PLZF的克隆及其對犏牛未分化精原細胞的增殖作用

張鵬，王明秀，敬科民，李雨謙，田園，鐘金城，蔡欣

的克隆及其對犏牛未分化精原細胞的增殖作用

張鵬，王明秀，敬科民，李雨謙，田園，鐘金城，蔡欣

西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室，成都 610041

【目的】犏牛作為牦牛與黃牛的種間雜交產物，具有優良的生產性能，但其雜種優勢的進一步應用卻受限于犏牛雄性不育。通過克隆犏牛，明確其在犏牛和牦牛睪丸組織和未分化精原細胞中的差異表達，并進一步揭示過表達該基因對犏牛未分化精原細胞活性的影響。為闡明犏牛生精停滯的作用機制提供理論基礎。【方法】以24月齡公麥洼牦牛和F1代公犏牛為實驗動物，通過RT-PCR法克隆得到了犏牛的CDS序列，并進行了生物信息學分析；通過RT-qPCR法分析在犏牛和牦牛睪丸組織中的差異表達；采用同源重組的方法構建了的表達載體，并利用RT-qPCR檢測了過表達效率及其下游靶基因的表達；通過PDT、CCK-8、EdU和免疫熒光檢測了過表達對犏牛未分化精原細胞增殖活性的影響。【結果】克隆獲得了犏牛的CDS區，并通過生物信息學分析發現該基因編碼的蛋白序列不包含跨膜結構域和信號肽序列，其三級結構以α螺旋和無規卷曲為主。系統進化樹分析表明犏牛與黃牛的親緣關系更近。三級結構預測發現，雖然犏牛、牦牛和黃牛的PLZF蛋白三級結構高度相似，但牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸處與犏牛和黃牛有較大差異。RT-qPCR發現，在犏牛睪丸組織和未分化精原細胞中的表達均顯著低于牦牛（＜0.05），而在犏牛未分化精原細胞中過表達后，該基因的表達上調了13.8倍（＜0.01），且能顯著增加犏牛未分化精原細胞的增殖活性（＜0.05），表明表達下調影響了犏牛未分化精原細胞增殖活性。此外，過表達后，犏牛未分化精原細胞中與增殖相關的基因（、、和）全部顯著上調（＜0.05），與分化相關的基因（、、和）全部顯著下調（＜0.05），表明通過上調增殖相關基因、下調分化相關基因的表達促進犏牛未分化精原細胞增殖。【結論】在犏牛未分化精原細胞中表達異常降低了犏牛未分化精原細胞增殖活性，導致其數量減少，影響了犏牛的精子發生。本試驗為進一步闡明犏牛生精停滯的作用機制提供了理論基礎，并為解決犏牛雄性不育問題提供了新的思路。

