大豆蛋白強化羧甲基纖維素鈉復合油凝膠的性能

崔夢琦，單冠程，孫若涵，田 波，隋曉楠

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

油凝膠是一種半固態(tài)油，它是通過將液態(tài)油固定在由凝膠劑和穩(wěn)定劑形成的三維網(wǎng)絡中形成，能夠降低脂肪遷移率、消除飽和及反式脂肪酸的危害。因此，油凝膠被視為傳統(tǒng)固體脂肪的理想替代物，受到各領域研究人員的青睞。最常用的油凝膠化方法是將膠凝劑在高于熔點的溫度下分散在油中，然后冷卻使膠凝劑結晶或自組裝形成三維網(wǎng)絡結構固定油，常用的膠凝劑有結晶顆粒網(wǎng)絡（脂肪醇[1]、植物蠟[2]等）、自組裝體系（12-羥基硬脂酸[3]、卵磷脂[4]等）和聚合物網(wǎng)絡（乙基纖維素[5]）。然而，制備過程中的高溫處理不僅對油中的熱敏性成分降解，而且還會導致油的進一步氧化。此外，較高含量膠凝劑的添加也不利于其在食品中的應用[6]。

氣凝膠模板法是制備油凝膠的一種間接方法，它是將聚合物預先水合以形成水凝膠，然后將其干燥獲得聚合物網(wǎng)絡骨架并將其作為吸油的多孔材料。以氣凝膠為模板制備油凝膠只需要經(jīng)過簡單的物理吸附，這意味著它避免了劇烈的理化處理，可以更安全地負載油脂及營養(yǎng)物質。同時，氣凝膠骨架具有較高的機械強度和高孔隙率等優(yōu)異的結構性能，能夠獲得高吸油率和高強度的油凝膠。近年來，基于生物相容性的天然大分子如多糖、蛋白質等已被廣泛研究用于構建氣凝膠模板，而后通過物理吸附以得到固化油凝膠。Manzocco等[7]以κ-角叉菜膠氣凝膠為模板，得到最大吸油量為80%的高強度油凝膠。Chen Kailun等[8]通過美拉德反應制備了海藻酸鹽/大豆蛋白復合物氣凝膠，然后將其浸入玉米油以獲得具有優(yōu)秀乳化能力和乳液穩(wěn)定性的油凝膠。

羧甲基纖維素（carboxyl methyl cellulose，CMC）是一種陰離子長鏈多糖，其具有良好的凝膠性、生物相容性和穩(wěn)定的內部網(wǎng)絡結構。Tang Shuaishuai等[9]通過干熱處理得到羧甲基纖維素鈉（carboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）/卵清蛋白（egg white protein，EWP）共聚物，并研究了不同接枝率對EWP/CMC-Na氣凝膠機械性能和載油性能的影響。Jaberi等[10]使用卵清蛋白和黃原膠復合物制備了高機械強度和高持油率的油凝膠。Le等[11]研究了黃原膠和β-乳球蛋白在靜電吸引作用下誘導形成網(wǎng)絡的凝膠化機制，發(fā)現(xiàn)黃原膠能提供凝膠組織框架，而β-乳球蛋白則作為交聯(lián)劑參與網(wǎng)絡的形成。綜上，蛋白質和多糖可以通過相互作用聚合形成穩(wěn)定的復合物，從而提高凝膠的力學性能。

本研究通過添加大豆蛋白球狀顆粒包裹纖維素形成穩(wěn)定的復合物以制備高彈性、高強度的脂肪模擬物，并探究不同蛋白添加量對CMC-Na油凝膠性能的影響。使用平均粒徑、宏觀和微觀形態(tài)、紅外光譜、吸油能力、持油能力和質構特性評價油凝膠，此外還對油凝膠的抑菌能力和氧化穩(wěn)定性進行分析測定。本研究提出基于球狀蛋白-長鏈纖維靜電吸附結合制備油凝膠的方法，用以改善油凝膠性質，提高其強度和彈性，旨在為多糖-蛋白聚合物強化油凝膠及其進一步的應用提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）由實驗室自制；CMC-Na（黏度1500～3100 mPa·s）上海麥克林公司；無水檸檬酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葵花籽油購自當?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-18N/A冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TA.XT Plus C質構儀 英國Stable Micro Systems公司；Nicolet is50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TM 4000臺式掃描電子顯微鏡日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 CMC-Na/SPI復合溶液的制備

