1（dynamin-relatedprotein 1，DRP1）和線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，MFN2）是線粒體分裂融合的關鍵調節因子，DRP1 募集到線粒體外膜形成環狀結構，通過切割線粒體膜分裂出不同大小的線粒體，MFN2 位于線粒體外膜，通過促進線粒體融合恢復線粒體功能[10-11]。本研究通過建立神經炎癥誘導的PND 模型，觀察電針對PND 小鼠DRP1 和MFN2 表達的影響，探討電針預處理改善脂多糖誘導的小鼠認知障礙的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10～11 周齡SPF 級雄性C57BL/6 小鼠45 只，體重25～27 g。購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010；合格證號：No.110324221104426272。飼養于北京市中醫研究所動物室，室溫22～24 ℃，濕度55%～65%。本研究通過首都醫科大學附屬北京中醫醫院實驗動物福利倫理委員會批準（BJTCM-M-2023-04-01）。

1.2 主要儀器及試劑

0.18 mm×13.00 mm 無菌針灸針（北京中研太和醫療器械有限公司）；華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；立體定位儀器（Kopf Instruments，Model900）；行為學軟件（寧波安來軟件科技有限公司）；流式細胞儀（美國Beckman，Cyto FLEXS）。LPS（美國Sigma，批號：SV30010）；JC-1 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C2006）；腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：S0026）；酶聯免疫吸附試驗試劑盒（美國RayBiotech，貨號：ELM-IL-1β，ELM-TNFα）；DRP1 兔抗（美國CST，貨號：#8570）；MFN2 兔抗（美國CST，貨號：#9482）；山羊抗兔二抗（美國CST，貨號：#7074）。

1.3 模型制備和分組

按隨機數字表法將小鼠分為對照組、模型組和電針組，每組15 只。模型組和電針組制備LPS 誘導的認知障礙小鼠模型，對照組注射2 μl 人工腦脊液。腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 ml/100 g）麻醉小鼠后，使用立體定位儀在右側腦室給藥，坐標為前囟向后0.5 mm，矢狀縫右側1.0 mm，深度2.0 mm[12]。LPS（2 μg）溶于2 μl 人工腦脊液（140 mmol/L NaCl，3.0 mmol/L KCl，2.5 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L Na2HPO4，pH=7.4）。顱骨鉆鉆開顱骨，10 μl 微量注射器針尖緩慢進入顱內，注射速度設置為0.667 μl/min，并將針頭保持在原位2 min，以使藥物充分擴散。以小鼠出現記憶下降視為造模成功[13]。

1.4 電針干預

電針組于造模前2 周行電針預處理，選取神庭、百會、足三里和內關（足三里和內關選取左側，電針干預1 周后換右側），小鼠清醒狀態俯臥位固定。穴位定位參考《實驗針灸學》[14]，神庭位于小鼠頭部前正中線，額頂骨縫交界線前方；百會位于頂骨正中；足三里位于膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm 處；內關位于前肢內側，腕關節上1 mm 左右的尺橈骨縫間。電子針療儀的刺激參數設為：疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，電流強度1～2 mA，以針柄震顫同時動物保持安靜狀態的針刺強度為佳，30 min/次，5 次/周，連續2 周。對照組和模型組僅固定，無電針刺激。

1.5 標本采集

在造模后6 h 取材，每組隨機取5 只小鼠用于檢測炎癥因子，2%戊巴比妥鈉按0.2 ml/100 g 腹腔注射麻醉后，剪開小鼠胸腔，暴露心臟，用0.9%NaCl 溶液（4℃預冷）灌注，當見右心耳溢出淡色液體，且肝臟及兩肺顏色變白時停止灌注。快速斷頭取出整個腦組織，其海馬組織勻漿，4℃下12 000 r/m（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清于-80℃冰箱保存待檢。行為學測試結束后，每組剩余的10 只小鼠立即取材，操作同上，獲取海馬組織。其中每組5 只小鼠新鮮海馬組織制備單細胞懸液，剩余5 只小鼠海馬組織于-80℃冰箱保存。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 曠場實驗評估自發活動和焦慮行為 造模后第1天，每組10 只小鼠完成曠場實驗后進行水迷宮空間探索測試。曠場實驗箱上方架攝像頭，將小鼠放置在正中央格，同時進行攝像和計時。記錄小鼠移動總路程，中央區停留時間和穿越中央區次數。

1.6.2 Morris 水迷宮評估小鼠的記憶能力 水迷宮分為4 個象限（①～④），平臺放置在②象限（目標象限）。小鼠在造模前接受隱藏平臺訓練連續5 d，4 次/d。小鼠被訓練在60 s 內爬上平臺，若未在60 s 內到達平臺，則被引導到平臺上站立15 s。空間探索試驗在撤離平臺的水迷宮中進行60 s 的測試。記錄穿越原平臺次數和目標象限停留時間百分比。

