解淀粉歐文氏菌噬菌體Kuerle的分離、基因組測定及其裂解功能分析

陳妞，余成敏，崔百明，任彩霞，楊麗穎，董鈺，劉琳，鄭銀英

解淀粉歐文氏菌噬菌體Kuerle的分離、基因組測定及其裂解功能分析

陳妞，余成敏，崔百明，任彩霞，楊麗穎，董鈺，劉琳，鄭銀英

石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003

【背景】解淀粉歐文氏菌（）是仁果類果樹火疫病的病原體，對全球蘋果和梨的生產構成嚴重威脅。隨著抗生素耐藥菌株的出現，火疫病的防治面臨巨大的挑戰。【目的】分離一種新的裂解解淀粉歐文氏菌的噬菌體，并分析該噬菌體裂解相關基因的功能，為火疫病的防治提供新的選擇。【方法】以解淀粉歐文氏菌Ea102為宿主菌，采用雙層平板法從流行火疫病的果園土壤中分離噬菌體。通過噬菌斑和透射電鏡觀察其形態。用PacBio測序技術測定噬菌體基因組，SPAdes組裝序列，RAST注釋基因組。通過大腸桿菌原核表達系統分析噬菌體Kuerle的裂解機制。【結果】分離純化出一株裂解解淀粉歐文氏菌的噬菌體，命名為Kuerle。Kuerle由二十面體衣殼的頭部和短尾組成，潛伏期約為50 min，裂解量約為240 pfu/cell。噬菌體基因組全長75 599 bp，GC含量48.0%，末端有393 bp的重復序列，未發現與溶原調控相關的基因。共預測到85個開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中33個已知功能蛋白中包含一個由3 550 aa組成的巨大病毒顆粒相關的RNA聚合酶（virion-associated RNA polymerase，vRNAP），該vRNAP是科噬菌體的主要特征之一。病毒粒子和基因結構表明噬菌體Kuerle屬于有尾噬菌體類的科病毒。聚集在DNA晚期表達區的3個裂解相關基因、和組成了“裂解盒”。在大腸桿菌中Kuerle-holin的表達會抑制細胞的生長，而Kuerle-endolysin的表達可裂解細胞。二者共表達時Kuerle-holin會加速kuerle-endolysin引起的細胞裂解。用疊氮化鈉抑制細菌的一般分泌系統（Sec）或Kuerle-endolysin N端信號序列的缺失均會導致endolysin裂解功能喪失。上述結果表明噬菌體Kuerle具有pinholin-SAR endolysin裂解系統。kuerle-holin（pinholin）使細胞質膜去極化以激活分泌的Kuerle-endolysin（SAR endolysin）降解肽聚糖層。【結論】Kuerle是一株烈性噬菌體并且Kuerle-endolysin抑菌效果顯著，為后續火疫病生防試劑的制備提供了理論依據和研究材料。

解淀粉歐文氏菌；噬菌體分離；基因組分析；裂解系統；；

0 引言

【研究意義】火疫病是梨、蘋果、山楂等薔薇科植物中最具有毀滅性的植物細菌病害之一[1-2]，因其危害嚴重，被列為檢疫性病害[3-4]。自2016年首次在新疆伊犁哈薩克自治州發現火疫病以來[5]，已蔓延至庫爾勒。火疫病導致香梨花期出現花腐，嚴重影響了香梨的坐果率，導致香梨減產和果品質量下降[6]。目前伊犁地區的核果類杏樹上也發現了火疫病[7]，火疫病的蔓延嚴重威脅了新疆果樹產業的發展。目前，火疫病的治療措施主要是砍除受感染的植物組織和在植物開花期預防性應用抗生素（例如鏈霉素），然而，抗生素的使用存在監管限制、公共衛生和致病菌產生耐藥性等問題[8]。而噬菌體可以裂解并殺死細菌，且不會產生耐藥性菌株、具有高度特異性，并對宿主周圍微生物群落的影響最小[9-10]。因此，通過分離裂解解淀粉歐文氏菌（）的烈性噬菌體，可為火疫病的防治提供新思路。【前人研究進展】目前，最有效的防治措施仍然是使用具有抗火疫病基因型的樹木，但經濟價值高的庫爾勒香梨通常對火疫病高度敏感[11]。火疫病防治的局限性迫切需要可持續、安全和有效的控制策略。現已研發出高效、無公害的火疫病生防菌劑，例如基于噬菌體技術的農業殺菌劑Agriphage系列產品，可用于火疫病和潰瘍病的防治，并且對于抗性細菌仍然有效。通常，噬菌體裂解的第一步是控制透化細胞質膜的時間，然后是肽聚糖的酶促降解。感染革蘭氏陰性細菌的有尾噬菌體有兩種裂解策略：holin-endolysin；針孔蛋白（pinholin）-signal anchor release（SAR）endolysin。在前者中，噬菌體在發育后期編碼的holin是一類小型跨膜蛋白，可控制噬菌體感染周期的時長[12-14]。holin在整個形態發生期間無害地積聚在細胞質膜中，直到在細胞質膜上形成微米級的非特異性孔洞，造成膜電位的崩潰和非特異性滲透，從而釋放endolysin攻擊肽聚糖層。而在后者中，pinholin僅在細胞質膜上形成納米級的七聚體孔道，無法釋放蛋白質，只能引起膜去極化，而SAR endolysin通過宿主Sec通路易位至周質并以無活性的形式拴在內膜上，在被膜去極化激活后，造成細胞裂解。以上兩種策略都是降解宿主的肽聚糖層，而單鏈DNA噬菌體ΦX174通過抑制細胞肽聚糖合成，造成細胞死亡[15]。此外，分枝桿菌噬菌體（mycobacteriophage）Ms6的輔助裂解蛋白Gp1將endolysin LysA靶向Sec通路，在沒有holin時也能有效裂解宿主細胞[16]。【本研究切入點】筆者課題組前期分離到解淀粉歐文氏菌Ea102和Ea915，以生物防治策略為出發點，分離出歐文氏菌噬菌體Kuerle。通過分析噬菌體Kuerle基因組，并借助原核表達系統表達holin和endolysin蛋白，進而分析抑菌活性。【擬解決的關鍵問題】基于對噬菌體Kuerle基因組的分析，構建holin、endolysin、endolysin-holin、endolysinΔsp、endolysinΔsp-holin原核表達載體，在大腸桿菌中表達驗證抗菌活性和endolysin易位途徑，為火疫病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本與供試菌株

