紅皮白肉與紅皮紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構特征

周信雁，陳思宇，魏宇飛，朱瑜，馮君茜，丁點草，陸貴鋒，楊尚東

紅皮白肉與紅皮紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構特征

周信雁1，陳思宇1，魏宇飛1，朱瑜1，馮君茜1，丁點草1，陸貴鋒2，楊尚東1

1廣西大學農學院/廣西農產品安全重點實驗室/植物科學國家級實驗教學示范中心，南寧 530004；2廣西農業科學院園藝研究所，南寧 530007

【目的】比較分析紅皮白肉與紅皮紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構特征，旨在探究紅肉火龍果果肉顏色形成與植株內生微生物群落的關聯性，挖掘與其顏色形成相關的功能微生物。【方法】以紅皮白肉與紅皮紅肉火龍果植株莖部為試驗材料，基于高通量測序技術比較分析莖部內生微生物（細菌、真菌）多樣性與豐富度，門、屬分類水平的群落結構組成以及優勢菌群相對豐度占比；基于LEfSe差異分析探究紅皮白肉與紅肉火龍果植株莖部中具有顯著差異的內生微生物。【結果】紅皮白肉與紅皮紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構特征存在顯著差異。紅皮紅肉火龍果植株莖部中特有的細菌、真菌OTU數量均高于相應的白肉火龍果；門分類水平表現為，子囊菌門（Ascomycota）真菌在紅肉火龍果植株莖部中的相對豐度占比高于相應的白肉火龍果，其相對豐度占比是白肉火龍果的1.15倍；屬分類水平表現為，鏈霉菌屬（）細菌是紅肉火龍果植株莖部中相對豐度占比最高的優勢細菌屬，青霉菌屬（）真菌是紅肉火龍果植株莖部中相對豐度占比最高的優勢真菌屬，二者相對豐度占比分別是白肉火龍果的1.24倍和4.27倍；另一方面，紅肉火龍果植株莖部中還富集了列契瓦尼爾氏菌屬（）、糖霉菌屬（）、未分類腸桿菌屬（）、馬杜拉放線菌屬（）等優勢細菌屬以及、、、、籃狀菌屬（）等優勢真菌屬。LEfSe差異分析結果顯示，原小單孢菌屬（）細菌和木霉菌屬（）真菌在紅肉火龍果植株莖部中顯著富集。【結論】內生微生物群落組成與紅肉火龍果果肉中色素的產生、代謝積累密切相關；鏈霉菌屬、未分類腸桿菌屬、原小單孢菌屬細菌及子囊菌門、青霉菌屬、籃狀菌屬和木霉菌屬真菌可能是紅肉火龍果果肉色素合成與代謝積累相關的功能微生物。

火龍果；果肉顏色；內生微生物；高通量測序

0 引言

【研究意義】火龍果（Britt）含有豐富的植物性蛋白、維生素、水溶性膳食纖維及鈣、磷、鐵等微量元素，具有很高的營養價值；其還含有各種酶、不飽和脂肪酸及抗氧化物質，具有一定的保健功效[1]。火龍果按照果肉顏色不同可以分為紅皮白肉火龍果（）以及紅皮紅肉火龍果（），紅肉火龍果果肉中含有豐富的紅色色素，其中含量最豐富的為甜菜紅素。甜菜紅素是一種水溶性的天然植物色素，是紅肉火龍果顏色的重要組成成分[2]，白肉火龍果果肉中則沒有甜菜紅素的產生與積累。甜菜紅素的存在使紅肉火龍果在膳食纖維、酚類物質和抗氧化性等方面比白肉火龍果具有優勢[3]。目前有關紅肉火龍果果肉中甜菜素產生與代謝積累有關的酶以及轉錄調控基因已經有了相關的研究，但其生物合成途徑及機制還沒有完全闡明，內生微生物是否對紅肉火龍果果肉中紅色素產生與代謝積累起作用還未見報道。研究白肉與紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構特征，探究內生微生物與紅肉火龍果果肉顏色形成的關聯，有助于進一步闡明火龍果甜菜紅素生物合成途徑及機制。【前人研究進展】植物內生微生物是指在植株生命周期中的某個時期或整個周期生活在植物細胞內且不會對其產生有害癥狀，并可與其互利共生的一類微生物[4]。植物內生微生物群落的組成受植物物種、植物生境、土壤類型和環境微生物等因素的控制[5-6]。內生微生物比例平衡的作物能改善自身營養或次生代謝物的積累與轉化，促進植株的新陳代謝[7]。微生物與果實色素的產生及代謝積累密切相關，其能夠產生各種與果實色素生成及代謝積累相關的植物內源激素。例如，慢生根瘤菌屬（）細菌可以產生生長素[8]；灰霉屬（）真菌可以生產脫落酸[9]；曲霉菌屬（）真菌可以合成赤霉素[10]；屬菌株在受控條件下具有產生茉莉酸酯的潛力[11]；番茄進入轉色期時施加外源低濃度脫落酸可促進類胡蘿卜素及番茄紅素的積累，加速番茄果實變紅[12]；施加外源低濃度脫落酸還可促進蘋果及柑橘類水果的著色，降低有機酸含量[13]；獨腳金內酯對花青素的合成有明顯的誘導作用[14]；茉莉酸和脫落酸對花青素的合成有明顯的誘導作用[15]。其中一些植物激素與甜菜紅素的合成也存在密切關系[16]。例如，細胞分裂素可通過活化多巴氧化酶蛋白，使其與酪氨酸結合，顯著促進甜菜紅素的積累[17]。水楊酸和茉莉酸在UV-B照射下被誘導，可以促進甜菜紅素的積累[18]。赤霉素和生長素會抑制甜菜紅素的生物合成[19]。微生物也與甜菜紅素生物合成途徑中的關鍵酶——酪氨酸酶有密切關聯，如從含甜菜紅素的毒蠅傘（）真菌菌蓋中分離純化并鑒定了一個既具有單酚酶活性又具有雙酚酶活性的酪氨酸酶[20]；Matoba等[21]首次從鏈霉菌屬（）細菌中解析出了酪氨酸酶的晶體結構。隨后，2011年又相繼報道了來自巨型芽孢桿菌（）[22]和雙孢蘑菇（）[23]中酪氨酸酶的三維結構。濕傘屬（）真菌顯示出紅色、粉紅色和紫色，是因為其富含甜菜紅素[24]；Wang等[25]從新西蘭青霉菌中，利用生物膜表面發酵法生產出了甜菜紅素。【本研究切入點】前人對火龍果果肉顏色的形成開展了相關研究，但多集中在果肉色素的提取、鑒定以及營養價值等方面[26]，內生微生物群落組成是否與火龍果果肉顏色存在相關性有待探究。【擬解決的關鍵問題】以紅皮白肉與紅皮紅肉火龍果品種為試驗材料，分析火龍果莖部內生微生物群落組成特征及功能，探究紅肉火龍果果肉顏色形成與植株內生微生物群落組的關聯，進而挖掘與紅肉火龍果果肉中相關色素合成與代謝積累相關的功能微生物，為進一步闡明火龍果甜菜紅素生物合成途徑及機制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗于廣西大學農學院蔬菜教學實驗基地（108°17′25″ E，22°51′02″ N）進行。試驗所用紅皮白肉火龍果品種為‘南寧白肉-3’，紅皮紅肉火龍果品種為‘軟枝大紅’。于2020年10月22日采用盆栽扦插的方式（盆高40 cm，直徑55 cm）進行種植，每個品種種植10株。