將CMC-Na溶解在去離子水中，質量分數(shù)為1.5%，1000 r/min磁力攪拌1 h，得到均勻的溶液，向溶液中加入SPI粉末制備不同質量比的CMC-Na/SPI溶液（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4），然后向混合溶液中加入質量分數(shù)0.15%的檸檬酸，繼續(xù)攪拌至完全溶解，得到復合溶液。

1.3.2 氣凝膠制備

將樣品溶液倒入內徑13 mm、高15 mm的中空圓柱體中，在－20 ℃預凍5 h。在真空條件下（＜5 Pa）于－58 ℃在凍干機中冷凍干燥24 h，制備氣凝膠，將獲得的氣凝膠于150 ℃加熱5 min以使CMC-Na氣凝膠在檸檬酸的作用下交聯(lián)，放置在干燥器中備用。

1.3.3 氣凝膠密度測定

準確稱量氣凝膠樣品的質量，并測定體積。根據(jù)式（1）計算其密度：

式中：m為氣凝膠的質量/g；V為氣凝膠的體積/cm3。

1.3.4 復合物平均粒徑的測定

參考董亞博等[12]的方法，并稍作修改。測定前用溶液等pH值的去離子水將CMC-Na溶液和不同比例的CMC-Na/SPI溶液（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4）稀釋100 倍，以避免聚集。

1.3.5 氣凝膠的微觀形態(tài)

為了分析氣凝膠的內部結構，將樣品切成薄片，并將其由雙面膠黏附在觀察臺上，將樣品表面噴金后，使用掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀形態(tài)。

1.3.6 FTIR測定

參考Huang Guo等[13]的方法，將SPI、CMC-Na和CMC-Na/SPI復合物的溶液冷凍干燥后充分研磨成粉末。在4000～500 cm－1的頻率范圍內進行掃描，掃描32 次，分辨率為4 cm－1。

1.3.7 吸油動力學分析

參考Khosravi等[14]方法，氣凝膠底面接觸葵花籽油開始計時，每隔2.5 s取出一次氣凝膠，待表面葵花籽油滴完全滴落后，稱質量，直至質量恒定。通過記錄吸油過程中每個時刻油的質量，確定吸油量與時間的相關性。

1.3.8 吸油能力分析

準確稱量氣凝膠，然后浸入葵花籽油中。通常，在浸入30 s內，吸收過程達到平衡以形成油凝膠。吸收過程完成后，取出油凝膠，自然滴落30 s，去除表面多余的油，立即對油凝膠稱質量。吸油量通過式（2）計算：

式中：m0為氣凝膠的質量/g；m1為油凝膠的質量/g。

1.3.9 持油能力分析

參考Manzocco等[7]的方法，測定油凝膠的持油能力。將1.5 g油凝膠樣品置于兩塊濾紙之間，然后放入50 mL離心管中，8000 r/min離心20 min。根據(jù)式（3）計算持油率：

式中：m1為離心前油凝膠的質量/g；m2為離心后油凝膠的質量/g。

1.3.10 質構測試

參考Wang Yihui等[15]的方法，并稍作修改。使用直徑為36 mm的圓柱探頭（P 36R）進行質構分析。使用全質構分析模式對樣品進行壓縮測試，測試前速率為2.0 mm/s，測試中速率為1.0 mm/s，測試后速率為2.0 mm/s，觸發(fā)力為5.0 g，壓縮程度設定為80%。

1.3.11 抑菌物質釋放能力評估

參考Liu Yuyu等[16]的方法，使用圓盤擴散法統(tǒng)計含有質量分數(shù)5%肉桂醛的葵花籽油凝膠對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC 25922和革蘭氏陰性菌大腸桿菌CMCC 26003的抑制區(qū)，以評估抑菌物質的釋放能力。將直徑10 mm的油凝膠置于接種了105CFU/mL微生物的瓊脂平板鉆孔中，并在37 ℃孵育過夜。使用納米測量器1.2軟件對樣品周圍形成的抑菌圈直徑進行測量。

1.3.12 貯藏穩(wěn)定性

將液態(tài)油和新鮮制備的油凝膠在黑暗中于50 ℃貯藏14 d。每隔1 d測量一次樣品，以評估油凝膠和液態(tài)油的氧化穩(wěn)定性變化。

1.3.1 2.1 過氧化物值（peroxide value，PV）的測定

參考Pan Haibo等[17]的方法，將200 mg油凝膠溶解在1.5 mL異辛烷和異丙醇（異辛烷和異丙醇的混合比例為3∶1，V/V）的混合物中，充分振蕩以提取油，5000 r/min離心2 min，取上層清液0.2 mL，加入到2.8 mL甲醇-丁醇混合液（2∶1，V/V）中，隨后分別加入20 μL 3.94 mol/L的硫氰酸銨溶液和20 μL Fe2＋溶液（等體積的0.132 mol/L BaCl2溶液和0.144 mol/L FeSO4溶液混合制備），混合后避光20 min，于510 nm波長處測定吸光度，根據(jù)Fe3＋標準曲線計算樣品中過氧化物的濃度。

