魏斯氏菌胞外多糖在發酵食品中的應用進展

黃 倩，梁安健，朱鵬程，李東亮，唐俊妮,

（1.西南民族大學食品科學與技術學院，四川 成都 610225；2.四川中煙工業有限責任公司，四川 成都 610021）

發酵是世界上最古老且最經濟的食物制備方法之一，是一種利用微生物的生長、代謝以保存食物的技術[1]。發酵過程中微生物會產生各種天然活性物質，包括酶[2]、多糖[3]、細菌素[4]、有機酸等[5]。乳酸菌的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長過程中代謝到細胞外的一種天然高分子聚合物，根據多糖的組成可以將其分為同多糖（homopolysaccharides，HoPS）和雜多糖（heteropolysaccharides，HePS）兩類[6]。多糖具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、降膽固醇[9]、促進腸道平衡[10]等多種生物活性，還可以作為食品的增稠劑、乳化劑、穩定劑[11]。

魏斯氏菌（Weissella）主要存在于發酵的植物性食物[12]，從發現至今不過短短30 a，但相關研究表明，魏斯氏菌中的部分菌株具有高產EPS的能力[13-14]。從魏斯氏菌發酵產物中分離出的多糖種類繁多、功能各異，可用于食品加工過程，改善產品質量和產品特性，具有廣泛的研究意義。

1 魏斯氏菌簡介

魏斯氏菌屬于厚壁菌門、桿菌綱、乳酸菌目、明串珠菌科，細胞呈短桿、端圓或類球狀。其形態單個、成對或短鏈，屬于革蘭氏陽性菌，不運動，不形成內生芽孢，接觸酶陰性，不產生細胞色素[15]。其微觀形態及部分生理生化特征與明串珠菌、乳桿菌屬極其相似，在過去常被歸類于類腸膜明串珠菌屬（Leuconostoc paramesenteroides）。隨著分子生物學的進步，1993年德國學者Norbert Weiss發現魏斯氏菌與類腸膜明串珠菌屬DNA譜存在差異，在系統發育樹上屬于新的分支，后經23S rRNA測定也印證了這一發現，魏斯氏菌由此得名。

目前已經從環境中分離出包括類腸膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）、融合魏斯氏菌（W.confusa）、坎氏魏斯氏菌（W.kandleri）、耐鹽魏斯氏菌（W.ahalotolerans）等在內的25 種魏斯氏菌[16]（表1），主要來源包括3 個方面：動物的皮膚、糞便；人類的唾液、母乳、腸道；傳統發酵食品如泡菜、葡萄酒、香腸等[12]。

表1 魏斯氏菌的來源Table 1 Sources of Weissella

2 魏斯氏菌所產EPS的合成、分類、物理特性

魏斯氏菌所產的EPS功能與其結構有著密切聯系。Lakra等[39]從發酵面團中分離出的W.confusaMD1能產甘露聚糖，通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察發現該甘露聚糖表面光滑，呈現不規則排列的球狀結構，具有這樣結構的EPS能夠改善食品質地，可以作為乳化劑和增稠劑。Kavitake等[13]從發酵食品中分離的魏斯氏菌能產半乳聚糖，該多糖呈現淀粉樣球狀結構，且排列致密，具有海綿狀的疏松多孔結構。Du Renpeng等[40]從W.confusaH2中分離的右旋糖酐在電鏡下表面光滑，且具有片狀支鏈結構，片狀支鏈結構使得右旋糖酐具有改變食品流變性的功能。湯曉娟[41]從W.confusaQS813分離出的EPS在較低質量濃度（1 mg/mL）下呈現纖維狀結構，而在高質量濃度（5 mg/mL）下由于氫鍵間相互作用促進了分子聚合，高質量濃度下的多糖呈現片狀結構，這種獨特的結構說明該多糖能作為一種黏度增稠劑運用在食品加工業中。