2022年5月，從新疆庫爾勒地區的香梨園采集土壤樣本。宿主菌株解淀粉歐文氏菌Ea102、Ea915（基因組已上傳至NCBI，Genbank登錄號分別為CP104022、CP104025）分離自庫爾勒香梨枝條。萎縮芽孢桿菌（）B4、KB14、B8、KB16和巨大芽孢桿菌（）KB3、KB17、KD7由石河子大學孫黎教授贈予。大腸桿菌（）BL21（DE3）為實驗室保存。

1.2 噬菌體的分離及純化

噬菌體分離采用雙層瓊脂法：稱10 g土壤于190 mL由SM緩沖溶液配制的LB液體培養基中，加入10 mL新鮮的解淀粉歐文氏菌Ea102，混勻，28 ℃，220 r/min振蕩培養18 h；上清用0.22 μm過濾器過濾，將100 μL濾液與200 μL處于指數生長期的Ea102菌混合，靜置10 min，加至5 mL 50 ℃的上層瓊脂（蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、瓊脂粉4 g·L-1、葡萄糖10 g·L-1、MgSO4·7h2o 0.24 g·L-1），顛倒混勻后鋪在LB固體平板上，28 ℃，倒置培養過夜。噬菌體純化采用單斑分離法，挑單個噬菌斑，用雙層瓊脂法連續單斑分離4次，將分離純化的噬菌體命名為Kuerle。

1.3 噬菌體的電鏡觀察

用PEG8000濃縮噬菌體裂解液，使裂解液的效價達到約1.0×1012pfu/mL。滴取10 μL的噬菌體裂解液于銅網碳膜（300目），靜置3 min，吸多余的液體，再用2%（W/V）磷鎢酸染色液負染5 min，吸干水分，紅外燈照射30 min后，用HT7700透射電鏡（TEM）觀察噬菌體的形態。

1.4 噬菌體一步生長曲線測定

將OD600=0.2（1.0×109cfu/mL）的解淀粉歐文氏菌Ea102與1.0×109pfu/mL噬菌體Kuerle以感染復數（multiplicity of infection，MOI）為0.1的比例混合。在吸附15 min后，12 000 r/min離心5 min，去上清，使用LB液體培養基洗滌菌體以去除未吸附的噬菌體顆粒。隨后，用100 μL LB液體培養基重懸并加入9.9 mL LB液體培養基，28 ℃靜置培養至160 min，期間每10 min取樣，每次取100 μL于900 μL SM緩沖溶液中，顛倒混勻，12 000 r/min離心2 min，再用雙層平板法測定效價，重復3次，取平均值繪制一步生長曲線。

1.5 噬菌體宿主譜測定

以固體LB培養基為底層平板，取生長至對數期的菌液200 μL與200 μL的噬菌體懸液室溫吸附10 min，吸附結束后加到5 mL 50 ℃的上層瓊脂中，迅速倒入底層平板中并晃動平板，使上層瓊脂均勻分布于平板中。待上層瓊脂凝固后，28 ℃倒置培養過夜。次日觀察有無噬菌斑，重復3次。

1.6 噬菌體基因組分析

噬菌體全基因組采用Illumina HiSeq 2500和PacBio Sequel測序（北京諾禾致源科技股份有限公司）。原始數據經fastp[17]去除低質量數據后，用SPAdes V3.15[18]從頭組裝基因組序列。采用RAST[19]注釋基因組，并使用Easyfig 2.2.3[20]進行噬菌體線性基因組比較和編碼區域的可視化。應用Blastn[21]分析與已知噬菌體基因組的相似性，MAGE X[22]構建蛋白系統發育樹。

1.7 噬菌體裂解基因的序列分析

使用在線軟件InterProScan[23]分析裂解基因的功能結構域，TMHMM[24]、Blastp[21]、SignalP[25]和SMART[26]分析噬菌體Kuerle裂解蛋白的二級結構，如跨膜結構域、信號肽等。

