醬酒1、2輪次窖池不同醅層微生態結構與酸性化合物組成解析及其相關性預測

萬旗鈺，程玉鑫，黃永光, ，佘榮書，鄧昌偉，左乾程

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省酣客君豐酒業有限公司，貴州 仁懷 564500）

醬香白酒具有獨特的釀造工藝，其復雜的釀造微生物群落構成了醬香白酒獨特的酒體風格，近年來廣受消費者歡迎[1-2]。醬香白酒無論是釀造過程中的酒醅還是成品酒，其代謝產物及風味物質中，酸類化合物占比較大，尤其是乳酸和乙酸，因此“酸高”成為醬香白酒一大特點[3]。釀造的7 個輪次周期中，前期輪次產酸微生物競相生長繁殖，造成酒醅酸度的不斷增加，后期輪次酸度趨向平穩，1、2輪次是釀造過程中酸度變化較大的時期[4]。因此研究醬香白酒1、2輪次酸類化合物種類及結構可進一步了解其變化趨勢。

Song Zhewei等[5]通過超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）和頂空固相微萃取-氣相-質譜聯用技術共鑒定出醬香型酒醅中12 種酸（主要是乳酸、乙酸和琥珀酸）。胡小霞等[6]通過高通量測序發現進入窖池發酵后，微生態很快由復雜的多菌屬生態結構演替為單一的以Lactobacillus為主導的生態結構。同時Delftia、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Burkholderia和Saccharopolyspora等結構主要會受酸度影響，因此酒醅酸度的變化會改變微生物群落的組成[7]。

由于發酵窖池較深，酒醅在輪次加工過程中均采用“分層起糟”的方式進行處理[8]。取自窖面的酒醅含羰基化合物較多，取自窖中的酒醅含大量多元醇物質，取自窖底的酒醅乙酸乙酯風味較重[9]。造成此差異的可能原因是窖池空間內微生物群落結構差異及變化，導致代謝產物具有差異[10]。但前期研究中鮮見采用分層采樣進行分析，缺少對窖池酒醅不同空間位置（上、中、底層）酸類化合物及微生物群落結構的研究。

本研究采用高通量測序技術及UPLC檢測技術解析了醬香白酒釀造過程中1、2輪次窖池發酵上、中、底層微生物群落及酸類化合物，對分析醬香白酒1、2輪次窖池不同空間位置酒醅微生物群落結構及酸類化合物種類和變化具有重要意義，旨在為傳統白酒固態發酵調控提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采自貴州省仁懷市酣客君豐酒廠制酒車間發酵窖池2021年12月—2022年2月，1、2輪次窖池發酵酒醅。

E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒 美國Omega BioTek公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；異丙醇、磷酸（均為分析純）天津市富宇精細化工有限公司；電泳緩沖液、Gengreen染料 北京金博益生物技術有限公司；氫氧化鈉（分析純）中國醫藥集團有限公司；亞鐵氰化鉀、硫酸鋅（均為分析純）天津市科密歐化學試劑有限公司；無水磷酸二氫鈉、冰乙酸、甲酸、無水檸檬酸（均為標準品，色譜級）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-乳酸、琥珀酸、L-酒石酸、無水草酸（均為標準品，色譜級）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州郎基有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠；旋渦震蕩儀華利達有限公司；超純水機 德國Think-lab公司；凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；自動點位滴定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；超高效液相色譜 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

1、2輪次窖池發酵周期為30 d，每隔5 d采樣（0、5、10、15、20、25 d和30 d）。樣品采集固定跟蹤一個窖池，按照窖池空間采集窖池上層酒醅、中層酒醅和底層酒醅，取樣點如圖1所示，上層按照A、B、C 3 個點采集，中層按照D、E、F 3 個點采集，底層按照G、H、I 3 個點采集，將同層采集的3 個樣品等量混合為該空間位置的混合樣品。研究共采集126 個發酵酒醅小樣，最終混合成42 個樣品。

圖1 窖池發酵酒醅取樣點Fig.1 Sampling points of fermented grains in the fermentation cellar

1.3.2 酒醅總酸含量及pH值測定

總酸含量根據GB 12456—2021《食品中總酸的測定》進行測定；pH值采用酸度計測定。

1.3.3 酒醅預處理及酸類化合物測定

樣品預處理參考郎召偉[11]的方法并做修改，準確稱取2 g酒醅（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，浸泡1 h后，8000 r/min離心15 min。取4 mL上清液加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和300 g/L硫酸鋅溶液各1 mL以去除蛋白，渦旋混勻，8000 r/min離心3 min。用注射器吸取上清液后使用0.22 μm針管式濾膜（水系）過濾上清液至液相小瓶中待測。