試驗盆栽土壤理化性質如下：土壤pH 5.84，有機質含量9.46 g?kg-1，全氮0.62 g?kg-1，全磷0.76 g?kg-1，全鉀7.83 g?kg-1，堿解氮16.36 mg?kg-1，速效磷0.56 mg?kg-1，速效鉀86.35 mg?kg-1。

1.2 樣品采集

樣品采集于2021年7月13日進行。操作步驟如下：隨機采集2種不同果肉顏色火龍果品種植株，每個品種隨機選取3株長勢一致的火龍果植株作為品種的3個重復進行處理分析。用經75%酒精消毒過的鐵鏟，以植株為中心將其半徑約25 cm的土壤鏟松，然后將整個植株連根拔起，采集植株相同節位莖部樣品，裝入密封袋并做好標記后帶回實驗室。用無菌水沖洗，去除樣品表面的泥土和附著物，用無菌濾紙吸干，裝入無菌袋中并寫好標記后送樣檢測。

1.3 試驗測定項目及方法

莖部樣品總DNA提取、PCR擴增：根據Fast DNA? Spin Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，U.S.）說明書從樣品中提取微生物群落基因組DNA，將所提DNA在1%瓊脂糖凝膠上進行提取物的檢查，后采取凝膠電泳法檢測DNA提取質量；并使用NanoDrop2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，U.S.）對所提DNA進行濃度和純度的檢測。最后以提取的莖部內生微生物群落基因組DNA為模板在ABI GeneAmp?9700（ABI, Carlsbad, CA, USA）上進行PCR擴增[27]，具體引物和測序類型如表1所示。

Illumina MiSeq測序：將同一樣本的PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳回收，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對PCR產物進行純化，經Tris-HCl緩沖液洗脫后，用Quantus? Fluorometer（Promega，USA）對回收產物進行定量檢測。使用純化后擴增片段進行Illumina文庫的構建，利用Illumina公司的MiSeq平臺進行測序。從植物莖樣品中提取總DNA的PCR擴增和測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行。

Illumina測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區分樣本后利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-sanger云數據分析平臺對樣本OTU進行聚類分析和物種分類學分析，然后基于聚類分析結果進行多樣性指數分析；基于分類學信息，于各個分類水平進行群落結構的統計分析[28]。

表1 測序類型與引物序列名稱

1.4 統計分析

試驗所得數據采用Excel 2019進行平均值的計算，而后將計算所得均值導入PASW Statistics 18統計軟件進行顯著性差異檢驗分析，數據采用“平均數±標準差（SD）”表示。內生微生物群落結構分析包括內生細菌和真菌的Alpha多樣性分析，采用Shannon指數和Simpson指數表征微生物多樣性，Ace指數和Chao1指數表示微生物豐富度[29]。