1.8 噬菌體裂解基因載體構建

為驗證噬菌體Kuerle基因組中裂解相關基因功能，構建pET-endolysin載體，以噬菌體Kuerle基因組為模板，使用引物Lys-1F和Lys-609R（表1），通過PCR擴增噬菌體Kuerle的裂解酶基因。純化的PCR產物用限制性內切酶R I和I酶切，將純化的PCR產物連接至pET30a（+），并轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞。用同樣的方法構建pET- holin、pET-endolysin-holin。通過構建pET-endolysinΔsp、pET-endolysinΔsp-holin以驗證裂解酶N端信號肽是否參與Kuerle-endolysin介導的細胞裂解。插入的基因通過雙酶切鑒定和Sanger測序進一步證實。

1.9 噬菌體裂解基因功能驗證

使用分光光度計測量（OD600）光密度以確定構建的重組質粒對大腸桿菌生長的影響。首先將攜帶重組質粒的大腸桿菌接種到50 mL含有卡那霉素（50 μg·mL-1）的LB液體培養基中，培養至對數生長期（OD600=0.4—0.6），加入異丙基--d-硫代半乳糖苷（isopropyl--d-thiogalactoside，IPTG），終濃度為1 mmol·L-1。37 ℃，190 r/min培養110 min。期間每隔10 min測定一次OD600值。疊氮化鈉（NaN3）抑制SecA在細胞膜上易位所必需的ATP酶活性，因此，通過添加NaN3研究Kuerle-endolysin是否通過Sec途徑轉運到周質[27]。在含有重組質粒pET-endolysin的菌液（OD600=0.4—0.6）中加入NaN3，終濃度為5 mmol·L-1，并用1 mmol·L-1IPTG誘導蛋白表達，37 ℃，190 r/min培養110 min。期間每隔10 min測定一次OD600處細菌濁度。

表1 供試引物

下劃線表示限制性內切酶識別位點 Underline indicates restriction endonuclease recognition sites

2 結果

2.1 噬菌體分離與形態特征

使用雙層瓊脂法，從新疆庫爾勒梨園采集的土壤樣本中分離出一株裂解解淀粉歐文氏菌的噬菌體，命名為Kuerle。噬菌體Kuerle在Ea102宿主菌株平板上產生邊界清晰、中間透明、直徑約為1 mm的清晰斑塊（圖1-A）。TEM結果顯示噬菌體Kuerle由二十面體衣殼的頭部和短尾構成（圖1-B）。

2.2 噬菌體一步生長曲線

基于MOI=0.1測定噬菌體Kuerle的一步生長曲線，結果顯示40 min內噬菌體滴度無明顯變化，40—120 min內噬菌體滴度快速增加，120 min后噬菌體滴度趨于平穩，進入平臺期（圖2）。說明Kuerle潛伏期較短（50 min）、爆發量大（240 pfu/cell左右），在預防和治療火疫病方面具有一定的應用潛力。

A：噬菌斑的形態morphology of phage plagues；B：噬菌體Kuerle病毒粒子phage Kuerle virus particles

L：潛伏期latent period；B：爆發量burst size

2.3 噬菌體Kuerle宿主譜

目前，火疫病的生物防治主要選用拮抗菌[6,28-29]，測試噬菌體是否裂解用于生物防治的拮抗菌，可為后續噬菌體與拮抗菌的聯合使用提供參考依據。選取細菌庫中7株拮抗解淀粉歐文氏菌的芽孢桿菌和2株解淀粉歐文氏菌測試噬菌體的裂解范圍（表2），結果表明噬菌體Kuerle只能裂解2株解淀粉歐文氏菌，對拮抗解淀粉歐文氏菌[30]的芽孢桿菌不具有裂解作用。

表2 噬菌體Kuerle的宿主譜

+：形成空斑Forming plaque；－：不形成空斑No plaque is formed

2.4 噬菌體Kuerle基因組分析

噬菌體Kuerle基因組為雙鏈線性DNA，全長75 599 bp，GC含量為48.0%，基因組末端有393 bp的正向重復序列。RAST注釋結果顯示Kuerle基因組含有7個tRNA基因和85個開放閱讀框（open reading fragment，ORF），其中33個ORF被預測為功能蛋白，52個ORF被推測為未知蛋白。33個功能蛋白大體可分為6個功能模塊：轉錄、頭尾結構、裂解、核酸代謝、DNA復制和組裝（圖3）。噬菌體Kuerle基因組攜帶編碼推定的和，且基因組中未發現與溶原調控相關的基因（包括整合酶、阻遏物），表明其為一種裂解性噬菌體。

箭頭表示預測的ORF，紅色的豎線表示tRNA，噬菌體之間的基因相似性圖譜以百分比形式顯示為灰色色譜

噬菌體Kuerle基因組大小、病毒粒子形態、基因組末端有重復序列和編碼的3個RNA聚合酶（RNAP1、RNAP2、vRNAP）均符合N4類噬菌體的特征[31]。此外，將噬菌體Kuerle與N4類噬菌體參考基因組（埃希氏菌噬菌體N4）比較發現，Kuerle的功能區域分布與N4類相關噬菌體的一致，并且RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、DNA聚合酶I、DNA引物酶、vRNAP等蛋白是共有的保守蛋白（圖3）。表明Kuerle是N4類噬菌體，N4類噬菌體是科成員，因此，噬菌體Kuerle也屬于。