1.3.1 2.2 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的測定

參考Du Chenxing等[18]的方法，并稍作修改。在離心管中加入200 mg油凝膠，然后加入4 mL TBARS測試液（包含0.375%的硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 mol/L鹽酸溶液），將混合液在沸水中加熱60 min后取出，冷卻至室溫，8000 r/min離心15 min，在532 nm波長處測定上清液吸光度。通過1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準曲線計算樣品中TBARS的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 CMC-Na/SPI復合溶液的平均粒徑分析

粒徑是反映聚合物在水溶液中相互作用的重要指標之一[19]。由表1可知，CMC-Na溶液平均粒徑為（317.47±11.86）nm，隨著蛋白添加量的增加，CMC-Na∶SPI＝1∶4溶液的平均粒徑增長到（1561.33±10.70）nm，表明蛋白與多糖成功復合。此時溶液pH值為5.5左右，高于大豆分離蛋白的等電點（isoelectric point，pI）4.5。Souza等[20]認為當系統(tǒng)的pH值略高于蛋白質等電點pI時，蛋白質與多糖會形成以靜電相互作用為特征的可溶性復合物。這表明大豆分離蛋白上帶有正電荷的區(qū)域或分子片段可與CMC-Na的陰離子基團發(fā)生靜電相互作用[21]。蛋白質顆粒吸附于CMC-Na長鏈表面形成復合物，提高長鏈強度的同時形成均一、穩(wěn)定的復合物溶液。

表1 不同多糖蛋白比例溶液的平均粒徑與氣凝膠密度Table 1 Average particle size and aerogel density of CMC-Na/SPI mixed solutions at different ratios

2.2 氣凝膠微觀結構分析

氣孔的形態(tài)與分布會顯著影響油凝膠吸油、持油、機械強度等性能。由圖1可知，添加蛋白后，蛋白質作為結構強化劑，吸附在纖維絲表面，逐漸將其包裹。隨著蛋白比例的增加，蛋白沿纖維絲表面不斷沉積形成片層結構。在低蛋白含量下，可以觀察到纖維絲被一些蛋白顆粒黏附，在CMC-Na∶SPI＝1∶2時，纖維素開始被大豆蛋白完全包覆，蛋白含量的進一步增加導致了吸附蛋白厚度的逐漸增加[22]。由掃描電鏡圖可以看出，隨著大豆蛋白的不斷加入，氣凝膠結構變得更加致密，孔徑大小和孔隙度隨著蛋白含量的增加而降低，CMC-Na∶SPI＝1∶4時氣凝膠呈現(xiàn)出最致密的結構。這佐證了粒徑分析中SPI與CMC-Na之間發(fā)生靜電吸附形成蛋白質-多糖復合物，這些結果表明，CMC-Na為氣凝膠提供了彈性網(wǎng)絡骨架，而SPI作為一種結構強化劑沿著CMC-Na鏈聚集。

圖1 不同蛋白含量氣凝膠的微觀結構Fig.1 Microstructure of aerogels with different protein contents

2.3 FTIR分析

為進一步分析聚合物形成過程中CMC-Na和SPI之間的相互作用，測定了CMC-Na溶液在不同SPI添加量下的FTIR光譜。由圖2可知，聚合物氣凝膠的光譜表現(xiàn)出SPI和CMC-Na的特征峰。SPI的主要譜帶有酰胺A帶（3285 cm－1，O—H或N—H伸縮振動）、酰胺I帶（1655 cm－1，C＝O伸縮振動）、酰胺II帶（1537 cm－1，N—H彎曲變形和C—N伸縮振動）。酰胺I帶和酰胺II帶被認為是蛋白質二級結構的敏感區(qū)域[23]。1061 cm－1附近是多糖分子中C—O—C伸縮振動的典型特征峰，SPI在此處無吸收峰。聚合物在1655 cm－1和1537 cm－1處的吸收峰隨著蛋白含量的增加而增大，說明CMC-Na和SPI成功結合。在1061 cm－1左右的吸收峰隨著大豆蛋白含量的增加而減小，表明CMC-Na的羧基與SPI的氨基之間可能存在靜電相互作用，同時靜電相互作用的形成也促進了酰胺I帶的弱位移[20]。1712 cm－1處的尖峰為酯基的C＝O拉伸，表明纖維素的羥基與檸檬酸的羧基發(fā)生了交聯(lián)。一般認為此時多元羧酸先脫水形成環(huán)酐，然后與纖維素分子鏈上的羥基發(fā)生酯化交聯(lián)反應[24]。波數(shù)3600～3000 cm－1處的吸收峰是多糖分子內或分子間—OH的伸縮振動所引起。相較于SPI，所有聚合物在3600～3000 cm－1處吸收峰的最高點向高波數(shù)方向發(fā)生位移，這說明SPI和CMC-Na間可能存在氫鍵相互作用[25]。