2 結果

2.1 OTU聚類分析

由表2可知，2種不同果肉顏色火龍果植株莖部內生細菌群落鑒定共獲得21個門、40個綱、106個目、174個科、303個屬、424個種、555個OTU。其中，白肉火龍果品種（RW）植株莖部內生細菌不同分類水平數量分別為：19個門、33個綱、93個目、149個科、262個屬、366個種、466個OTU；紅肉火龍果品種（RR）內生細菌不同分類水平數量分別為：19個門、35個綱、95個目、157個科、274個屬、377個種和491個OTU。另外，2種不同果肉顏色火龍果植株莖部內生真菌群落鑒定共獲得7個門、25個綱、63個目、117個科、191個屬、261個種、466個OTU。其中，白肉火龍果品種植株莖部內生真菌不同分類水平數量分別為：6個門、20個綱、44個目、88個科、125個屬、160個種、268個OTU；紅肉火龍果品種植株莖部內生真菌不同分類水平數量分別為：7個門、24個綱、58個目、103個科、153個屬、203個種和340個OTU。上述結果表明，紅肉火龍果植株莖部中，無論是內生細菌還是內生真菌，其不同分類的數量均高于相應的白肉火龍果。

表2 白肉與紅肉火龍果品種植株莖部內生微生物群落不同分類水平數量

2.2 多樣性指數

由表3可知，覆蓋率（Coverage）均達到99%以上，說明測序結果能夠有效反映物種的真實情況。利用PASW Statistics 18統計軟件對多樣性指數進行獨立樣本檢驗，發現表征細菌和真菌多樣性及豐富度的Shannon、Simpson、Ace與Chao1指數在紅肉和白肉火龍果品種之間均未達到顯著差異。表明無論是內生細菌還是真菌，它們的多樣性及豐富度在白肉和紅肉火龍果品種植株莖部中，均不存在顯著差異。

表3 白肉與紅肉火龍果品種莖部內生微生物群落的多樣性指數

相同小寫字母表示差異不顯著（＞0.05） The same lowercase letters indicate no significant differences (＞0.05)

2.3 白肉與紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構組成

2.3.1 內生細菌群落組成 在門分類水平，白肉與紅肉火龍果植株中，優勢內生細菌門類（相對豐度占比大于1%）數量均為3個（圖1）。其中，白肉火龍果植株莖部優勢內生細菌門類相對豐度占比大小順序依次為：放線菌門（Actinobacteriota，66.73%）＞變形菌門（Proteobacteria，30.60%）＞厚壁菌門（Firmicutes，1.04%）；紅肉火龍果植株莖部優勢內生細菌門分類水平占比大小順序依次為：放線菌門（Actinobacteriota，69.41%）＞變形菌門（Proteobacteria，27.74%）＞厚壁菌門（Firmicutes，1.13%）。表明兩品種植株莖部中優勢細菌門類組成和排序相同，僅放線菌門（Actinobacteriota）和厚壁菌門（Firmicutes）細菌在紅肉火龍果中相對豐度占比上升，而變形菌門（Proteobacteria）細菌相對豐度占比下降。

圖1 門分類水平中白肉（A）和紅肉（B）火龍果植株莖部優勢內生細菌相對豐度

在屬分類水平，白肉與紅肉火龍果植株莖部中優勢內生細菌屬（相對豐度占比大于1%）數量均為16個。其中，白肉火龍果植株莖部中，優勢內生細菌屬類別及相對豐度占比大小順序依次為：鏈霉菌屬（，34.82%）＞未分類鏈霉菌屬（，10.96%）＞戴氏菌屬（，7.57%）＞擬無枝酸菌屬（，3.14%）＞褚氏桿菌屬（，2.78%）＞克里布所菌屬（，2.50%）＞水螺菌屬（，2.49%）＞放線菌屬（，2.36%）＞阿菲波菌屬（，1.61%）＞諾卡氏菌屬（，1.50%）＞（1.46%）＞馬賽菌屬（，1.39%）＞德沃斯氏菌屬（，1.30%）＞鞘氨醇單胞菌屬（，1.22%）＞慢生根瘤菌屬（，1.18%）＞假雙斧狀菌屬（，1.10%）（圖2-A）。紅肉火龍果植株莖部優勢內生細菌屬類別及相對豐度占比大小順序依次為：鏈霉菌屬（，43.08%）＞未分類鏈霉菌屬（，4.90%）＞克里布所菌屬（，4.41%）＞阿菲波菌屬（，3.97%）＞放線菌屬（，2.60%）＞擬無枝酸菌屬（，2.16%）＞水螺菌屬（，2.10%）＞列契瓦尼爾氏菌屬（，1.80%）＞糖霉菌屬（，1.67%）＞慢生根瘤菌屬（，1.66%）＞戴氏菌屬（，1.58%）＞褚氏桿菌屬（，1.30%）＞德沃斯氏菌屬（，1.28%）＞未分類腸桿菌屬（，1.13%）＞假雙斧狀菌屬（，1.07%）＞馬杜拉放線菌屬（，1.03%）（圖2-B）。