將噬菌體Kuerle的基因組序列與NCBI核苷酸數據庫中其他噬菌體的基因組序列進行比較。發現噬菌體Kuerle與科噬菌體Fifi067（accession number：OP829055）的核苷酸一致性最高，為98.82%，進一步證實噬菌體Kuerles為成員。噬菌體Kuerle基因組序列已上傳至NCBI，GenBank登錄號：OQ181210。

2.5 裂解基因序列分析

基因注釋結果顯示，在噬菌體Kuerle晚期表達操縱子中發現ORF77、ORF76和ORF75可能與裂解相關，三者分別被注釋為推定的和。其中endolysin序列的14個堿基與holin序列重疊，而endolysin的終止密碼子與Rz/Rz1 spanin的起始密碼子重疊（圖4-A）。噬菌體Kuerle的裂解基因排列順序為，這與大多數噬菌體中裂解基因的排列順序一致[32]，三者分別依次破壞細胞的內膜、肽聚糖層、外膜。

噬菌體Kuerle基因組中推定的endolysin，即ORF76，由202個aa組成，分子量為21.95 kDa。如圖5-A所示，Kuerle-endolysin與其他革蘭氏陰性噬菌體endolysin系統發育分析表明，Kuerle-endolysin與其他含有溶菌酶結構域的endolysin具有相似性，但這些endolysin未被試驗驗證過。使用InterProScan算法進一步分析Kuerle-endolysin，發現其中包含一個糖基水解酶結構域（21—104 aa）和一個肽聚糖結合域（107—189 aa），符合革蘭氏陰性菌噬菌體endolysin蛋白的特征[33]。SignalP算法預測Kuerle-endolysin蛋白N端具有信號肽（signal peptide，SP）序列（圖4-B）。此外，SMART和TMHMM算法預測出endolysin蛋白N端SP序列中含有跨膜結構域（transmembrane domain，TMD）（圖4-C），該SP序列中TMD多為弱疏水氨基酸殘基（1個Thr、3個Gly、6個Ala）。Kuerle-endolysin序列特征與SAR-endolysin特征符合[34-35]，因此Kuerle編碼的可能是SAR-endolysin，并具有溶菌酶活性。

A：裂解基因簇，Kuerle的裂解基因由晚期基因表達，編碼穿孔素（ORF77）、裂解酶（ORF76）和Rz/Rz1 spanin（ORF75）3個推測基因在Kuerle基因組中的重疊結構Cluster of lysis genes, Kuerle’s lysis genes are expressed by late genes, encoding holin (ORF77), endolysin (ORF76), and Rz/Rz1 spanin (ORF75) overlapping structures of the three putative genes in the Kuerle genome。B：Kuerle-endolysin基因結構Kuerle-endolysin gene structure。C：Kuerle-endolysin的N端信號序列，下劃線表示弱疏水氨基酸N-terminal signal sequence of Kuerle-endolysin, underline indicates weakly hydrophobic amino acids。D：Kuerle-holin基因結構Kuerle-holin gene structure

推定的holin是噬菌體Kuerle裂解盒中的第一個裂解基因，由84 aa組成，分子量為9.4 kDa，Kuerle- holin與其他革蘭氏陰性噬菌體編碼的小型跨膜蛋白holin相似，但這些holin未被試驗驗證過（圖5-B）。TMHMM算法預測出Kuerle-holin蛋白中有兩個跨膜結構域（20—42、55—72 aa）（圖4-D），N端富含堿性氨基酸。holin依據序列中存在的TMD劃分為3類：I型有3個TMD；II型有2個TMD；III型有1個TMD[36]，Kuerle-holin屬于II型。

大多數革蘭氏陰性噬菌體中均含有雙組分spanins蛋白，由II型內膜整合蛋白i-spanin和外膜脂蛋白o-spanin組成；一些噬菌體中存在單分子spanins（u-spanins），二者不同之處在于后者同時具有外膜脂蛋白決定簇和嵌入內膜的C端跨膜結構域[37]。將序列提交至NCBI中Open Reading Frame Viewer分析發現Rz1完全嵌入在Rz的序列中，并具有翻譯起始信號（圖4-A）。InterProScan算法預測到Rz序列的N端含有一個跨膜結構域（10—28 aa），其周質結構域以螺旋（54—74 aa）為主，而SignalP預測到Rz1具有膜脂蛋白信號。Rz和Rz1通過其周質結構域相互作用，形成跨越整個周質的復合物spanins以破壞外膜。