采用UPLC法檢測42 個待測樣液，參考文獻[12]方法并適當調整。UPLC條件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：20 mmol/L NaH2PO4溶液（pH 2.7）；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.25 mL/min；進樣量：1 μL。將標準品和樣品色譜圖進行對比，根據保留時間確定樣品中各組分的色譜峰，根據每次測定的標準稀釋曲線確定樣品中酸類產物的含量。

1.3.4 酒醅微生物總DNA提取、PCR擴增及高通量測序

參考文獻[5]報道的方法，首先，分別取樣品16 g于100 mL離心管中，加入3～5 顆玻璃珠和35 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，旋渦振蕩7 min，400 r/min低速離心5 min，吸取上清液至已滅菌的50 mL離心管中；其次，加入20 mL PBS至裝有樣品的100 mL離心管中，旋渦振蕩4 min，400 r/min低速離心5 min，收集上清液至已滅菌的50 mL離心管中；最后，將裝有上清液的50 mL離心管于離心機12000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞沉淀。預處理后每個樣品的總DNA提取步驟參考E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒的操作說明書。細菌PCR擴增引物：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）；真菌PCR擴增引物：ITS1FI2（5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。擴增程序：98 ℃預變性30 s，35 個循環（98 ℃變性10 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。擴增體系：Phusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL，正、反向引物各2.5 μL，DNA模板50 ng，使用dd H2O補齊體系至25 μL。

高通量測序得到RawData后，通過Overlap拼接雙端數據，并進行質控、嵌合體過濾等操作以獲得高質量的CleanData。同時，通過DADA2（divisive amplicon denoising algorithm）軟件重復操作以提高生物信息分析的質量。對具有100%相似性的有效序列進行聚類，并將這些序列分類為擴增子序列變體（amplicon sequence variant，ASV）。在各ASV特征序列的基礎上，進一步進行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等數據分析。采用Illumina MiSeq測序平臺，分別對細菌16S rRNA基因V3～V4區、真菌ITS3～ITS4區進行高通量測序分析，由聯川生物技術股份有限公司（杭州）協助完成。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均進行3 次重復。通過SPSS 22.0軟件進行數據處理及Spearman相關性分析；采用單因素方差分析判斷差異顯著性（P＜0.05）；利用Origin 8.6軟件繪制圖表，并進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 總酸含量及pH值變化

醬香白酒的固態發酵工藝導致微生物及風味物質空間分布存在差異[10]。隨著發酵的進程，2輪次整體pH值（3.585±0.035～3.790±0.010）比1輪次（3.715±0.050～4.597±0.050）低（圖2a、b）。其中1輪次pH值從5 d開始快速下降，2輪次從10 d開始快速下降，酒醅pH值下降表示此時微生物快速產酸。到達發酵30 d（發酵終點）pH值基本一致，說明最終兩個輪次的酒醅微生物到達所能耐受的最低pH值[13]。

圖2 1、2輪次窖池酒醅pH值及總酸含量變化Fig.2 Changes in pH and total acid in fermented grains during the first and second rounds of fermentation

1 輪次總酸含量（（0.379±0.005）～（3.706±0.005）g/kg）比2輪次總酸（（2.032±0.02）～（4.606±0.05）g/kg）低（圖2c、d）。多數發酵時間點上、中、底層總酸差異顯著，總酸變化規律多數為底層＞中層＞上層，說明底層生酸微生物占據生長優勢。