上述結果表明，白肉與紅肉火龍果植株莖部中，優勢內生細菌屬類別與相對豐度占比存在明顯差異。白肉與紅肉火龍果植株莖部中相對豐度占比最高的優勢菌屬都為鏈霉菌屬，但其在紅肉火龍果植株莖部中的相對豐度占比為白肉中的1.24倍。同時，諾卡氏菌屬（）、、馬賽菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（）細菌是白肉火龍果品種植株莖部特有的優勢內生細菌屬；列契瓦尼爾氏菌屬（）、糖霉菌屬（）、未分類腸桿菌屬（）、馬杜拉放線菌屬（）細菌是紅肉火龍果植株莖部特有的優勢內生細菌屬。

圖2 屬分類水平中白肉（A）和紅肉（B）火龍果植株莖部優勢內生細菌相對豐度

2.3.2 內生真菌群落組成 在門分類水平上，白肉與紅肉火龍果品種植株莖部中優勢內生真菌門類（占比大于1%）數量分別為5個和4個。其中，白肉品種火龍果植株莖部優勢內生真菌門分類水平相對豐度占比大小順序依次為：子囊菌門（Ascomycota，62.86%）＞擔子菌門（Basidiomycota，32.22%）＞壺菌門（Chytridiomycota，2.02%）＞unclassified_k__Fungi（1.81%）＞被孢霉門（Mortierellomycota，1.09%）（圖3-A）；紅肉品種火龍果植株莖部優勢內生真菌門分類水平占比大小順序依次為：子囊菌門（Ascomycota，72.27%）＞擔子菌門（Basidiomycota，21.10%）＞壺菌門（Chytridiomycota，4.28%）＞unclassified_k__Fungi（1.84%）（圖3-B）。上述結果表明，白肉與紅肉火龍果植株莖部中相對豐度占比最高的優勢真菌門類均為子囊菌門，但其在紅肉火龍果植株莖部中的相對豐度占比為白肉中的1.15倍。此外，被孢霉門真菌是白肉火龍果植株莖部特有的優勢真菌門類。

圖3 門分類水平中白肉（A）和紅肉（B）火龍果植株莖部優勢內生真菌相對豐度

在屬分類水平，白肉與紅肉火龍果植株莖部中優勢內生真菌屬（占比大于1%）數量分別為12和14個。其中，白肉火龍果植株莖部優勢內生真菌屬相對豐度占比大小順序為：粗糙孔菌屬（，30.64%）＞鐮刀菌屬（，16.67%）＞未分類麥角菌屬（，14.97%）＞（7.87%）＞青霉菌屬（，4.77%）＞（4.38%）＞頭孢菌屬（，3.31%）＞短梗蠕孢屬（，2.38%）＞（2.00%）＞（1.81%）＞黑斑病菌屬（，1.46%）＞被孢霉屬（，1.07%）（圖4-A）。紅肉火龍果品種植株莖部優勢內生真菌屬相對豐度占比大小順序為：青霉菌屬（，20.35%）＞未分類麥角菌屬（，11.75%）＞粗糙孔菌屬（，11.24%）＞（10.33%）＞（8.04%）＞短梗蠕孢菌屬（，7.53%）＞（4.06%）＞（3.86%）＞鐮刀菌屬（，3.15%）＞（2.80%）＞（1.84%）＞（1.77%）＞籃狀菌屬（，1.41%）＞黑斑病菌屬（，1.35%）（圖4-B）。

上述結果表明，白肉與紅肉火龍果植株莖部優勢真菌群落組成存在明顯差異。白肉火龍果植株莖部中相對豐度占比最高的優勢菌屬為粗糙孔菌屬，而紅肉火龍果植株莖部中相對豐度占比最高的優勢菌屬為青霉菌屬，其相對豐度占比為白肉中的4.27倍。同時，頭孢菌屬（）、、被孢霉屬（）是白肉火龍果植株莖部特有的優勢內生真菌屬；、、、、籃狀菌屬（）是紅肉火龍果植株莖部特有的優勢內生真菌屬。

2.4 白肉與紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構組成差異

基于LEfSe分析（＜0.05，LDA score＞2.0）對白肉與紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構進行比較分析，從而找到白肉與紅肉火龍果植株莖部在豐度上有顯著差異的內生微生物。由圖5可知，紅肉與白肉火龍果植株莖部內生細菌群落結構存在顯著差異。戴氏菌屬（）、居土桿菌屬（）、雷夫松氏菌屬（）、未分類弗蘭克氏菌屬（）、中華單胞菌屬（）、扁平絲菌屬（）是白肉（RW）火龍果植株莖部中顯著富集的細菌屬；酸棲熱菌屬（）、、酸球形菌屬（）、、原小單孢菌屬（）、圣格奧爾根菌屬（）、酸球菌屬（）是紅肉火龍果植株莖部中顯著富集的細菌。

紅肉與白肉火龍果植株莖部內生真菌群落結構也存在顯著差異（圖6）。其中，白肉（RW）火龍果植株莖部中，僅擬青霉屬（）為顯著富集的真菌屬；紅肉火龍果植株莖部中，毛霉門（Mucoromycota）以及、白腐菌屬（）、齒梗孢屬（）、木霉菌屬（）、為顯著富集的真菌。