1.6.3 酶聯免疫吸附試驗檢測海馬組織炎癥因子水平 取海馬組織上清液，按照試劑盒說明，用酶標儀檢測標準品孔與樣本孔的光密度，依據標準曲線計算樣本中TNF-α、IL-1β 的水平。

1.6.4 流式細胞術檢測海馬MMP 水平 取海馬單細胞懸液至流式管，加入JC-1 工作液混勻、孵育、離心棄上清。緩沖液重懸細胞，并用流式細胞儀檢測。MMP較低時顯示綠色熒光，MMP 較高時顯示紅色熒光。計算綠色與紅色熒光強度的比值，比值升高表明MMP下降，比值降低表明MMP 升高。

1.6.5 化學發光法檢測海馬組織ATP 水平 取小鼠海馬組織，參照說明書裂解組織，配制ATP 工作液。每孔加入工作液，室溫放置5 min。孔內加上標準品或樣品，混勻后測定相對光單位值。根據標準曲線計算出樣品中ATP 的水平。

1.6.6 蛋白質印跡法檢測海馬組織中DRP1 和MFN2 的表達 取小鼠海馬組織加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和RIPA 裂解液，組織勻漿離心取上清。電泳，電轉和封閉后4℃過夜孵育一抗DRP1（1∶1 000）、MFN2（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）。次日加入二抗孵育1 h。以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，GraphPad 8.4.0 繪圖軟件作圖。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組曠場實驗結果比較

模型組移動總路程、中央區停留時間和穿越中央區次數與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。電針組移動總路程、中央區停留時間和穿越中央區次數與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 三組記憶能力比較

模型組穿越原平臺次數和目標象限停留時間百分比低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。電針組穿越原平臺次數和目標象限停留時間百分比高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 三組記憶能力比較（n=10）

2.3 三組海馬組織IL-1β、TNF-α 水平比較

模型組海馬組織IL-1β、TNF-α 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。電針組海馬組織IL-1β、TNF-α 水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 三組海馬組織IL-1β、TNF-α 水平比較（n=5）

2.4 三組海馬組織MMP 和ATP 水平比較

模型組海馬綠/紅熒光比值高于對照組，MMP、ATP 水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。電針組海馬組織綠/紅熒光比值低于模型組，MMP、ATP 水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 三組海馬組織MMP 和ATP 水平比較（n=5）

2.5 三組海馬組織DRP1 和MFN2 表達水平比較

模型組海馬組織DRP1 表達水平高于對照組，MFN2 表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。電針組海馬組織DRP1 表達水平低于模型組，MFN2 表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 三組海馬組織DRP1 和MFN2 表達水平比較（n=5）

3 討論

本研究中曠場實驗結果顯示，三組小鼠自發活動和焦慮行為比較，差異無統計學意義（P＞0.05），排除自發活動和焦慮行為對空間探索測試結果產生影響。空間探索測試結果顯示，模型組小鼠出現記憶障礙，炎癥相關PND 模型建立成功。本研究中，與模型組比較，電針組穿越原平臺次數和目標象限停留時間百分比增加，提示電針可改善LPS 誘導的記憶障礙。

有研究顯示，針刺神庭、百會、內關可降低老年患者術后譫妄發生率和炎癥反應[15]。針刺足三里可驅動迷走神經-腎上腺軸，促進抗感染物質釋放[16]。神經炎癥是PND 關鍵發病機制的觀點受到廣泛認可[17-18]。手術激活全身免疫反應導致小膠質細胞活化，進而釋放更多促炎性細胞因子，加劇神經炎癥和腦損傷[19]。本研究結果顯示，海馬組織中IL-1β 和TNF-α 含量在造模后6 h 增加，而電針預處理逆轉LPS 引起的炎癥因子增加，同既往研究一致[20]。

神經炎癥導致神經元線粒體功能障礙（MMP 和ATP 水平降低），受損的線粒體進一步放大炎癥反應，從而形成惡性循環[21]。線粒體功能障礙是神經退行性疾病相關認知障礙的突出病理特征，MMP 下降導致氧化磷酸化異常，進而影響神經元能量供應[22]。DRP1過表達引發線粒體碎片化，MFN2 表達下降導致線粒體融合缺陷，致使線粒體功能失調，腦缺血小鼠的死亡率增加[23-24]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠海馬MMP 和ATP 水平降低，DRP1 的表達增加，MFN2 的表達減少，提示LPS 引起線粒體功能受損，線粒體分裂融合的動態平衡被打破。研究表明，線粒體動力學失衡參與脛骨骨折內固定術小鼠的認知障礙，而海馬中DRP1 的表達量不變[25]。這與本研究結果不一致，可能是因為模型或檢測時間不同所致。與模型組比較，電針組小鼠海馬MMP 和ATP 水平增加，MFN2 的表達升高，DRP1 的表達降低，提示電針可改善線粒體功能，抑制線粒體過度分裂，促進線粒體融合。

綜上所述，電針改善LPS 誘導的認知障礙，減輕神經炎癥，其機制可能與調節線粒體動力學穩態有關。這些發現可為電針改善PND 增加新的理論依據及治療靶點。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。