犏牛；PLZF；未分化精原細胞；增殖

0 引言

【研究意義】犏牛作為牦牛和黃牛的種間雜交產物，具有優良的雜種優勢，但因F1代雄性犏牛不育而導致雜種優勢無法擴大應用[1]。【前人研究進展】之前的研究發現，犏牛生精停滯的主要原因包括生精小管中細胞數量稀少及減數分裂過程受阻[2-3]。犏牛生殖細胞生態位中蛋白因子分泌不足是犏牛未分化精原細胞數量稀少重要原因[4]，而細胞自主轉錄因子對其增殖活性的影響也不可忽視。早幼粒細胞白血病鋅指蛋白（promyelocytic leukaemia zinc finger，PLZF）是一種轉錄阻遏物，通過Kruppel型鋅指結構域與DNA結合，并通過POZ域募集組蛋白脫乙酰酶（HDACs）來抑制轉錄過程[5]。最初PLZF被發現與急性早幼粒細胞白血病有關[6]。但之后的相關研究表明，PLZF的缺失會導致進行性生殖細胞的喪失、睪丸發育不良和不育[7]。PLZF在精原細胞中特異表達，并在促進SSC自我更新中發揮關鍵的細胞自主作用，因此PLZF被廣泛用作未分化精原細胞的標記物[8-9]，另外在單細胞RNA測序的結果中PLZF也被鑒定為未分化精原細胞的標記物[10]。PLZF還可作為一種轉錄調節劑，能夠調控靶基因的表達。目前已經發現PLZF至少以5種不同的方式發揮作用，以維持SSCs數量：①調節某些轉錄因子的活性（例如SALL4），以抑制分化，保持SSCs的干性[11]；②直接抑制SSCs中分化相關基因的表達（例如），刺激增殖相關基因的表達[12]；③通過上調Redd1的表達抑制mTORC1途徑，抑制SSCs的分化[13]；④下調某些microRNA的表達（例如mir146a），解除microRNA對SSCs增殖相關的信號通路的抑制作用[14]；⑤抑制某些反轉錄轉座子的活性（例如LINE1），降低反轉錄轉座子對生殖細胞的損害[15]。PLZF與GDNF共享了多個靶基因（、、等），也能通過下調mir146a解除對CXCR4的抑制作用，因此PLZF可能處于一個信號回路，該回路能夠放大或促進SSCs對增殖或自我更新相關信號通路的響應。【本研究切入點】以上研究提示可能對犏牛未分化精原細胞的增殖活性具有重要作用，而相關的研究報道較少。【擬解決的關鍵問題】本研究以F1代犏牛為研究對象，克隆得到序列，并檢測了該基因在犏牛和牦牛睪丸組織中的表達，利用生物信息網站預測其功能，并進一步在犏牛未分化精原細胞中進行驗證。這些結果將為探究對犏牛未分化精原細胞的調控作用奠定基礎，并為解析犏牛生精停滯的原因提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究于2022年8—12月在四川省成都市西南民族大學青藏高原遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室完成的。

1.1.1 睪丸組織采集 于2020年5月12日在四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣選取24月齡健康的公麥洼牦牛和F1代公犏牛各3頭，取其睪丸組織。用滅菌PBS將睪丸組織沖洗干凈，去除附睪及睪丸白膜。將睪丸組織沿縱膈切開，部分睪丸組織剪切成約2 mm3的小塊后進行玻璃化冷凍處理；剩余睪丸組織直接凍存在液氮中。

1.1.2 未分化精原細胞的分離和培養 將解凍的玻璃化冷凍的睪丸組織轉移至含有DMEM/F-12液體培養基培養皿中，漂洗。將漂洗后的睪丸組織轉移至新的培養皿中，加入2 mL PBS，并將睪丸組織進一步剪碎，轉移至50 mL離心管中。加入3 mL PBS將培養皿沖洗干凈，洗滌液一并轉移到離心管中。將37 ℃預熱的膠原酶IV溶液加入離心管中，并添加10 μL 2 μg·mL-1Dnase I，于37 ℃、180 r/min條件下振蕩消化，鏡檢能觀察到曲細精管時停止消化。將離心管置于冰中，沉降3 min。棄上清，向沉淀中再加入10 mL 1 mg·mL-1膠原酶IV溶液和10 μL 2 μg·mL-1Dnase I，于37 ℃、180 r/min條件下振蕩消化，鏡檢能觀察到細胞散開時終止消化。將消化得到的細胞依次經70和40 μm細胞篩過濾至新的50 mL離心管中。4 ℃、350×離心6 min后，棄上清，重懸浮沉淀。混合細胞懸液培養24 h差速貼壁后，收集上清液，連續培養3代，用RT-PCR和免疫熒光進行鑒定[16]。

1.1.3 主要試劑及儀器 特級胎牛血清（FB25015，CLARK），DMEM高糖培養基（SH30021.01B，Hyclone），二氧化碳培養箱（Model 3111，Thermo），倒置熒光顯微鏡（Axio Observer 3，Zeiss），實時熒光定量PCR儀（A28140，Thermo），細胞計數儀（Thermo Countess II，Thermo），酶標儀（1510，Thermo）。