圖4 屬分類水平中白肉（A）和紅肉（B）火龍果植株莖部優勢內生真菌相對豐度

圖5 白肉與紅肉火龍果植株莖部內生細菌LEfSe分析多級物種層級樹圖（A）和LDA判別柱形圖（B）

圖6 白肉與紅肉火龍果植株莖部內生真菌LEfSe分析多級物種層級樹圖（A）和LDA判別柱形圖（B）

2.5 物種Venn分析

由圖7可知，白肉和紅肉火龍果植株莖部中，共有優勢細菌OTU數量為402個，紅肉火龍果特有的OTU數量為89個，而白肉火龍果特有的細菌OTU數量僅為64個（圖7-A）；另一方面，白肉和紅肉火龍果植株莖部中共有優勢真菌OTU數量為142個，紅肉火龍果特有的真菌OTU數量為198個，而白肉火龍果特有的真菌OTU數量僅為126個（圖7-B）。上述結果表明，紅肉火龍果植株莖部特有的細菌、真菌OTU數量均高于相應的白肉火龍果，紅肉火龍果需要招募更多的優勢微生物（細菌、真菌）種類才能完成其果肉色素的合成。

圖7 紅皮白肉和紅皮紅肉火龍果植株莖部內生細菌（A）和真菌（B）OTU分類水平Venn圖

3 討論

3.1 白肉與紅肉火龍果植株莖部內生細菌群落差異分析

前人研究發現，紅肉火龍果果肉顏色的成分較為復雜，其主要物質為甜菜紅素，類胡蘿卜素、類黃酮在紅肉火龍果的轉色成熟期也檢測出較高的含量[30]。與植物相比，微生物已經進化出更復雜的代謝途徑，在甲基化過程和蛋白質代謝中運輸、合成和進一步利用甜菜紅素，異養細菌如腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌、枯草芽孢桿菌（）和球形節桿菌（）等也可以合成甜菜紅素[31]。腸桿菌屬（）細菌還可產生類胡蘿卜素，現已成為進一步開發用于大規模生產類胡蘿卜素的功能微生物[32]；鏈霉菌屬菌株在發酵培養基中可產生擴散的深藍色和深紅色色素，其粗菌絲體提取物在傳統的紡織品染色程序中被廣泛用作生物著色劑[33]。此外，鏈霉菌屬細菌基因組測序中發現了大量的細胞色素P450基因，這些基因參與次級代謝物的生物合成[34]；另一方面，甜菜紅素的合成前體物質是酪氨酸，酪氨酸合成甜菜紅素途徑中需要細胞色素P450基因的參與才能正常形成[35]。由此推測，鏈霉菌屬細菌及未分類腸桿菌屬細菌大量富集于紅肉火龍果植株莖部，極有可能參與了紅肉火龍果果肉中色素的合成與積累。

3.2 白肉與紅肉火龍果植株莖部內生真菌群落差異分析

與白肉火龍果相比，紅肉火龍果植株莖部中內生真菌群落結構也存在顯著差異。子囊菌門真菌是色素生產方面研究最廣泛的微生物群體，子囊菌門中的絲狀真菌能產生多種天然色素；鏈孢霉菌屬（）真菌被認為是潛在的類胡蘿卜素生產者；尖孢鐮刀菌（）能產生粉紅色至紫色的蒽酮類色素[36]；Mapari等[37]研究發現隸屬青霉菌屬的幾種真菌能夠產生紅色至橙紅色色素，既不致毒也不致病；Mussagy等[38]發現青霉菌屬真菌可產生類胡蘿卜素；Wang等[25]則從新西蘭青霉菌中利用生物膜表面發酵法生產出了甜菜紅素；Lan等[39]研究證實多種籃狀菌屬（）的真菌能夠產生大量的紅色色素而不產生霉菌毒素，可以潛在地用作食品工業中的著色劑。由此推測，子囊菌門、青霉菌屬及籃狀菌屬真菌大量富集于紅肉火龍果植株莖部，也與紅肉火龍果果肉中色素的合成與積累密切相關。

3.3 白肉與紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構LEfSe分析

前人研究表明，隸屬子囊菌門的木霉菌屬真菌能夠產生多種色素，其色調從黃色到紫色不等[40-41]。Kang等[42]研究發現原小單孢菌屬的一種菌株（sp.SE188），能夠促進植物的生長和代謝，并增加植物的內源性脫落酸、水楊酸水平。脫落酸是一種重要的植物激素，可調節水果的成熟過程，并參與芳香物質的軟化、著色和合成過程[43]；水楊酸與果實色素積累、光合作用、乙烯生物合成、酶活性、代謝活動和植物的整體生長發育密切相關[44]。由此推測，本研究中木霉菌屬真菌及原小單孢菌屬細菌大量富集于紅肉火龍果植株莖部，極有可能參與了紅肉火龍果果肉中色素的合成與代謝積累。

4 結論

紅皮白肉與紅皮紅肉火龍果植株莖部內生微生物群落結構存在顯著差異，內生微生物群落組成與紅肉火龍果果肉中色素的產生、代謝及積累密切相關；紅肉火龍果莖部比白肉火龍果富集了更為豐富的內生微生物群落，尤其富集了鏈霉菌屬、未分類腸桿菌屬細菌，以及子囊菌門、青霉菌屬、籃狀菌屬和木霉菌屬真菌等許多與天然色素合成或累積密切相關的細菌和真菌，進而有助于紅色果肉的形成。

[1] 王生有, 陳于隴, 徐玉娟, 吳繼軍, 肖更生, 傅曼琴. 火龍果采后生理和保鮮技術的研究進展. 食品工業科技, 2014, 35(13): 396-400.