2.1 魏斯氏菌所產EPS的合成途徑

大多數乳酸菌通過兩種不同的途徑合成EPS，分別是Wzx/Wzy依賴性途徑和蔗糖酶的細胞外生物合成途徑[42]。與細胞外合成途徑相比，Wzx/Wzy依賴性途徑合成的EPS更為復雜[43]。具體可以劃分為5 個步驟（圖1）。第1步是磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）將葡萄糖、半乳糖、乳糖等合成原料轉運至細胞內部，同時將單糖、二糖等原料磷酸化；第2步是EPS的活性產物形成，半乳糖-1-磷酸與葡萄糖-6-磷酸分別在半乳糖-1-磷酸尿酸轉移酶和葡萄糖磷酸變位酶的作用下合成重要中間產物葡萄糖-1-磷酸，再通過尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase）、UDP-半乳糖-4-表達異構酶等酶系的作用下分別合成UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和dTDP-鼠李糖[44]；第3步是重復單元的合成，處于細胞膜中的十一碳烯酚二磷酸酯錨定物將重復單元連接與組裝[45]；第4步是重復單元向胞外運輸，此過程的關鍵酶是翻轉酶（Wzx）[42]，將組裝好的重復單元運輸至周質空間或細胞外膜；第5步是重復單元的聚合與釋放，重復單元聚合成長鏈EPS，再釋放到細胞外部。

圖1 乳酸菌通過Wzx/Wzy依賴性途徑合成EPSFig.1 EPS biosynthesis process by Wzx/Wzy dependent pathway in LAB

2.2 魏斯氏菌所產EPS的分類和功能

大多數魏斯氏菌都具有產EPS的能力，且EPS產量較高。根據多糖的組成單位，又可將其分為HoPS和HePS[48]。如圖2所示，HoPS由單一連續重復的單糖組成，如由單一的D-葡萄糖、D-果糖組成葡聚糖、果聚糖[49]。相較于HoPS，HePS的組成復雜得多，HePS由3～8 種不同單糖組成，單糖種類包括L-鼠李糖、半乳糖等，在合成過程中還連接了部分有機物（如氨基酸、有機酸等）和無機物（如硫酸鹽、磷酸鹽等）[50]，不同乳酸菌所產EPS在結構和分子質量上都有較大的差異。

圖2 兩種不同類型多糖的分類及組成單位Fig.2 Classification and composition unites of exopolysaccharides

葡聚糖是魏斯氏菌產的一種EPS，葡聚糖的產生與葡聚糖酶密切相關，該酶催化蔗糖合成α-D-葡聚糖。菌株種類不同，產糖能力和糖的性質都有所不同。赫倫魏斯氏菌（W.hellenicaSKkimchi3）所產葡聚糖產量為77 g/L[14]，而優化發酵條件后的W.confusa的EPS產量高達97.5 g/L；食竇魏斯氏菌（W.cibariaPDER21）[51]產出的α-D-葡聚糖在300 ℃時可以保持優異的熱穩定性，其抗氧化活性可達89.5%，持水能力為103.7%，水溶性指數為80.7%，具有優越的抗氧化和持水性能。

產右旋糖酐是魏斯氏菌的一個典型特征，右旋糖酐是由葡萄糖脫水縮合而成的一種生物多糖，屬于葡聚糖的一種，由重復的α-D-吡喃葡萄糖單元（主要含有α-1,6-糖苷鍵）構成[52]，主要通過其側鏈的不同分支進行區分。Du Renpeng等[40]采用葡聚糖凝膠柱（Sephadex G-100）純化了W.confusaH2所產EPS，該多糖是由葡萄糖通過α-1,6-糖苷鍵構成的右旋糖酐，SEM圖像呈現不規則片狀凸起，高度在5～30 nm之間、分子排列緊密，說明所產右旋糖酐與水有較強的親和力。Zhao Dan等[53]從W.confusaXG-3中分離出的右旋糖酐也得到了類似的結果。右旋糖酐的片狀分支可以改變食品的流變性質，對于蛋白凝膠的保水性和色澤都有較好的改善作用[54]，因此，可用于食品加工行業。