1.2 目的基因的獲取

1.2.1 RNA的提取 將睪丸組織樣品從液氮中取出，搗碎成粉末。稱取組織粉末約0.1 g并置于1.5 mL Rnase-free離心管中，加1 mL Trizol，漩渦振蕩混勻，室溫下靜置5 min。12 000 r/min、4 ℃離心5 min。取上清液至新的1.5 mL Rnase-free離心管，加入200 μL氯仿，渦旋振蕩混勻，室溫下靜置2 min。12 000 r/min、4 ℃離心10 min。將上層的透明相吸到新的1.5 mL Rnase-free離心管中，加入500 μL異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。12 000 r/min、4 ℃離心10 min。棄上清，加入1 mL 75 %乙醇洗滌沉淀。7500 r/min、4 ℃離心5 min。棄上清，加50 μL Rnase-free H2O，溶解RNA。用超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度及純度。將剩余RNA進行逆轉錄反應或置于-80 ℃保存。

收集未分化精原細胞，500×、4 ℃離心6 min，棄上清。加入1 mL PBS重懸浮細胞，將細胞稀釋至1×107個/mL，每個1.5 mL Rnase-free離心管分裝1mL細胞懸液。500×、4 ℃再次離心6 min，棄上清。加入1 mL Trizol，混勻后靜置10 min。加入200 μL氯仿，渦旋振蕩混勻15 s，靜置2 min。12 000 r/min、4 ℃離心10 min。后續試驗步驟同組織中提取RNA。

1.2.2 逆轉錄PCR 利用HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）試劑盒（R323-01）將RNA逆轉錄為cDNA。

基因組DNA的去除：將4 μL 4×DNA wiper Mix、1 μL 1 μg·μL-1RNA和11 μL Rnase-free H2O在200 μL離心管中輕輕吹打混勻，42 ℃放置2 min。

逆轉錄反應：向上述16 μL反應液中加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix，在37 ℃放置15 min，85 ℃放置5 s。將最終的產物置于-20 ℃保存。

1.2.3 引物設計與合成 根據NCBI（https://www. ncbi.nlm.nih.gov）網站中牦牛相關基因的mRNA預測序列，利用Primer premier 5.0軟件設計基因克隆引物（表1），利用Primer3web（https://primer3.ut.ee）設計熒光定量PCR引物和細胞鑒定的引物（表2），利用Primer Premier5.0軟件設計基因克隆引物。引物由北京擎科（成都）生物科技有限公司合成。

1.2.4 TD-PCR 在200 μL離心管中將25 μL Maxima Hot Start Green PCR Master Mix（2×）、2 μL F-primer、2 μL R-primer、2 μL cDNA和19 μL ddH2O混勻。按照表3中程序進行PCR反應，凝膠電泳檢測，并進行膠回收。

表1 PLZF克隆引物

F.正向引物；R.反向引物。下劃線序列表示酶切位點，加粗序列表示同源臂序列

F. Forward primer; R. Reverse primer. The underlined sequence indicates an enzyme cleavage site, and the bold sequence indicates a homologous arm sequence

表2 RT-qPCR引物序列

表3 RT-qPCR反應程序

反應程序：95℃預變性5 min，[95 ℃變性30 s，65℃退火30 s（每一個循環降1℃），72℃延伸3 min] 15個循環，[95 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min] 20個循環。

1.3 表達載體的構建

1.3.1 目的基因與載體的連接 采用OK Clon連接試劑盒（AG11807）。將pcDNA3.1（+）空載質粒用HI和dIII于37℃雙酶切16 h，制備線性載體。用帶有同源臂的克隆引物克隆，并經膠回收后純化。將8 μL 2.5×OK Clon Master Mix、5 μL（100 ng）、4 μL線性pcDNA3.1+載體（100 ng）和3 μL Rnase-free H2O加入200 μL離心管中，配成連接反應液，50℃放置15 min。取10 μL 連接反應液，加入100 μL感受態細胞中，混勻，冰浴30 min后，42℃水浴45 s。之后迅速置于冰上2 min。加入900 μL LB液體培養基，37℃、200 r/min培養1 h。取100 μL菌液均勻涂布于帶有Amp抗性的LB固體培養基上，37 ℃倒置培養16 h。然后進行陽性克隆篩選。