WANG S Y, CHEN Y L, XU Y J, WU J J, XIAO G S, FU M Q. Progress in postharvest physiology and preservative technology of pitaya. Science and Technology of Food Industry, 2014, 35(13): 396-400. (in Chinese)

[2] 郭攀陽, 曾燦彬, 劉成立, 韋雙雙, 黃家權, 湯華. 紅皮紅肉和紅皮白肉火龍果果肉呈色相關基因差異表達分析. 分子植物育種, 2021, 19(13): 4311-4326.

GUO P Y, ZENG C B, LIU C L, WEI S S, HUANG J Q, TANG H. Differential expression analysis of genes related to flesh color inand. Molecular Plant Breeding, 2021, 19(13): 4311-4326. (in Chinese)

[3] ARIVALAGAN M, KARUNAKARAN G, ROY T K, DINSHA M, SINDHU B C, SHILPASHREE V M, SATISHA G C, SHIVASHANKARA K S. Biochemical and nutritional characterization of dragon fruit (species). Food Chemistry, 2021, 353: 129426.

[4] 孫妍, 陳思宇, 肖健, 宋靜靜, 楊尚東. 不同果實形狀番茄品種莖部內生細菌群落結構及代謝功能特征. 西南農業學報, 2021, 34(12): 2586-2595.

SUN Y, CHEN S Y, XIAO J, SONG J J, YANG S D. Characteristics of endophytic bacterial community structure and metabolic function in stems of tomato varieties with different fruit shapes. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2021, 34(12): 2586-2595. (in Chinese)

[5] SUN K, LU F, HUANG P W, TANG M J, XU F J, ZHANG W, ZHOU J Y, ZHAO P, JIA Y, DAI C C. Root endophyte differentially regulates plant response to NO3–and NH4+nutrition by modulating N fluxes at the plant–fungal interface. Plant, Cell & Environment, 2022, 45(6): 1813-1828.

[6] 陳招榮, 劉新悅, 趙欣迪, 馬洪崢, 梁紅春. 植物內生菌群落組成及其功能研究進展. 生命科學, 2023, 35(2): 132-139.

CHEN Z R, LIU X Y, ZHAO X D, MA H Z, LIANG H C. Research progress on community composition and function of endophytes in plants. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2023, 35(2): 132-139. (in Chinese)

[7] 何玲敏, 葉建仁. 植物內生細菌及其生防作用研究進展. 南京林業大學學報(自然科學版), 2014, 38(6): 153-159.

HE L M, YE J R. Endophytic bacteria: Research advances and biocontrol applications. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Science Edition), 2014, 38(6): 153-159. (in Chinese)

[8] COSTACURTA A, VANDERLEYDEN J. Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria. Critical Reviews in Microbiology, 1995, 21(1): 1-18.

[9] SHI T Q, PENG H, ZENG S Y, JI R Y, SHI K, HUANG H, JI X J. Microbial production of plant hormones: Opportunities and challenges. Bioengineered, 2017, 8(2): 124-128.

[10] YADAV A N, KOUR D, KAUR T, DEVI R, YADAV A. Endophytic fungal communities and their biotechnological implications for agro-environmental sustainability.Folia Microbiologica, 2022, 67(2): 203-232.

[11] DOS SANTOS A Z, DE MELLO INNOCENTINI M D, LOUREN?O M V. Optimization of jasmonates bioproduction. BMC Proceedings, 2014, 8(4): 1-2.

[12] 翁倩, 周寶利, 于洋, 付亞文. 外源ABA、BR和ETH對番茄果實番茄紅素含量的影響. 沈陽農業大學學報, 2007, 38(6): 784-787.

WENG Q, ZHOU B L, YU Y, FU Y W. Effects of exogenous ABA, BR, ETH on changes of lycopene’s contents in fruit of tomato. Journal of Shenyang Agricultural University, 2007, 38(6): 784-787. (in Chinese)

[13] MUHAMMAD N, LUO Z, YANG M, LIU Z G, LIU M J. The underlying molecular mechanisms of external factors influencing fruit coloration in fruit trees. Scientia Horticulturae, 2023, 309: 111615.

[14] ITO S, NOZOYE T, SASAKI E, IMAI M, SHIWA Y, SHIBATA- HATTA M, ISHIGE T, FUKUI K, ITO K, NAKANISHI H, NISHIZAWA N K, YAJIMA S, ASAMI T. Strigolactone regulates anthocyanin accumulation, acid phosphatases production and plant growth under low phosphate condition in. PLoS One, 2015, 10(3): e0119724.

[15] LORETI E, POVERO G, NOVI G, SOLFANELLI C, ALPI A, PERATA P. Gibberellins, jasmonate and abscisic acid modulate the sucrose-induced expression of anthocyanin biosynthetic genes in. New Phytologist, 2008, 179(4): 1004-1016.