圖2 CMC-Na/SPI氣凝膠和SPI的FTIRFig.2 FTIR spectra of CMC-Na/SPI aerogels and SPI

2.4 表觀形貌分析

在本研究中，使用直徑13 mm、高15 mm的中空圓柱體制備凍干氣凝膠，氣凝膠樣品均為白色不透明圓柱體。將氣凝膠吸滿油后得到油凝膠，從圖3可以看出，吸油后凝膠體積沒有明顯變化，形狀完好。CMC-Na油凝膠由于其規(guī)則的孔隙結構具有良好的透光性而呈現(xiàn)半透明的狀態(tài)，隨著大豆蛋白添加量的增加，固形物含量升高，密度增加，孔隙度下降，透光性變差。所有油凝膠都具有均勻、半透明的外觀，這表明液態(tài)油在氣凝膠中均勻分布，證明兩者具有良好的相容性。

圖3 不同蛋白含量的氣凝膠和油凝膠外觀圖Fig.3 Appearance of aerogel and oleogel samples with different protein contents

2.5 吸油能力和持油能力

圖4A表示油凝膠吸油量隨時間變化的關系，曲線初始斜率表示吸油速率。隨著蛋白含量的增加，曲線斜率變小，表示吸油速率減慢。吸收速率的降低可能在很大程度上歸因于CMC-Na/SPI氣凝膠密度的升高和孔隙率的降低[26]。對于所有樣品，液態(tài)油在前5 s時吸附速率較快，在10 s時吸附達到平衡狀態(tài)，體現(xiàn)出氣凝膠模板良好的吸油能力。由圖4B可以看出，不同蛋白含量氣凝膠模板吸油量在13.58～56.48 g/g之間。較高蛋白質含量的溶液含有更少的水，因此凍干后獲得的氣凝膠有較少的空間負載油[27]。并且隨著蛋白質含量的增加，氣凝膠自身質量顯著增加，吸附的油與氣凝膠的相對質量比降低，因此，吸油率下降。通過高速離心模擬油釋放評估油凝膠持油能力，所有樣品的持油率均高于60%，最高可達80%，油凝膠的油損失隨著大豆蛋白含量的增加而降低。結合掃描電鏡結果可知，氣凝膠中更高的大豆蛋白含量形成了更致密和均勻的網(wǎng)絡，雖然一定程度上降低了相對的吸油率，但提供了更高的離心穩(wěn)定性，減少了油的泄漏。

圖4 油凝膠吸油量隨時間變化的關系（A）和不同蛋白含量油凝膠的吸油及持油能力（B）分析Fig.4 Oil absorption as a function of time (A),OAC and OHC (B) of CMC-Na/SPI oleogels with different protein contents

2.6 質構分析

良好的抗壓能力對于防止油凝膠產品被外力損壞非常重要。圖5A呈現(xiàn)了不同比例SPI與CMC-Na的樣品在80%應變范圍內的應力-應變曲線。所有應力-應變曲線都顯示出凝膠結構特征的3 個階段，包括在屈服點之前在低應變值（小于10%）下的線性彈性區(qū)域，在中等應變值（10%～70%）下具有相對平坦曲線的塑性區(qū)域，以及在高應變值（超過70%）下應力急劇增加的最后致密化階段[28]。所有油凝膠在被壓縮至80%的整個過程中表現(xiàn)出優(yōu)異的柔韌性和彈性。隨著大豆蛋白含量的增加，油凝膠密度同時逐漸增加，可以觀察到更明確的屈服點和曲線平臺期更高的壓縮強度，表明在更高的密度下油凝膠由高彈性向高硬度發(fā)生轉變。如圖5B～D所示，CMC-Na∶SPI＝1∶4 顯示出最高的壓縮強度（0.39 MPa）、楊氏模量（0.36 MPa）和屈服強度（0.09 MPa），而CMC-Na油凝膠顯示出最低的壓縮強度（0.10 MPa）、楊氏模量（0.09 MPa）和屈服強度（0.01 MPa），表明SPI的加入顯著增強了油凝膠強度，使油凝膠獲得更優(yōu)異的力學性能[29]。與掃描電鏡的結果對比，SPI與CMC-Na吸附結合對油凝膠的機械強度有顯著的積極影響。由此可知，在CMC-Na彈性支架的基礎上通過靜電吸附SPI可以獲得高彈性、高強度的油凝膠。