1.3.2 質粒回收 利用FsatPure EduoFree Plasmid Maxi Kit（DC301）進行pcDNA3.1（+）-PLZF表達載體回收。取150 mL過夜培養的菌液，11 000 r/min離心2 min，棄上清液，收集菌體。向離心管中加入7.5 mL Buffer P1，渦旋振蕩混勻至看不到細菌團塊。加入7.5 mL Buffer P2，上下顛倒8次，室溫放置5 min。加入7.5 mL Buffer P4，上下顛倒8次，11 000 r/min離心15 min。取上清液至新的離心管中，加入0.1倍體積的內毒素清除劑，冰浴5 min后，室溫放置15 min。11 000 r/min離心10 min，取上層水相至新的離心管中。加入0.5倍體積的異丙醇，顛倒混勻，轉移到吸附柱中，11 000 r/min離心1 min。棄濾液，加入10 ml 漂洗液，11 000 r/min離心1 min。棄濾液，再次加入10 mL漂洗液，11 000 r/min離心1 min。棄濾液，11 000 r/min離心3 min。將吸附柱放置于新的離心管中，加入1 mL Buffer TB，室溫放置3 min，11 000 r/min離心3 min。將收集的質粒置于-20℃保存。

1.4 表達載體轉染細胞

本研究采用的是Yeasen公司的Hieff Transfection Reagent試劑（40802ES02）。用不含血清和雙抗的生精培養基將未分化精原細胞稀釋至1×106個/mL，每24孔板加入500 μL細胞懸液。用50 μL DMEM/F-12培養基稀釋0.5 μg 1.3.2中獲得的pcDNA3.1（+）-PLZF表達載體，混勻。用50 μL DMEM/F-12稀釋4 μL 脂質體轉染試劑，并在室溫放置5 min。將稀釋的pcDNA3.1（+）-PLZF表達載體和轉染試劑混合，室溫孵育20 min。將100 μL DNA-轉染試劑加入到24孔板中，搖動培養板，輕輕混勻。37℃、5% CO2培養6 h后，向培養基中補加55 μL FBS和300 μL不含雙抗的培養基，24 h后提取細胞RNA，測定轉染效率。

1.5 細胞增殖檢測

1.5.1 細胞群體倍增時間 參照文獻[17]的方法測算細胞群體倍增時間（population doubling time，PDT），將牦牛和犏牛的未分化精原細胞接種于12孔板中，濃度為2×106個/mL，終體積為1.5 mL。分別于不同的培養基中進行培養。每種處理3個重復。在培養48 h后，用Countess? II進行細胞計數。按照公式（1）

PDT=[log2/（logNt-logN0）]×t （1）

計算細胞群體倍增時間，其中，t為培養時間，N0為初始培養的細胞數量，Nt為培養t時間后的細胞數量。

1.5.2 CCK-8 將牦牛和犏牛的試驗組和對照組的未分化精原細胞接種于96孔板中，濃度為2×104個/mL，終體積為100 μL。分別于不同的培養基中進行培養。每種處理5個重復。在0、24、48、72和96 h時分別加入10 μL CCK-8 Solution（A311），在37℃培養箱中孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光值。