[16] ZHENG X L, LIU S C, CHENG C Z, GUO R F, CHEN Y K, XIE L Y, MAO Y Y, LIN Y L, ZHANG Z H, LAI Z X. Cloning and expression analysis of betalain biosynthesis genes in. Biotechnology Letters, 2016, 38(4): 723-729.

[17] STOBART A K, KINSMAN L T. The hormonal control of betacyanin synthesis in. Phytochemistry, 1977, 16(8): 1139-1142.

[18] CAO S F, LIU T, JIANG Y M, HE S G, HARRISON D K, JOYCE D C. The effects of host defence elicitors on betacyanin accumulation inseedlings. Food Chemistry, 2012, 134(4): 1715-1718.

[19] ZHU C H, JIN H, GUO Z F, LI G J, XIA K, XU Z G, NG D, GAN L J. Antagonistic effect of indole-3-acetic acid on kinetin-stimulated amaranthin accumulation in the cotyledons ofseedlings. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 2016, 91(2): 196-202.

[20] MUELLER L A, HINZ U, ZR?D J P. Characterization of a tyrosinase frominvolved in betalain biosynthesis. Phytochemistry, 1996, 42(6): 1511-1515.

[21] MATOBA Y, KUMAGAI T, YAMAMOTO A, YOSHITSU H, SUGIYAMA M. Crystallographic evidence that the dinuclear copper center of tyrosinase is flexible during catalysis. The Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(13): 8981-8990.

[22] SENDOVSKI M, KANTEEV M, BEN-YOSEF V S, ADIR N, FISHMAN A. First structures of an active bacterial tyrosinase reveal copper plasticity. Journal of Molecular Biology, 2011, 405(1): 227-237.

[23] ISMAYA W T, ROZEBOOM H J, WEIJN A, MES J J, FUSETTI F, WICHERS H J, DIJKSTRA B W. Crystal structure ofmushroom tyrosinase: Identity of the tetramer subunits and interaction with tropolone. Biochemistry, 2011, 50(24): 5477-5486.

[24] NABI B G, MUKHTAR K, AHMED W, MANZOOR M F, ALI NAWAZ RANJHA M M, KIELISZEK M, BHAT Z F, AADIL R M. Natural pigments: Anthocyanins, carotenoids, chlorophylls, and betalains as colorants in food products. Food Bioscience, 2023, 52: 102403.

[25] WANG H L, LI Y, ZHANG K, MA Y Q, LI P. Feasibility and transcriptomic analysis of betalain production by biomembrane surface fermentation of-zelandiae. AMB Express, 2018, 8(1): 1-10.

[26] 化青珠. 火龍果甜菜素生物合成關鍵基因的篩選與鑒定[D]. 廣州: 華南農業大學, 2020.

HUA Q Z. Identification and functional analyses of key genes related to betalain biosynthesis in pitaya [D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2020. (in Chinese)

[27] 陳思宇, 孫妍, 肖健, 趙天義, 楊尚東. 果實紅色與黃色番茄品種植株莖部內生細菌群落結構及代謝功能特征. 微生物學報, 2022, 62(2): 602-616.

CHEN S Y, SUN Y, XIAO J, ZHAO T Y, YANG S D. Characteristics of endophytic bacterial community structure and metabolic function in stems of tomatoes between red and yellow varieties. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(2): 602-616. (in Chinese)

[28] 肖健, 黃小丹, 楊尚東, 屈達才. 青枯病易感和鈍感桑樹品種根際土壤真菌群落結構比較. 廣西植物, 2022, 42(12): 2099-2108.

XIAO J, HUANG X D, YANG S D, QU D C. Comparison of fungal community structures in rhizosphere soil between sensitive and insensitive mulberry varieties to bacterial wilt. Guihaia, 2022, 42(12): 2099-2108. (in Chinese)

[29] 任奎瑜, 趙久成, 郭霜, 王帥帥, 張傳進, 龐師嬋, 楊尚東. 紅椎林中正紅菇生境的土壤肥力及真菌多樣性特征. 西南農業學報, 2020, 33(1): 109-116.

REN K Y, ZHAO J C, GUO S, WANG S S, ZHANG C J, PANG S C, YANG S D. Characteristics of soil biological properties and fungal diversity ofinforest. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2020, 33(1): 109-116. (in Chinese)

[30] 趙國文, 賈瑞宗, 郭靜遠, 郭安平. 紅心火龍果不同發育時期果肉呈色相關基因表達模式研究. 熱帶作物學報, 2021, 42(11): 3134-3145.

ZHAO G W, JIA R Z, GUO J Y, GUO A P. Expression patterns of flesh color related genes in red pitaya () at different developmental stages. Chinese Journal of Tropical Crops, 2021, 42(11): 3134-3145. (in Chinese)

[31] ZOU H B, CHEN N N, SHI M X, XIAN M, SONG Y M, LIU J H. The metabolism and biotechnological application of betaine in microorganism. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100(9): 3865-3876.