圖5 油凝膠（CMC-Na/SPI）的機械性能Fig.5 Mechanical properties of CMC-Na/SPI oleogels

2.7 抑菌物質釋放能力評估

采用圓盤擴散法對油凝膠對抑菌物質的釋放能力進行初步評估。圖6顯示了負載有5%肉桂醛的油凝膠對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果，對抑菌圈直徑的統(tǒng)計結果如表2所示。結果表明，不同蛋白比例的油凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，而且抑菌圈的直徑與SPI含量明顯相關[30]。樣品中SPI含量越多，抑菌圈直徑越小，這表明相同培養(yǎng)時間下釋放到外界的抑菌物質更少，抑菌物質在油凝膠內留存含量更高，進而提高了樣品的抑菌能力。這說明蛋白含量高的油凝膠通過減少外源抑菌物質的釋放，以維持油凝膠內較高的抑菌物質濃度，避免細菌繁殖，以實現(xiàn)產品的高效貯藏。此外，油凝膠對大腸桿菌的抑菌活性比金黃色葡萄球菌弱，這是因為革蘭氏陰性菌的外部有一層親水膜，肉桂醛作為疏水物質會降低其滲透能力[31]，因此，同一油凝膠對大腸桿菌的抑菌圈直徑比金黃色葡萄球菌更小。

圖6 負載5%肉桂醛油凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制區(qū)Fig.6 Inhibition zones of oleogels loaded with 5% cinnamaldehyde against E.coli and S.aureus

表2 負載5%肉桂醛油凝膠的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zones of oleogels loaded with 5% cinnamaldehyde mm

2.8 貯藏穩(wěn)定性分析

油凝膠在55 ℃貯藏14 d的氧化穩(wěn)定性變化如圖7所示。在加速氧化期間，使用液態(tài)油作為對照，同時監(jiān)測油的初級和次級反應產物的生成量以確定油凝膠的氧化穩(wěn)定性。在所有的樣品中，初級和次級脂質氧化產物含量在整個貯藏過程中逐漸增加，表明脂質被氧化。新鮮制備的油凝膠PV與液態(tài)油的PV沒有顯著差異，這是因為本實驗油凝膠的制備只需經(jīng)過簡單快速的物理吸油過程，油凝膠未受到劇烈的理化處理或長時間暴露在空氣中。在貯藏前期，油凝膠的PV增長趨勢慢于液態(tài)油。這表明油凝膠內部結構通過限制油的流動和遷移減緩油的氧化[32]；在貯藏后期，油凝膠的PV曲線依然低于液態(tài)油，可以推斷，在加速氧化過程中，油凝膠的網(wǎng)絡結構依然保持完好，可以阻擋氧氣與油脂的接觸。就次級反應產物而言，油凝膠和液態(tài)油的TBARS值在貯藏期內趨于增加。與液態(tài)油相比，油凝膠的增長慢得多。Abdollahi等[33]的研究表明，由明膠和黃原膠組成的網(wǎng)絡結構在延緩油的氧化方面發(fā)揮重要作用，本實驗結果與其相似。綜上所述，油凝膠形成的網(wǎng)絡結構可以顯著提高油脂氧化穩(wěn)定性。

圖7 液態(tài)油和油凝膠的貯藏穩(wěn)定性分析Fig.7 Storage stability of oil and oleogels

3 結論

采用氣凝膠模板法制備CMC-Na油凝膠，大豆蛋白與CMC-Na通過靜電吸附作用形成穩(wěn)定的復合物結構，從而增強油凝膠彈性和強度。隨著大豆蛋白含量的增加，油凝膠網(wǎng)絡結構更加致密，持油率更高，最終形成高彈性、高強度的凝膠。蛋白質的加入明顯減少了抑菌物質向外界的釋放，進而降低了抑菌物質的損失，并延緩了油脂氧化速度，這提高了油凝膠的抑菌能力和抗氧化性能。綜上所述，CMC-Na/大豆蛋白結合可形成穩(wěn)定的油凝膠，有望替代食品加工中飽和反式脂肪酸的使用，本研究可為多糖蛋白聚合物在食品加工中的應用提供參考。