除了上述的兩種EPS外，魏斯氏菌還具有產半乳聚糖、果聚糖、甘露聚糖等其他種類多糖的能力。Kavitake等[55]從W.confusaKR780676分離的半乳聚糖在處理酵母突變細胞模型中展現了強大的抗氧化能力（對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和一氧化氮具有較高的清除活性，半清除活性分別為450 μg/mL和138 μg/mL）、抗細胞凋亡能力（抑制Pep4和Fisi1蛋白的表達）和抗衰老能力（釀酒酵母BY4741野生型菌株的細胞活力增加了8.0%，Sod2基因表達活性增加了10%～15%）。優化生長條件的W.cibariaMD2產果聚糖的能力可達12.58 g/L，該多糖熱穩定性較高，降解溫度可達279.90 ℃，能夠促進壽命調控因子（DAF-16基因）的核定位，增加秀麗隱桿線蟲的抗氧化能力[39]。W.confusaMD1所產甘露聚糖由單一的甘露糖構成，呈現疏松多孔球狀結構，對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、傷寒沙門菌所產生的生物被膜有較強的破壞性，可用于食品加工中致病菌的防控[56]。

2.3 魏斯氏菌所產EPS的結構和物理特性

EPS的性質和功能主要取決于多糖的結構和官能團。多糖結構分為初級結構和高級結構，初級結構主要涉及主鏈和支鏈的組成，高級結構則涉及主鏈的構象和多糖間非共價鍵作用[57]。采用傅里葉變換中紅外光譜對魏斯氏菌所產的多糖進行結構分析和鑒定，通過分析化學鍵的拉伸振動，判斷多糖的結構變化。Lakra等[39]發現EPS MD2在3464.55 cm－1附近出現了寬拉伸峰，這歸結于多糖中含有的羥基；2931.65 cm－1處出現的較弱吸收峰、1676.9 cm－1處的特征吸收峰，分別是由于C—H的拉伸振動及C＝O基團的不對稱拉伸引起；900～1200 cm－1范圍內出現的1157.8 cm－1和1046.8 cm－1兩個吸收峰分別歸因于C—OH基團和糖苷鍵的C—O—C拉伸振動；832.4 cm－1出現吸收峰說明EPS MD2結構中含有呋喃環。Yilmaz等[51]的研究也發現魏斯氏菌所產的EPS結構中含有羥基和C＝O基團。

魏斯氏菌所產EPS的熱穩定性與其結構有密切關系。相關學者在對EPS進行熱穩定性分析時發現，EPS的熱重變化具體可以分為兩個階段[58]。第1階段出現在0～90 ℃，在此階段水分損失較少，只有11.64%；第2階段則出現在209～320 ℃，質量分數會下降25.35%[42]。第1階段的質量損失只與EPS結構中的羧基相關，羧基易與水發生結合和分離，溫度升高導致EPS中的結晶水揮發；第2階段的質量損失則是由于C—O和C—C等化學鍵斷裂，高溫下多糖降解，釋放出CO、CO2、H2O等[59]。食品加工企業對產品的加工溫度大概在80～200 ℃，因此，熱穩定性較好的魏斯氏菌EPS可作為品質改良劑進行運用。

3 魏斯氏菌所產EPS在發酵食品中的應用

魏斯氏菌發現時間較短，對其特性的研究較少，且目前仍未被歐洲食品安全管理局納入安全資格認定的列表中。但國內外有學者研究證明其具備成為益生菌的潛力[36-37]。乳酸菌生產的EPS通常被認為是安全的，這意味著它們可以用于食品加工、益生元生產和醫學應用。