1.5.3 EdU染色 按照BeyoClickTMEdU-594細胞增殖檢測試劑盒（C0078S）說明書，向12孔板培養的未分化精原細胞中加入1.2 μL EdU工作液，37℃孵育2 h。收集懸浮培養的未分化精原細胞，350×、4℃離心6 min后棄上清，用1 mL PBS重懸浮并稀釋至1×105—5×105個/mL。將200 μL 細胞懸液置于多聚賴氨酸處理的玻片上，待大部分液體變干后用免疫組化筆標記位置，并將玻片置于濕盒中。用200 μL 4% 多聚甲醛固定30 min后，用100 μL 2% Triton X-100滲透20 min。用200 μL Click反應液孵育30 min，細胞核用H33342染色10 min，在倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.5.4 免疫熒光 收集懸浮生長的細胞，350×、4℃離心6 min后棄上清，用1 mL PBS重懸浮并稀釋至1×105—5×105個/mL。將200 μL細胞懸液置于多聚賴氨酸處理的玻片上，待大部分液體變干后用免疫組化筆標記位置，并將玻片置于濕盒中。用200 μL 4% 多聚甲醛固定10 min。PBST清洗3次，5 min/次。滴加100 μL PBSX孵育樣品 20 min。PBST 洗滌2次，5 min/次。100 μL 3% BSA封閉2 h。去除BSA，滴加DDX4抗體（ab13840，1﹕200）150 μL，4 ℃避光孵育15 h。棄一抗，并經PBST 洗滌3次，15 min/次。滴加Alexa Fluor?488（ab150077，1﹕500）150 μL，避光孵育2 h。用PBST洗滌細胞3次，15 min/次。加入DAPI染色液覆蓋樣品，放置10 min。PBST洗滌2次，5 min/次。滴加少量抗淬滅劑，蓋上蓋玻片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（Q711）進行實時熒光定量PCR反應。在200 μL離心管中將10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL F-primer、0.4 μL R-primer、1 μL cDNA和8.2 μL ddH2O混勻。按照表3中程序進行RT-qPCR反應。

1.7 統計與分析

RT-qPCR以為內參，采用ΔΔCt法分析。使用GraphPad Prism 9.0.0統計軟件（GraphPad Inc.，美國）進行單因素方差分析，以確定是否具有統計學意義的差異（＜0.05或＜0.01）。除非另有說明，否則每組試驗重復至少3次。

2 結果

2.1 PLZF克隆

以犏牛睪丸組織cDNA為模板，通過TD-PCR獲得與預期目的片段大小相同的條帶，回收純化后連接pcDNA3.1（+）載體，轉化大腸桿菌，菌落PCR鑒定后送測序。結果表明，成功克隆得到PLZF的基因的CDS區2 022 bp，編碼673個氨基酸殘基，其3′端和5′端分別帶有dIII和HI酶切位點及一段15 bp的同源臂序列（表1，圖1）。Blasten分析表明，犏牛與GenBank中牦牛、黃牛、瘤牛、豬和山羊的核苷酸相似性分別為98.96%、99.80%、99.75%、94.07%和97.23%，且黃牛、瘤牛、山羊和豬的CDS區長度都為2 022 bp，僅牦牛的CDS區長度為2 019 bp（表4）。通過DNAMAN軟件對上述6個物種的CDS區進行序列比對，結果表明犏牛的CDS區在第344位、602位和1827位的核苷酸與其他物種均存在差異（圖2-A—C）。此外，相比其他物種，牦牛PLZF基因缺少的3個核苷酸位于1 616— 1 618位；犏牛與牦牛PLZF基因的主要差異在1 595— 1 618位，而該區域犏牛與黃牛PLZF基因序列沒有差異（圖2-D）。