A: Kuerle-endolysin; B: Kuerle-holin

2.6 噬菌體Kuerle裂解基因功能驗證

為了證實噬菌體Kuerle中holin和endolysin的生物信息學預測，利用原核表達驗證二者功能，了解噬菌體Kuerle裂解宿主細胞的機制。通過添加IPTG誘導攜帶pET30-endolysin質粒的大腸桿菌表達，從而觀察Kuerle-endolysin的致死性。如圖6-A所示，在誘導表達20 min時，觀察到攜帶pET30-endolysin質粒的大腸桿菌菌液OD600值從0.6降至0.25，反觀含有pET30空載體的細胞持續增長。通常，若無holin在細胞質膜上形成非特異性孔洞，積累在細胞質中的endolysin無法逃逸至周質對細胞產生毒性。而試驗中僅單獨表達Kuerle-endolysin也能造成細胞裂解，表明噬菌體Kuerle編碼的很可能是SAR-endolysin。此外，利用IPTG誘導表達含pET30-holin質粒的細胞20 min后，開始緩慢抑制細胞的生長。這可能是過表達holin導致細胞質膜通透性改變、膜電位崩潰、呼吸抑制和活性轉運缺陷，從而導致細胞死亡的結果[10]。而在誘導攜帶pET30-holin+endolysin共表達質粒的細胞10 min后OD600值降至0.294。該結果表明Kuerle-holin的表達提高了噬菌體Kuerle-endolysin蛋白的釋放效率，從而導致更快、更有效的裂解。

前期，經endolysin蛋白序列分析和原核表達驗證，推測噬菌體Kuerle編碼的可能是SAR-endolysin，該假設意味著Kuerle-endolysin通過宿主的Sec通路易位到周質。因此使用SecA ATP酶活性抑制劑NaN3來驗證Sec通路是否參與Kuerle-endolysin的易位。如圖6-B所示，在誘導表達時，加入5 mmol·L-1NaN3會完全抑制Kuerle-endolysin對細胞的裂解，也會抑制含有空載體細胞的生長，表明Sec通路參與Kuerle- endolysin向周質的易位。該蛋白作為SAR-endolysin參與細胞裂解的假設是成立的。

為明確N端信號肽刪除是否影響endolysin抑菌活性，將endolysin序列中的信號肽（1—27 aa）刪除，保留完整的溶菌酶結構域和肽聚糖結合域，構建了endolysin N端信號肽刪除（endolysinΔSP）載體pET30-endolysinΔSP，為驗證噬菌體Kuerle編碼的是否為pinholin，構建了載體pET-endolysinΔsp-holin。如圖6-C所示，分別誘導攜帶pET30-endolysin△SP質粒與攜帶pET30-endolysin質粒的細胞，結果發現endolysinΔSP過表達對細胞不產生毒性，而誘導攜帶pET-endolysinΔsp-holin質粒的細胞20 min后，細胞生長受到緩慢的抑制，表明Kuerle-holin在細胞內膜上形成的孔洞小，endolysinΔSP不能通過此孔洞進入周質。上述結果表明N端信號肽是Kuerle-endolysin通過Sec通路易位的充要條件，且Kuerle-endolysin無法通過holin蛋白在細胞內膜上形成的非特異性孔洞易位至周質。由此推斷噬菌體Kuerle編碼的是pinholin。綜上所述，噬菌體Kuerle通過pinholin-SAR endolysin途徑裂解細胞且Kuerle-endolysin抑菌效果顯著。

A：表達預測裂解蛋白的大腸桿菌細胞生長曲線Growth curves of E. coli cells expressing predicted lysis proteins；B：Kuerle-endolysin對Sec通路的依賴性生長曲線Kuerle-endolysin dependent growth curves of the Sec pathway；C：誘導表達endolysinΔSP蛋白的大腸桿菌細胞生長曲線Growth curves of E. coli cells induced to express proteins of endolysinΔSP

3 討論

隨著抗生素耐藥菌株的出現，使得抗生素的有效性急劇下降，研究者對噬菌體療法再次產生濃厚興趣[38-39]。目前，噬菌體治療不僅應用于動物醫學、臨床和食品領域，在農業生產上也被廣泛關注。一些基于噬菌體的殺菌劑已被批準應用于植物和周圍土壤或作為食品加工中的添加劑[40-41]。目前火疫病的蔓延嚴重影響新疆林果業的發展尤其是庫爾勒香梨的產量和品質，因此本研究分離鑒定了一種新的裂解解淀粉歐文氏菌的烈性噬菌體，針對其基因組的特征和裂解相關基因的功能進行分析闡述。

3.1 噬菌體Kuerle分離與裂解蛋白序列特征

本研究中，以解淀粉歐文氏菌Ea102為宿主菌分離出一株噬菌體Kuerle，對其進行一步生長曲線、宿主范圍測定和基因組分析。結果表明，Kuerle具有較短潛伏期和大的爆發量，通過基因組分析和電鏡結果表明該噬菌體是一株短尾噬菌體，其病毒粒子形態、基因組大小、末端重復序列、GC含量與典型的病毒相符[31]。基因注釋結果中有85個ORF和7個tRNA，tRNA序列的存在表明Kuerle可能相對獨立于宿主蛋白的合成機制。噬菌體Kuerle的分離為后續火疫病的防治提供了研究材料。

每個噬菌體都有裂解宿主細菌的裂解策略。因此，鑒定參與宿主裂解的基因可為病原體控制提供必要的線索和基因組資源[42]。進一步對Kuerle基因組分析，發現3個與裂解相關的基因：、和。TMHMM算法預測Kuerle-holin中有兩個跨膜結構域，并具有N-out和C-out的拓撲結構，很可能屬于II型穿孔素。但Kuerle-holin的拓撲結構與已知的II型穿孔素結構不同，這可能是Kuerle-holin的N端富含堿性氨基酸，具有較強的親水性導致的[43]。使用SignalP算法預測到Kuerle裂解酶N端具有信號肽序列，且信號肽序列中含有跨膜結構域，通常TMD序列中Leu和Ile等強疏水氨基酸殘基占主導地位[44]，但Kuerle-endolysin的信號肽序列中含有豐富的弱疏水性氨基酸（Ala、Gly、Thr、Ser），這可能是endolysin蛋白能從膜整合狀態轉變為自由溶解狀態的原因[34]。