3.1 EPS作為乳化劑在食品中的應用

乳化劑是將兩種互不相溶的液體（水和油）進行混合，形成穩定、均勻分散體的物質[60]。多糖親水鏈上連接的疏水基團使得多糖具有兩親性，能夠作為天然乳化劑。EPS作為乳化劑具有多種優點，具體表現為來源廣泛、結構穩定，還能以自身黏度保持乳液的穩定[61]。Yalmanci等[62]將明串珠菌多糖添加于低脂蛋黃醬中，3%的添加量就能改善產品的流變特性和穩定性。從海藻中分離出的菌株Rhodobacter johriiCDR-SL7Cii具有產EPS RH-7的能力[63]，純化后EPS的水溶液（0.1%）在25 ℃時黏度為8.2 cP，其乳化活性與黃原膠相當，且在高堿（pH 9.0）、高溫（80 ℃）條件下也能維持較好的乳化活性。

多糖可以通過形成多糖-蛋白質雙層界面改變乳液界面、凝膠性質、流變學屬性，增強由蛋白質穩定的乳液穩定性[60]，魏斯氏菌屬所產EPS同樣具有良好的乳化性能。Kavitake等[64]從菌株W.confusaKR780676中分離純化的EPS對花生油和橄欖油有突出的乳化活性和乳化穩定性，且較低濃度的EPS就能達到較好的乳化效果。Devi等[65]針對W.confusaKR780676菌株所產EPS也開展了相關研究，結果顯示該多糖對葵花籽油乳化活性可達69.4%，由該多糖制成的懸濁液在15 d內能保持良好的穩定性。從W.cibariaPN3可以分離出兩種不同的表面活性劑，一種存在于細胞內部，一種分泌至細胞外[66]。通過優化生產工藝，最大產量分別可達1.46 g/L和1.99 g/L，產生的表面張力可達31～33 N/m，臨界膠束質量濃度分別為1.6 g/L和3.2 g/L，對棕櫚油、大豆油等都有較好的乳化活性。魏斯氏菌所產的EPS乳化能力不僅與菌株所產多糖的品種相關，與食品加工過程中的溫度、酸堿度、鹽離子種類和濃度密切相關。

通過人工感官分析可知，配方A的得分為7.82，該配方A香精色澤和均勻度都很好，能達到食品香精的外觀要求。且該香精的香氣也能在一定程度上反映百香果的天然氣味。但是，調配一個好的食品香精就是要讓最終的香精主體突出，散發出來的香氣整體協調、豐滿，頭香、體香、基香過渡自然且有層次感，同時要保證聞到的是一股混合的香氣，讓人能聯想到自然的食品的味道，不能讓人聞到單一組分的香氣[9]。根據評香人員對配方A的感官評價得出：直接根據固相微萃取方式得到百香果香氣能突出百香果果香的主體，但是聞到的香氣比較分散，香氣整體不夠協調。

3.2 EPS作為抗氧化劑在食品中的應用

在生物細胞代謝過程中，氧化作用是一個重要的生理過程，在此過程中會產生大量的自由基和超氧陰離子，參與細胞間信號傳遞和遺傳表達[67]。當氧化-還原反應平衡被打破時，機體就會出現蛋白質、核酸、脂質損傷，引發各種慢性疾病。魏斯氏菌所產多糖較為突出的生物特性為抗氧化性。從W.confusaOF126分離純化的EPS在4 mg/mL劑量下，對羥自由基的清除活性為（86.50±0.02）%，顯著高于同劑量的抗壞血酸（83.10±0.09）%[49]；對DPPH自由基的清除活性隨EPS質量濃度的增加而增加。通過乙醇沉淀、脫蛋白后從W.cibariaPDER21培養物中分離出了EPS-1、EPS-2、EPS-33 種多糖[59]。在質量濃度5.0 mg/mL條件下，EPS-1和EPS-3對DPPH自由基的清除能力分別達到82.0%和42.2%；同質量濃度下，EPS-1和EPS-3對羥自由基的清除能力分別為50.5%和31.8%，對超氧陰離子自由基的清除活性分別為67.2%和52.5%。從韓國泡菜中分離的W.cibariaSY003，所產EPS在較低質量濃度時（1 mg/mL）對2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的清除活力能達到90%[68]。