P和M分別表示PLZF和Marker

表4 不同物種PLZF的CDS區序列對比

圖2 不同物種PLZF的CDS區序列比對

2.2 PLZF生物信息學分析

生物信息學分析結果表明，PLZF蛋白分子式為C3223H5073N911O1007S49，分子量為74 267.18 u，等電點PI為5.98，在哺乳動物離體網織紅細胞中的半衰期為30 h，不穩定系數為57.17，脂肪系數為69.47。TMHMM預測結果顯示，犏牛PLZF蛋白沒有跨膜區域（圖3-A）；信號肽預測結果顯示，犏牛PLZF蛋白不存在信號肽序列（圖3-B）。犏牛PLZF蛋白親/疏水性預測最大值是2.544（第492位半胱氨酸），最小值是-3.187（第147位天冬氨酸），總親/疏水系數為-0.450，在126—153，293—332，553—629、639—666等區域有較強的疏水性（圖3-C）。SPOMA預測結果顯示，犏牛PLZF蛋白中無規卷曲占比最高，為49.48%，α螺旋為37.44%，β折疊為10.10%（圖3-D）。利用MEGA7.0軟件對犏牛及Genbank中9個不同的物種PLZF基因序列構建系統進化樹，如圖3-E所示，犏牛與黃牛（）親緣關系最近，其次是瘤牛（）及瘤牛和黃牛的雜交種（×），牦牛（）居第四位，其后依次是水牛（）、綿羊（）、山羊（）、豬（）和人（）。

A為跨膜結構域預測分析。B為親/疏水性預測分析。C為信號肽序列預測分析。D為蛋白質二級結構預測分析。E為PLZF基因序列系統進化樹

通過DNAMAN軟件對犏牛、牦牛和黃牛PLZF蛋白的氨基酸序列進行序列比對，結果發現牦牛與犏牛和黃牛氨基酸序列差異主要位于531—539位氨基酸，且牦牛在此區域缺少一個氨基酸殘基，而犏牛和黃牛PLZF蛋白在此區域的氨基酸序列沒有差異（圖4-A）。但犏牛與牦牛和黃牛的PLZF蛋白在第609位氨基酸殘基處出現差異，犏牛在該位點的氨基酸為半胱氨酸，牦牛與黃牛則是精氨酸（圖4-B）。通過SWISS-MOFEL在線網站預測了犏牛、牦牛和黃牛PLZF蛋白的三級結構，發現三種牛的PLZF蛋白三級結構高度相似，均以α螺旋和無規卷曲為主，幾乎沒有β折疊結構（圖4-C-E）。牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸殘基處的結構與犏牛和黃牛差異較大，且在該位點的兩個苯環均來自脯氨酸，相距較遠，而犏牛和黃牛PLZF蛋白在該位點的兩個苯環均來自組氨酸，相距較近（圖4-F—H）。犏牛PLZF蛋白在609位氨基酸殘基雖然與牦牛和黃牛不同，但其結構并沒有太大的差異（圖4-I—K）。

A和B為犏牛、牦牛和黃牛PLZF氨基酸序列差異分析。C-E為犏牛、牦牛和黃牛PLZF蛋白三級結構預測。F-K為犏牛、牦牛和黃牛PLZF蛋白結構差異分析

2.3 PLZF在牦牛和犏牛睪丸組織中的差異表達

以為內參基因，利用RT-qPCR檢測在牦牛和犏牛睪丸組織中的檢測。結果顯示，在犏牛睪丸中的表達顯著低于在牦牛中的表達（圖5，＜0.01）。

2.4 PLZF表達載體的構建

基因片段純化后，與經過dIII和HI雙酶切的線性質粒pcDNA3.1（+）通過同源重組的方式進行連接。將連接產物轉化到感受態細胞，挑取陽性菌落擴繁后測序，并菌液質粒進行雙酶切鑒定。

結果顯示，pcDNA3.1（+）-PLZF表達載體酶切后的產物在2 000 — 8 000 bp之間有2條陽性條帶，分別與條帶和線性pcDNA3.1（+）條帶大小一致（圖6-A），且測序結果與預測序列一致，表明pcDNA3.1（+）-PLZF表達載體構建成功。

YK表示牦牛，CY表示犏牛（下同）。**表示P＜0.01

2.5 PLZF過表達效率

在犏牛未分化精原細胞中的表達量顯著低于牦牛（圖6-B，＜0.05）。將pcDNA3.1（+）-PLZF表達載體導入犏牛未分化精原細胞，誘導24 h后收集細胞，檢測其過表達效率。結果表明，與CY相比，CY-PLZF中PLZF表達量上調了約13.8倍（圖6-B，＜0.01）。