3.2 噬菌體Kuerle裂解蛋白表達與易位

通過原核表達進一步驗證和功能，發現誘導攜帶pET30-endolysin質粒的細胞20 min后造成裂解，相對于僅表達銅綠假單胞菌（）噬菌體фKMVK和大腸桿菌噬菌體P1的裂解酶，在誘導表達60—90 min后使大腸桿菌裂解[45]，這表明Kuerle-endolysin的抑菌效果顯著；誘導攜帶pET-endolysin-holin共表達質粒的細胞10 min時迅速裂解。此外，試驗證實Kuerle-endolysin是通過宿主的Sec通路易位至周質，并且endolysin N端信號肽刪除也會抑制細胞裂解，該結果表明信號肽對Kuerle- endolysin靶向Sec通路具有重要作用，但其作用方式需進一步研究。綜上，本研究分離的噬菌體Kuerle裂解酶和針孔蛋白對宿主均具有致死性，有助于開發成為一種控制梨火疫病的新型方法。

4 結論

噬菌體Kuerle潛伏期短、爆發量大，屬于病毒。Kuerle-endolysin依賴于宿主Sec通路易位，且N端信號肽是Kuerle-endolysin通過Sec通路易位至周質的關鍵。Kuerle裂解基因和分別表達或共表達均有明顯的抑菌效果，二者在火疫病抗菌制劑的研發中具有較大的應用潛力。

[1] MOLINA L, REZZONICO F, DEFAGO G, DUFFY B. Autoinduction in: evidence of an acyl-homoserine lactone signal in the fire blight pathogen. Journal of Bacteriology, 2005, 187(9): 3206-3213.

[2] ZhAO Y, TIAN Y, WANG L, GENG G, ZHAO W, HU B, ZHAO Y. Fire blight disease, a fast-approaching threat to apple and pear production in China. Journal of Integrative Agriculture, 2019, 18(4): 815-820.

[3] MANSFIELD J, Genin S, MAGORI S, CITOVSKY V, SRIARIYANUM M, RONALD P, DOW M, VERDIER V, BEER S V, MACHADO M A, TOTH I, SALMOND G, FOSTER G D. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, 2012, 13(6): 614-629.

[4] 中華人民共和國農業農村部公告第351號. 中華人民共和國農業農村部公報, 2020(12): 96-98.

Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People’s Republic of China Announcement No. 351. Gazette of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People’s Republic of China, 2020(12): 96-98. (in Chinese)

[5] 王俊, 高建誠, 巴音克西克, 木也沙·買買提, 張軍恒, 田艷麗, 胡白石. 利用電加熱自動消毒修枝剪阻斷梨火疫病田間傳播. 植物檢疫, 2022, 36(2): 25-28.

WANG J, GAO J C, BAYINKEXIKE, MUYASSAR·MAMAT, ZHANG J H, TIAN Y L, HU B S. Blocking field spread of fire blight by electric heating automatic disinfection pruning scissors. Plant Quarantine, 2022, 36(2): 25-28. (in Chinese)

[6] 王俊, 高建誠, 巴音克西克, 吳莉莉. 利用蜜蜂傳播生防菌防治梨火疫病. 植物檢疫, 2022, 36(1): 9-12.

WANG J, GAO J C, BAYINKEXIKE, WU L L. Dispersal of biocontrol bacterium by honey bee for control of pear fire blight. Plant Quarantine, 2022, 36(1): 9-12. (in Chinese)

[7] 韓麗麗, 荊珺, 王杰花, 陳衛民. 杏樹梨火疫病在中國首次發生. 植物檢疫, 2022, 36(6): 46-49.

HAN L L, JING J, WANG J H, CHEN W M. First report of pear fire blight on apricot caused byin China. Plant Quarantine, 2022, 36(6): 46-49. (in Chinese)

[8] MCMANUS P S, STOCKWELL V O, SUNDIN G W, JONES A L. Antibiotic use in plant agriculture. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40: 443-465.

[9] JONES J B, JACKSON L E, BALOGH B, OBRADOVIC A, IRIARTE F B, MOMOL M T. Bacteriophages for plant disease control. Annual Review of Phytopathology, 2007, 45: 245-262.

[10] García P, Martínez B, Obeso J M, Rodríguez A. Bacteriophages and their application in food safety. Letters in applied microbiology, 2008, 47(6): 479-485.

[11] 李洪濤, 張靜文, 盛強, 唐章虎, 張祥林, 張春竹, 羅明. 我國20個梨品種(種質)對國外梨火疫病菌的抗病性評價. 果樹學報, 2019, 36(5): 629-637.

LI H T, ZHANG J W, SHENG Q, TANG Z H, ZHANG X L, ZHANG C Z, LUO M. Resistance evaluation of 20 pear varieties (germplasms) in China to foreign strains of. Journal of Fruit Science, 2019, 36(5): 629-637. (in Chinese)

[12] YOUNG R. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation. Microbiological Reviews, 1992, 56(3): 430-481.