EPS的抗氧化機制至今尚未明晰，但其抗氧化活性受多種因素的影響，如單糖組成、分子質量或官能團[69]。帶負電荷的基團使EPS處于酸性環境中有利于發生水解反應，暴露更多具有良好抗氧化性能的半縮醛羥基[70]。也有報道稱EPS中所含的甘露糖可能使其具有較強的抗氧化活性[71]，這可能是因為甘露糖更容易獲取異位上的氫。魏斯氏菌所產的EPS對DPPH自由基、羥自由基、ABTS陽離子自由基都有較強的活性，在一定程度上還能抑制脂肪氧化，因此，可以將其純化用于食品中，制備具有抗氧化活性的功能性食品。

3.3 EPS作為抗冷凍劑在食品中的應用

“冷鏈”已經成為連接家庭和生產企業的樞紐，但傳統冷凍方法的降溫速率較慢，冷凍過程中容易形成的粗大、不規則的冰晶體，會破壞凍藏產品的細胞結構，導致產品出現質構損傷、營養物質損失等問題。早有研究表明，微生物所產的EPS不僅可以包裹菌體本身，提高菌體抵抗反復凍融的能力[72]，也能夠顯著抑制冰晶再結晶[73]，從而使EPS作為食品中的抗冷凍劑成為可能。

已有學者將魏斯氏菌所產EPS添加至發酵面團中，研究冷凍貯藏過程中面筋蛋白的變化。如Tang Xiaojuan等[74]從傳統酸面團中篩選出1 株高產EPS的W.confusaQS813，利用篩選出的菌株制作純菌發酵的酸面團，應用于冷凍饅頭的制備。研究結果顯示，添加1% EPS的淀粉凝膠在經過凍融循環處理后仍能保持較為均勻、致密的網狀結構，還能延緩由于冰晶造成的水分遷移。在凍融循環處理的發酵面團中添加魏斯氏菌產生的EPS，可增強谷蛋白大聚合體聚集（產量增加0.88%）、延緩其降解速率（可以降低3.07%），同時還能增加游離巰基的含量[75]。EPS和酸面團的酸化協同作用抑制了淀粉凝膠內冰晶的形成、重結晶及淀粉分子的聚集和解聚，延緩了水分遷移，從而抑制了支鏈淀粉的長期回生，降低了老化速率；EPS側鏈殘基又能與面筋蛋白通過化學鍵結合，減少由于反復凍融導致的蛋白結構出現形變，進一步改善凍融發酵面團的產品質量。

運用乳酸菌產的EPS制作傳統面包已經有數十年的歷史，多糖具有替代親水膠體的潛力，能夠減少面團由于冷凍造成的品質劣變；同時，發酵過程中所產的EPS是一種天然品質改良劑，符合現代人民追求健康、無添加產品的需求。低分支度、高分子質量的EPS對發酵面團的改善作用效果更好[76]。