2.2 1、2輪次窖池酒醅酸類化合物結構及分布

從1、2輪次酒醅中共檢測出7 種主要酸類化合物（乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、草酸、檸檬酸和酒石酸）。如圖3所示，JYU、JYM、JYB分別為1輪次上、中、底層的酒醅樣品，1輪次酒醅中乳酸和乙酸始終保持優勢占比，其他酸類化合物占比較小。1輪次上、中和底層酒醅酸類化合物的含量存在規律性波動，均呈現先減少后增加趨勢，在30 d時達到最高值。乳酸含量為底層＞中層＞上層，上層從（5.888±0.265）g/kg（0 d）變化到（19.808±0.857）g/kg（30 d），中層從（6.558±0.416）g/kg（0 d）變化到（21.774±0.281）g/kg（30 d），底層從（6.753±0.342）g/kg（0 d）變化到（20.382±0.288）g/kg（30 d）；乙酸含量為中層＞底層＞上層，上層從（5.940±0.334）g/kg（0 d）變化到（15.761±0.566）g/kg（30 d），中層從（6.573±0.291）g/kg（0 d）變化到（16.505±0.057）g/kg（30 d），底層從（6.777±0.357）g/kg（0 d）變化到（21.639±0.498）g/kg（30 d）。其他酸類化合物含量均在（1.937±0.642）g/kg以下，并且在1輪次整個發酵過程中的變化較小。

圖3 1輪次窖池發酵酒醅中各酸類化合物含量變化Fig.3 Changes in organic acid contents in fermented grains during the first round of fermentation

如圖4所示，JEU、JEM、JEB分別為2輪次上、中、底層的酒醅樣品，2輪次與1輪次酒醅酸類化合物變化規律類似。乳酸含量為底層＞中層＞上層，上層從（5.937±0.541）g/kg（0 d）變化到（28.196±0.949）g/kg（30 d），中層從（6.490±0.365）g/kg（0 d）變化到（31.272±0.518）g/kg（30 d），底層從（6.769±0.387）g/kg（0 d）變化到（29.868±0.317）g/kg（30 d）；乙酸含量為上層＞中層＞底層，且差異明顯，上層從（5.940±0.414）g/kg（0 d）變化到（12.207±0.595）g/kg（30 d），中層從（6.648±0.512）g/kg（0 d）變化到（11.927±0.329）g/kg（30 d），底層從（6.491±0.395）g/kg（0 d）變化到（10.861±0.916）g/kg（30 d）。其他酸類化合物含量均在（3.505±0.861）g/kg以下。

圖4 2輪次窖池發酵酒醅中各酸類化合物含量變化Fig.4 Changes in organic acid contents in fermented grains during the second round of fermentation

乳酸可通過Lactobacillus進行的磷酸己糖途徑發酵產生[14]，乙酸主要由酒醅中Saccharomyces的醇酰基轉移酶途徑產生[15]。2 種酸具有優勢占比的原因可能是在發酵階段，Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Zygosaccharomyces bailii及Lactobacillusspp.均大量表達了丙酮酸代謝中與乙酸和乳酸相關的酶[16]，但不同空間結構微生物群落具有差異性[10]，因此，酒醅中乳酸和乙酸含量隨發酵時間和空間結構改變而發生變化。

2.3 細菌及真菌群系結構演替

2.3.1 基于屬水平細菌群落動態變化

白酒釀造發酵過程是微生物的代謝及調控過程，微生物在其中發揮著重要作用[17]。如圖5 所示，從1 輪次酒醅中共檢出150 個主要細菌屬，其中Limosilactobacillus是最主要的優勢菌群，其上、中、底層不同空間的平均相對豐度分別為46.59%、53.73%和52.06%；其次是Lactobacillus（27.74%、28.38%和27.15%）和Acetobacter（8.05%、6.19%和7.95%）。從2輪次酒醅中共檢出201 個主要細菌屬，Limosilactobacillus占絕對優勢，其相對豐度分別為73.98%（上層）、83.75%（中層）和89.87%（底層）。同樣，Wang Huan等[18]在醬香白酒釀造過程也觀察到Lactobacillus和Acetobacter為優勢細菌屬。Zhu Chutian等[19]揭示了不同地區大曲微生物群落和功能特征不同。任宇婷等[20]對比了3 種大曲優勢微生物群落，也發現大曲中Limosilactobacillus的平均相對豐度較高。本研究中檢出Limosilactobacillus，在其他醬香白酒報道中鮮有檢出，因此推測Limosilactobacillus可能來源于大曲。

圖5 1、2輪次窖池發酵酒醅中主要細菌屬相對豐度堆積柱狀圖Fig.5 Relative abundance of bacterial genera in fermented grains in the first and second rounds of fermentation