[13] YOUNG R. Bacteriophage holins: deadly diversity.Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 2002, 4(1): 21-36.

[14] WANG I N, SMITH D L, YOUNG R. Holins: the protein clocks of bacteriophage infections. Annual Review of Microbiology, 2000, 54: 799-825.

[15] BERNHARDT T G, ROOF W D, YOUNG R. Genetic evidence that the bacteriophage phi X174 lysis protein inhibits cell wall synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(8): 4297-4302.

[16] CATALAO M J, GIL F, MONIZ-PEREIRA J, PIMENTEL M. The mycobacteriophage Ms6 encodes a chaperone-like protein involved in the endolysin delivery to the peptidoglycan. Molecular Microbiology, 2010, 77(3): 672-686.

[17] CHEN S, ZHOU Y, CHEN Y, GU J. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics, 2018, 34(17): i884-i890.

[18] ANTIPOV D, RAIKO M, LAPIDUS A, PEVZNER P A. Metaviral SPAdes: assembly of viruses from metagenomic data. Bioinformatics, 2020, 36(14): 4126-4129.

[19] AZIZ R K, BARTELS D, BEST A A, DEJONGH M, DISZ T, EDWARDS R A, FORMSMA K, GERDES S, GLASS E M, KUBAL M,. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics, 2008, 9: 75.

[20] SULLIVAN M J, PETTY N K, BEATSON S A. Easyfig: a genome comparison visualizer. Bioinformatics, 2011, 27(7): 1009-1010.

[21] NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research, 2016, 44(D1): D7-D19.

[22] KUMAR S, STECHER G, LI M, KNYAZ C, TAMURA K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular biology and evolution,2018, 35(6): 1547-1549.

[23] FINN R D, ATTWOOD T K, BABBITT P C, BATEMAN A, BORK P, BRIDGE A J, CHANG H Y, DOSZTANYI Z, El-GEBALI S, FRASER M,. InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations. Nucleic Acids Research, 2017, 45(D1): D190-D199.

[24] KROGH A, LARSSON B, VON HEIJNE G, SONNHAMMER E L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology, 2001, 305(3): 567-580.

[25] NIELSEN H. Predicting secretory proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology, 2017, 1611: 59-73.

[26] LETUNIC I, KHEDKAR S, BORK P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research, 2021, 49(D1): D458-D460.

[27] OLIVER D B, CABELLI R J, DOLAN K M, JAROSIK G P. Azide-resistant mutants ofalter the SecA protein, an azide-sensitive component of the protein export machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990, 87(21): 8227-8231.

[28] 徐琳赟, 古麗孜熱·曼合木提, 韓劍, 蔣萍, 黃偉, 羅明. 香梨內生拮抗細菌的篩選及對梨火疫病的生防潛力. 西北植物學報, 2021, 41(1): 132-141.

XU L Y, GULIZZIER·MANHEMUTI, HAN J, JIANG P, HUANG W, LUO M. Screening of endophytic antagonistic bacteria from Kuerlexiangli pear and their biocontrol potential against fire blight disease. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2021, 41(1): 132-141. (in Chinese)

[29] 魯晏宏, 郝金輝, 羅明, 黃偉, 盛強, 王寧, 詹發強, 龍宣杞, 包慧芳. 梨火疫病拮抗菌篩選及溫室防效測定. 微生物學通報, 2021, 48(10): 3690-3699.

LU Y H, HAO J H, LUO M, HUANG W, SHENG Q, WANG N, ZHAN F Q, LONG X Q, BAO H F. Screening of antagonistic bacteria againstand its control effect in greenhouse. Microbiology China, 2021, 48(10): 3690-3699. (in Chinese)

[30] CUI Z, HU L, ZENG L, MENG W, GUO D, SUN L. Isolation and characterization ofKD7 for the biological control of pear fire blight.Frontiers in microbiology, 2023, 14: 1099664.

[31] WITTMANN J, TURNER D, MILLARD A D, MAHADEVAN P, KROPINSKI A M, Adriaenssens E M. From orphan phage to a proposed new family - the diversity of N4-like viruses. Antibiotics, 2020, 9(10): 663.

[32] BRIERS Y, PEETERS L M, VOLCKAERT G, LAVIGNE R. The lysis cassette of bacteriophage ΦKMV encodes a signal-arrest-release endolysin and a pinholin. Bacteriophage, 2011, 1(1): 25-30.

[33] BRIERS Y, VOLCKAERT G, CORNELISSEN A, Lagaert S, Michiels C W, Hertveldt K, Lavigne R. Muralytic activity and modular structure of the endolysins ofbacteriophages ΦKZ and EL.Molecular microbiology, 2007, 65(5): 1334-1344.

[34] XU M, STRUCK D K, DEATON J, WANG I N, YOUNG R. A signal-arrest-release sequence mediates export and control of the phage P1 endolysin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(17): 6415-6420.

[35] OLIVEIRA H, MELO L D, SANTOS S B, NOBREGA F L, FERREIRA E C, CERCA N, AZEREDO J, KLUSKENS L D. Molecular aspects and comparative genomics of bacteriophage endolysins. Journal of virology, 2013, 87(8): 4558-4570.