3.4 EPS作為風味改良劑在其他食品中的應用

在醬油、泡菜、白酒、魚醬等食品發酵過程中，耐鹽性魏斯氏菌可以將葡萄糖轉化成乳酸，形成的特殊香味物質讓發酵食品變得更為醇香，還能使發酵食品的口感更加醇厚、色澤更為鮮亮。W.cibaria是泡菜自然發酵前期的優勢菌株，張楠笛等[77]使用食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌共同發酵，在發酵前期（0～4 d）可以迅速提升泡菜體系中乳酸菌產乳酸和乙酸的含量，改善泡菜產品發酵風味，提升產品品質；發酵過程中產生的揮發性物質總質量濃度為6.096 mg/L，顯著高于植物乳桿菌單一發酵組（3.188 mg/L）。魏斯氏菌用于醬油發酵過程中可以增加揮發性脂肪酸的含量，改善醬油的口感和風味；所產EPS對醬油中α-型和（或）β-型多糖的合成有一定貢獻，賦予醬油更多益生作用[78]。陳紹依等[79]對茅臺鎮不同大曲的菌落結構和生產性能進行對比，發現魏斯氏菌屬作為發酵過程中的優勢菌株，與酯化力、液化力、糖化力、乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、正戊醇呈正相關，是影響大曲糖化力、液化力和酯化力的主要菌群，賦予大曲特殊風味。在酸奶中添加EPS與魚明膠進行協同發酵，可以使酸奶蛋白網狀結構更加致密，特征揮發性風味物質如雙乙酰、2-壬酮、2,3-戊二酮等含量明顯增多，感官品質得以提升[80]。

4 魏斯氏菌作為益生菌在食品中的應用潛力

細菌所產EPS除了能作為食品加工過程中的乳化劑、抗氧化劑、抗冷凍劑、風味改良劑外，還具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性。魏斯氏菌能夠在腸道中定植、溶血試驗呈現陰性、消除豆類食品中的抗營養因子[16]，這些特質都表明魏斯氏菌具有益生菌的潛能。騫宇等[81]對食竇性魏斯氏菌在環境脅迫下的生長狀況進行研究，結果顯示食竇性魏斯氏菌對酸、溫度、人工胃液、NaCl的耐受性較好，在0.1%膽鹽環境中可保持70%的活性。Kumari等[82]從奶酪中分離出具有產EPS能力的魏斯氏菌W.cibariaCH2，該菌株在人工胃液中保持180 min后，活菌數僅下降5.3%，經人工腸液處理240 min后仍有較高活性，在對其基因組進行分析時發現具有降膽固醇，合成維生素、必需氨基酸和β-半乳糖苷酶的基因。Park等[83]從W.confusaVP30分離出EPS用于便秘小鼠模型中，發現該EPS可以有效改善小鼠便秘情況。李文等[84]從泡菜中分離的魏斯氏菌W.hellenicaWS-419對甘油三酯分解能力可達42.8%，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有良好的抑菌效果。從泡菜中分離的另一種食竇魏斯氏菌不僅能夠清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基，還能夠有效降解泡菜中的亞硝酸鹽，降解率最高可達99.5%。Kibar等[27]純化了W.cibariaEIR/P2所產的EPS，發現該多糖對變性鏈球菌所產生物被膜的抑制活性可達70%，能夠促進牙周細胞組織的愈合和再生。

魏斯氏菌可在腸道中定殖，調節腸道免疫反應，維持腸道微生物平衡，還能通過其代謝產物調節宿主的腸道上皮屏障功能，增強宿主健康[85]。同時，魏斯氏菌能夠產細菌素抑制病原微生物生長、分泌EPS破壞生物被膜的完整性、產有機酸從而營造低pH值環境等干擾病原菌的代謝[86]，這些均證明魏斯氏菌具有成為益生菌的潛力。

5 結語

魏斯氏菌發現的時間較短，但作為乳酸菌，它具有產EPS、有機酸、細菌素的能力，不僅可以改善食品品質、增強食物風味、改善食物流變性質，還能抑制有害菌生長，平衡腸道微生物環境。

乳酸菌所產的生物多糖不僅被證實對多種食品具有品質改良作用，能夠改善發酵食品的質地和風味，還能夠抗氧化、吸附重金屬[87-88]，因此可將其應用在食品工業、醫療業和農業領域。但乳酸菌生產EPS屬于自然發酵過程，具有發酵時間長、成本高、產量低等缺點，部分魏斯氏菌具有高產EPS的能力，未來可以通過分子生物學技術、基因組學技術等構建高產EPS的菌株，能夠解決EPS產量少、應用范圍窄等問題，為推廣EPS的應用和功能性產品的開發提供強有力的支持。