A：pcDNA3.1（+）-PLZF表達載體的酶切鑒定。M、1、2和3分別表示Marker、表達載體雙酶切、PLZF基因克隆和線性pcDNA3.1（+）空載體；B：PLZF基因的過表達效率。不相同字母的柱狀圖表示有顯著差異（P＜0.05）。CY-PLZF表示犏牛未分化精原細胞中PLZF基因過表達。下同

2.6 過表達PLZF對犏牛未分化精原細胞的影響

如圖7-A所示，CY-PLZF中PDT均顯著低于CY，與YK無顯著差異（＜0.05）。CCK-8結果顯示，CY-PLZF的增殖活性均顯著高于CY-，但低于YK（圖7-B，＜0.05）。EdU染色結果顯示，過表達后犏牛未分化精原細胞增殖活性增強（圖7-C）。免疫熒光結果顯示，過表達能增加DDX4陽性細胞的數量（圖7-D）。

2.7 過表達PLZF對犏牛未分化精原細胞增殖和分化相關基因的影響

如圖8所示，過表達后，與增殖相關的基因（、、和）全部顯著上調（＜0.05），且和表達量顯著高于牦牛（＜0.05），與分化相關的基因（、、和）全部顯著下調（＜0.05）。

圖8 PLZF靶基因在犏牛未分化精原細胞中的表達

3 討論

3.1 PLZF的克隆及生物信息學分析

PLZF是未分化精原細胞的自主轉錄因子，對未分化精原細胞的命運調控至關重要[18-19]。本試驗得到的犏牛的CDS區為2 022 bp，編碼673個氨基酸殘基，并將犏牛的CDS區翻譯成氨基酸序列，分析了其蛋白特征信息、預測了其二級結構和三級結構。

二級結構分析結果表明，PLZF蛋白沒有跨膜結構域及沒有信號肽區域，與其屬于轉錄因子的亞細胞定位一致。系統進化樹分析發現，犏牛與黃牛的相似度比牦牛高，進一步進行序列比對后發現，牦牛的CDS區在1 616 — 1 618位點比犏牛和黃牛少3個核苷酸，且在相鄰的CDS區域中牦牛與犏牛、黃牛的核苷酸序列差異較大，由此造成了牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸殘基處的結構與犏牛和黃牛有較大差異。但這種差異對不同牛種PLZF蛋白的影響還需進一步的研究。

另外，通過比對犏牛和不同物種的CDS區，發現犏牛的CDS區在344位、602位和1827位的核苷酸與其他物種均不同。通過比對氨基酸序列發現，344位和602位核苷酸的改變并不會影響氨基酸種類，但1 827位的核苷酸的差異導致犏牛PLZF蛋白中609位的氨基酸殘基與牦牛和黃牛不同，但對犏牛PLZF蛋白的結構似乎并沒有影響。

3.2 PLZF的低表達對犏牛未分化精原細胞的影響

在犏牛睪丸組織和未分化精原細胞中的表達水平均顯著低于牦牛，且CY組未分化精原細胞增殖活性也顯著低于YK組，表明在犏牛未分化精原細胞中的異常表達會影響其增殖。而將pcDNA3.1（+）-PLZF過表達載體導入犏牛未分化精原細胞后，的表達顯著上調，犏牛未分化精原細胞增殖活性顯著增加，細胞群體倍增時間明顯縮短，表明能促進犏牛未分化精原細胞的增殖，以維持未分化精原細胞數量，這與BUAAS等[7]研究結果一致。

Bcl6b與精原干細胞自我更新密切相關[20]，c-fos能促進精原干細胞進入有絲分裂S期[21]，而CY組中和的表達顯著低于YK組，表明犏牛未分化精原細胞增殖活性下降的原因是增殖相關基因的異常表達。此外，上述兩個基因都受到的調控[14]，表明在犏牛未分化精原細胞中表達下調影響力增殖相關基因的表達，造成了其增殖活性的降低。WU等[22]觀察到犏牛生精小管中精原細胞數量顯著低于牦牛，因此可以推斷，表達異常影響了犏牛的增殖活性，會導致犏牛精原細胞數量減少。