[36] SAVVA C G, DEWEY J S, MOUSSA S H, TO K H, HOLZENBURG A, YOUNG R. Stable micron-scale holes are a general feature of canonical holins. Molecular Microbiology, 2014, 91(1): 57-65.

[37] SUMMER E J, BERRY J, TRAN T A, NIU L, STRUCK D K, YOUNG R. Rz/Rz1 lysis gene equivalents in phages of Gram- negative hosts. Journal of Molecular Biology, 2007, 373(5): 1098-1112.

[38] DY R L, RIGANO L A, FINERAN P C. Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture. Biochemical Society Transactions, 2018, 46(6): 1605-1613.

[39] JAMAL M, BUKHARI S, ANDLEEB S, ALI M, RAZA S, NAWAZ M A, HUSSAIN T, RAHMAN S U, SHAH S S A. Bacteriophages: an overview of the control strategies against multiple bacterial infections in different fields. Journal of Basic Microbiology, 2019, 59(2): 123-133.

[40] POLASKA M, SOKOLOWSKA B. Bacteriophages - a new hope or a huge problem in the food industry. AIMS microbiology, 2019, 5(4): 324-346.

[41] CARSTENS A B, DJURHUUS A M, KOT W, HANSEN L H. A novel six-phage cocktail reducessoft rot infection in potato tubers under simulated storage conditions. FEMS microbiology letters, 2019, 366(9): fnz101.

[42] LEE C, KIM J, SON B, RYU S. Development of advanced chimeric endolysin to control multidrug-resistantthrough domain shuffling. ACS infectious diseases, 2021, 7(8): 2081-2092.

[43] ANDERSSON H, VON HEIJNE G. Membrane protein topology: effects of delta mu H+on the translocation of charged residues explain the ‘positive inside’ rule. The EMBO Journal, 1994, 13(10): 2267-2272.

[44] CAHILL J, YOUNG R. Phage lysis: Multiple genes for multiple barriers. Advances in virus research, 2019, 103: 33-70.

[45] TO K H, DEWEY J, WEAVER J, PARK T, YOUNG R. Functional analysis of a class I holin, P2 Y. Journal of Bacteriology, 2013, 195(6): 1346-1355.

Isolation, genome determination and Lysis function analysis of phage Kuerle of

CHEN Niu, YU ChengMin, CUI BaiMing, REN CaiXia, YANG LiYing, DONG Yu, LIU Lin, ZHENG YinYing

College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang

【Background】, the causal agent of fire blight in pome fruit trees, poses a serious threat to apple and pear production worldwideWith the emergence of antibiotic-resistant strains, control ofcausing fire blight is a huge challenge.【Objective】The objective of this study is to isolate a new lyticbacteriophage and analyze the functions of the phage lytic-related genes, and to provide a new option for the control of fire blight.【Method】Phage was isolated from fire-blight-endemicorchard soil using the double-layer plaque assay withstrain Ea102 as the host. Morphology was observed by phage plagues and transmission electron microscopy. The phage genome was determined by PacBio sequencing, SPAdes assembly, and RAST annotation. Theprokaryotic expression system was used to analyze the lysis mechanism of bacteriophage.【Result】A newbacteriophage, named Kuerle, was isolated and purified. Kuerle consists of an icosahedral capsid head and a short tail, with a latent phase of about 50 min and burst size of about 240 pfu/cell. The phage has a genome length of 75 599 bp with 48.0% GC content, and direct terminal repeat of 393 bp. No regulatory genes related to lysogency were identified. A total of 85 open reading frames (ORFs) were predicted, of which 33 known functional proteins contained a giant virion-associated RNA polymerase (vRNAP) (3 550 aa). The vRNAP is considered one of the main features of the family. The morphology of viron and genome structure agree that phage Kuerle belongs to the family. Three lysis-associated genes,andclustered in late expression DNA region compose “lysis cassettes”. The expression of kuerle-holin ininhibited the growth of bacteria, while the expression of kuerle-endolysin caused cell lysis. kuerle-holin accelerated the process of cell lysis caused by kuerle-endolysin. Inhibition of the general secretion system (Sec) of bacteria with sodium azide or deletion of the N-terminal signaling sequence of Kuerle-endolysin both resulted in the loss of endolysin lysis function. These results suggest that the phage Kuerle has a pinholin-SAR endolysin lysis system. kuerle-holin (pinholin) depolarizes cytoplasmic membrane to activate the secreted Kuerle-endolysin (SAR endolysin) which degrades cell wall in periplasm.【Conclusion】Kuerle is a virulent bacteriophage and Kuerle-endolysin has significant bacteriostatic effect, which provides theoretical basis and research materials for the preparation of subsequent fire blight control reagents.

; phage isolation; genome analysis; lysis system;;

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.02.006

2023-09-08；

2023-11-11

兵團科技攻關計劃（2023AB004-03）

陳妞，E-mail：2922711264@qq.com。余成敏，E-mail：2373151062@qq.com。陳妞與余成敏為同等貢獻作者。通信作者鄭銀英，E-mail：69825983@qq.com

（責任編輯 岳梅）