在發酵進程中不同時間上、中、底層酒醅微生物群系差異較大。1輪次發酵至5 d時Limosilactobacillus在上、中、底層的相對豐度分別為58.15%、58.05%和61.65%，25 d時相對豐度分別為32.56%、47.42%和16.16%；而Lactobacillus發酵至5 d時上、中、底層的相對豐度分別為27.81%、20.85%和33.76%，10 d時相對豐度分別為38.81%、43.27%和42.38%，25 d時相對豐度分別為25.56%、31.05%和16.20%。說明10 d后Lactobacillus取代Limosilactobacillus成為發酵優勢細菌屬，但隨著酒醅中酸類化合物的積累，對Lactobacillus自身造成一定的酸脅迫，當其細胞處于高濃度酸性環境中，胞內H＋逐漸積累使得pH值降低，會破壞嘌呤堿基的完整性，影響細胞生長、代謝相關酶的活性，最終導致Lactobacillus生長受限制甚至死亡[21]。因此，25 d時Lactobacillus的相對豐度減少。Acetobacter發酵至5 d時在上、中、底層的相對豐度分別為0.37%、2.47%和0.11%，10 d時相對豐度分別為8.30%、1.30%和0.51%，25 d時相對豐度分別為8.15%、2.92%和20.72%。隨著發酵時間的延長和總酸含量的增加，Acetobacter的相對豐度變化趨勢與Lactobacillus相反，Acetobacter在適應酸性條件時，可能逐漸對更高濃度的乙酸產生耐受性[22]。窖池酒醅發酵中乙酸的含量位居各類酸類化合物中第二，而Acetobacter可在高含量乙酸的環境中實現相對豐度的增加，說明Acetobacter具有良好的耐乙酸特性。

2.3.2 基于屬水平真菌群落動態變化

從1輪次酒醅中共檢出69 個主要真菌屬，2輪次酒醅中共檢出58 個主要真菌屬。1、2輪次真菌屬多樣性少于細菌屬。如圖6所示，隨著發酵周期進行，真菌屬多樣性及其相對豐度呈現下降趨勢，不僅醬香白酒發酵過程如此，在其他香型白酒發酵過程中也發現此趨勢[23]。說明在白酒釀造窖池發酵中細菌占據發酵優勢。1、2輪次酒醅中優勢真菌屬在上、中和底層的多樣性及相對豐度差異比細菌屬更大，可能是由于大多細菌為單細胞并具有鞭毛結構，可以在發酵過程中更加分散在空間各位置中[24]。

圖6 1、2輪次窖池發酵酒醅真菌屬相對豐度堆積柱狀圖Fig.6 Relative abundance of fungal genera in fermented grains in the first and second rounds of fermentation

1輪次酒醅中6 個優勢真菌屬，Saccharomyces是最主要的優勢菌群，其不同空間的平均相對豐度分別為54.27%、54.27%和58.82%，其次是Torulaspora（32.48%、30.81%和32.50%）。此外，Paecilomyces、Saccharomycopsis、Monascus和Thermomyces也是優勢菌屬。王琳[25]從窖池酒醅中檢出優勢真菌屬為Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Zygosaccharomyces和Monascus等，與本研究檢出優勢真菌屬一致，但上、中、底層優勢真菌屬結構及分布仍存在差異，且隨著發酵時間的延長，微生物量下降，真菌在發酵后期檢出量減少[26]。2輪次酒醅中共有8 個優勢真菌屬，主導優勢菌屬是Candida、Kazachstania和Saccharomyces。

由于醬香白酒屬于半開放式發酵，Paecilomyces、Penicillium和Monascus等霉菌屬可能來自釀造環境[27]。霉菌在1、2輪次酒醅上層占據優勢，在中層和底層的多樣性及平均相對豐度均有降低，而酵母屬在底層占據優勢，說明窖池底層環境的變化更適宜酵母菌生長，可能是因為酒醅底層的pH值較低，在酸性環境中酵母菌生長得更快[28]。這與之前研究中發現底層為更適宜酵母菌群生存的環境結果一致[14]。