[32] WANG C L, ZHAO S L, SHAO X X, PARK J B, JEONG S H, PARK H J, KWAK W J, WEI G Y, KIM S W. Challenges and tackles in metabolic engineering for microbial production of carotenoids. Microbial Cell Factories, 2019, 18(1): 55.

[33] KRAMAR A, ILIC-TOMIC T, PETKOVIC M, RADULOVI? N, KOSTIC M, JOCIC D, NIKODINOVIC-RUNIC J. Crude bacterial extracts of two newsp. isolates as bio-colorants for textile dyeing. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014, 30(8): 2231-2240.

[34] CHO M A, HAN S, LIM Y R, KIM V, KIM H, KIM D.Cytochrome P450 enzymes and their roles in the biosynthesis of macrolide therapeutic agents. Biomolecules & Therapeutics, 2019, 27(2): 127-133.

[35] 吳景玉. 火龍果甜菜素生物合成途徑中關鍵酶基因克隆與初步功能分析[D]. 廣州: 華南農業大學, 2017.

WU J Y. Cloning and functional analyses of four genes related to betalain biosynthesis in[D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2017. (in Chinese)

[36] DE OLIVEIRA L A, SEGUNDO W O P F, DE SOUZA é S, PERES E G, KOOLEN H H F, DE SOUZA J V B. Ascomycota as a source of natural colorants. Brazilian Journal of Microbiology, 2022, 53(3): 1199-1220.

[37] MAPARI S A S, HANSEN M E, MEYER A S, THRANE U. Computerized screening for novel producers oflike food pigments inspecies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(21): 9981-9989.

[38] MUSSAGY C U, WINTERBURN J, SANTOS-EBINUMA V C, PEREIRA J F B. Production and extraction of carotenoids produced by microorganisms. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103(3): 1095-1114.

[39] LAN D H, WU B. Chemistry and bioactivities of secondary metabolites from the genus. Chemistry & Biodiversity, 2020, 17(8): e2000229.

[40] POORNIAMMAL R, PRABHU S, DUFOSSé L, KANNAN J. Safety evaluation of fungal pigments for food applications. Journal of Fungi, 2021, 7(9): 692.

[41] MERUVU H, DOS SANTOS J C. Colors of life: a review on fungal pigments. Critical Reviews in Biotechnology, 2021, 41(8): 1153-1177.

[42] KANG S M, KHAN A L, HAMAYUN M, HUSSAIN J, JOO G J, YOU Y H, KIM J G, LEE I J. Gibberellin-producingsp. SE188 improvesplant growth and influences endogenous plant hormones. Journal of Microbiology, 2012, 50(6): 902-909.

[43] ALI B. Salicylic acid: An efficient elicitor of secondary metabolite production in plants. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2021, 31: 101884.

[44] KOU X H, YANG S, CHAI L P, WU C E, ZHOU J Q, LIU Y F, XUE Z H. Abscisic acid and fruit ripening: Multifaceted analysis of the effect of abscisic acid on fleshy fruit ripening. Scientia Horticulturae, 2021, 281: 109999.

Characteristics of Endophytic Microbial Community Structures in Stems Betweenand

ZHOU XinYan1, CHEN SiYu1, Wei YuFei1, Zhu Yu1, FENG JunQian1, DING DianCao1, LU GuiFeng2, YANG ShangDong1

1College of Agriculture, Guangxi University/Guangxi Key Laboratory of Agricultural Products Safety/National Experimental Teaching Demonstration Center of Plant Science, Nanning 530004;2Horticultural ResearchInstitute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007

【Objective】The differences of the endophytic microbial community structures betweenandwere analyzed, so as so to explore the correlation between the pulp color ofand the endophytic microbial community composition and their functional microorganisms. 【Method】Based on high-throughput sequencing technology, the diversity and richness of endophytic microorganisms (bacteria and fungi) in stems betweenandwere analyzed. Meanwhile, based on LEfSe analysis, the differences of endophytic microorganisms in stems betweenandwere also investigated.【Result】The significant differences of the endophytic microbial community structures were found in stems betweenandMeanwhile, the numbers of specific bacterial and fungal OTUs in stems ofwere all higher than those of. At the phylum level, the relative abundance ratio of Ascomycota in stems ofwas 1.15 times higher than that of. At the genus level,andwere the highest abundant dominant bacterial and fungal genera in stems of, which were 1.24 and 4.27 times higher than those of, respectively. In addition, some bacterial genera, such as,,,,and some fungal gerera, such as,,,,were enriched in stems of. LEfSe analysis also showed thatandwere significant enriched in stems of. 【Conclusion】All above results suggested that the formation of pigment was closely related to the compositions of endophytic microbial community in stems of. The bacterial genera, such as,,,and the fungal phylum and genera, such as Ascomycota,,and, were all the potential microorganisms in relating to pigment synthesis and metabolic accumulation in stems of.

Pitaya (Britt); pulp color; endophytic microorganisms; high-throughput sequencing

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.02.015

2023-05-05；

2023-06-09

廣西重點研發計劃（桂科AB 19245012）、廣西研究生教育創新計劃資助項目（YCSW2023038）

周信雁，E-mail：1663848865@qq.com。通信作者陸貴鋒，E-mail：122447160@qq.com。通信作者楊尚東，E-mail：ysd706@gxu.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）