2.4 1、2輪次窖池酒醅總酸及酸類化合物與微生物群落相關性

如圖7a、b所示，Limosilactobacillus與總酸和酸類化合物（乳酸、乙酸、甲酸、草酸、檸檬酸和酒石酸）呈顯著正相關（P＜0.05），說明除Lactobacillus產酸外，Limosilactobacillus也是發酵酒醅中產酸的主要優勢細菌屬[29]。Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lacti plantibacillus、Companilactobacillus、Ligilactobacillus、Levilactobacillus與酸類化合物呈負相關。一般而言，上述菌屬產酸能力較強，但在本研究中發現它們與酸性物質呈現負相關。醬香白酒固態發酵過程屬于酸性環境，隨著酸類化合物的增加，pH值降低，菌群在長期（發酵時間30 d）酸脅迫的防御機制中，細胞內精氨酸脫亞胺酶和天冬氨酸的積累以及耐酸反應使細胞質pH值降低，進一步使其糖酵解酶的活性被破壞，進而造成大分子物質（DNA和蛋白質）的結構損傷[30]，導致其生物量降低。并且在酸性發酵酒醅中，這些菌群與其他微生物也存在生物學競爭，也會導致其產酸能力的減弱，從而降低代謝活性[31]。此外，耐酸特性及其性狀也受到多個基因復雜的代謝網絡調節[32]。這可能導致酸類化合物的積累，造成這些細菌屬的生長受到抑制。Schizosaccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida和Kazachstania與酸類化合物呈正相關，說明真菌屬對酸類化合物的產生也有所貢獻。例如，酵母可通過糖酵解途徑分解糖類物質，生成酸類化合物如丙酮酸、琥珀酸[33]。但也存在少許真菌屬Saccharomyces、Paecilomyces和Torulaspora與酸類化合物呈負相關。根據相關性分析的結果，可以初步推斷1、2輪次酒醅中真菌群落促進酸類化合物的合成并使其抑制細菌群落的生長。有研究表明，高豐富度和多樣性的真菌群落有利于有機酸的產生，而過高的細菌群落會使揮發性風味物質降低[34]，從而導致醬香型白酒的質量降低。

圖7 酒醅中細菌和真菌與酸類化合物的相關性分析Fig.7 Correlation analysis of bacteria and fungi with acids in fermented grains

3 結論

醬香型白酒1輪次窖池發酵過程的總酸含量略低于2輪次，2 個輪次的總酸含量規律多為底層＞中層＞上層。從1、2輪次窖池酒醅中共檢出7 種主要的酸類化合物，乳酸和乙酸含量始終保持優勢占比，且不同時空窖池徑向層面上酸類化合物存在顯著差異。從醬香型白酒1輪次窖池發酵過程共檢出150 個主要細菌屬，69 個主要真菌屬。上層優勢細菌屬為Limosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lacti ptibacillus、Companilactobacillus、Ligilactobacillus、Levilactobacillus；中層優勢細菌屬為Limosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus、Com panilactobacillus；底層優勢細菌屬為Limosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus、Ligilactobacillus，Limosilactobacillus占絕對主導地位。上層優勢真菌屬為Saccharomyces、Torulaspora、Paecilomyces、Saccharomycopsis、Monascus、Thermomyces；中層優勢真菌屬為Saccharomyces、Torulaspora、Paecilomyces、Monascus；底層優勢真菌屬為Saccha romyces、Torulaspora、Paecilomyces。從2輪次窖池發酵過程中共檢出201 個主要細菌屬，58 個主要真菌屬。上層優勢細菌屬為Limosilactobacillus、Acetobacter、Virgibacillus、Lentilactobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus；中層優勢細菌屬為Limosilactobacillus、Acetobacter、Lactobacillus；底層優勢細菌屬為Limosilactobacillus、Aetobacter。上層優勢真菌屬為Candida、Kazachstania、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Thermomyces、Thermoascus和Saccharomycopsis；中層優勢真菌屬為Candida、Saccharomyces、Kazachstania、Schizosaccharomyces、Thermoascus、The rmomyces 和Penicillius；底層優勢真菌屬為Candida、Saccharomyces、Kazachstania、Schizosaccha romyces、Zygosaccha romyces、Penicillius、The rmoascus、The rmomyces和Saccharomycopsis。1、2輪次窖池發酵過程中微生物群系既存在相似性，同時差異性也較明顯。

細菌屬與大多酸類化合物（乳酸、乙酸、甲酸、草酸、檸檬酸和酒石酸）之間呈負相關，但Limosilactobacillus相對豐度與總酸和酸類化合物含量呈正相關。真菌屬中Schizosaccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida和Kazachstania相對豐度與酸類化合物含量呈正相關；Saccharomyces、Paecilomyces和Torulaspora相對豐度與酸類化合物含量呈負相關。此研究為醬香白酒窖池發酵不同時空徑向的微生物群系與酸類化合物相關性作用機制的研究提供了進一步理論參考。