3.3 PLZF過表達能促進犏牛未分化精原細胞的增殖

過表達以后，與分化相關基因（、、和）的表達在CY-PLZF中均顯著下調，表明PLZF能抑制分化相關基因的表達，這與Song等[23]研究結果一致；與增殖相關的基因（、、和）的表達均顯著上調，表明PLZF能促進增殖相關基因的表達，但PLZF作為轉錄抑制因子，不能直接上調基因的表達[24]，因此，PLZF上調這些基因的表達可能通過抑制某些分化相關轉錄因子的活性或者抑制某些miRNA的活性，以解除該因子或miRNA對增殖相關基因或通路的抑制，間接上調增殖相關基因的表達。例如，被PLZF抑制的轉錄因子Sohlh2能抑制增殖相關基因的表達，上調、等分化相關基因的表達[25]；而miR146a也能被PLZF抑制進而激活CXCR4通路，促進未分化精原細胞增殖[26]。

3.4 單一地過表達PLZF不能完全拯救犏牛生精停滯

CY-PLZF中的表達顯著高于YK組，增殖相關基因和的表達顯著高于YK組，且分化相關基因（、、和）的表達均顯著低于YK組，但CY-PLZF組未分化精原細胞的活性卻并沒有高于YK組，這表明除了以外，仍存在其他因素影響犏牛未分化精原細胞的增殖，例如外源性細胞因子FGFs家族蛋白[27]、GDNF蛋白[28]及其他的細胞轉錄因子FOXO1[29]、TAF4b[30]等，這仍需要在犏牛中更多的研究來進行驗證。

SNIPPERT等[31]的研究表明位于生態位中的干細胞優先進行自我更新，溢出生態位的干細胞才能進入分化。因此，犏牛未分化精原細胞中的異常表達導致其增殖活性降低會使其干細胞數量不足，進而影響干細胞數量，導致溢出生態位的干細胞減少，進而影響犏牛的精子發生。PLZF在犏牛未分化精原細胞中過表達后，增加了其增殖活性，但對犏牛精子發生的影響還需更多的試驗進行進一步的研究（圖9）。

圖9 PLZF對犏牛未分化精原細胞增殖的影響

4 結論

本試驗成功克隆得到了犏牛，并分析了PLZF蛋白在犏牛、牦牛和黃牛中三級結構的差異。在犏牛未分化精原細胞中表達下調會降低其增殖活性，導致犏牛未分化精原細胞數量稀少，進而影響犏牛的精子發生；而過表達能顯著上調增殖相關基因表達和抑制分化相關基因的表達，增加犏牛未分化精原細胞的增殖活性。這些結果為探究PLZF對犏牛未分化精原細胞的調控作用奠定細胞學基礎，并為進一步闡明犏牛生精停滯的作用機制提供理論基礎。

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Cloning of PLZF Gene and Its Effects on the Proliferation of Undifferentiated Spermatogonia in Cattleyak

ZHANG Peng, WANG MingXiu, JING KeMin, LI YuQian, TIAN Yuan, ZHONG JinCheng, CAI Xin

Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Ministry of Education / Sichuan Province, Southwest Minzu University, Chengdu 610041

【Objective】As the product of interspecific hybridization between yak and cattle, cattleyak has excellent production performance, but the further application of its heterosis is limited by the male sterility of cattleyak. The aim of the study was to clone theof cattleyak, and to identify its differential expression in the testicular tissue and undifferentiated spermatogonia of cattleyak and yak, and to further reveal the effect of expressing this gene on the activity of undifferentiated spermatogonia of cattleyak. This study could provide a theoretical basis for clarifying the mechanism of spermatogenesis stagnation in cattleyaks. 【Method】 In this study, 24-month-old male Maiwa yak and F1generation male cattleyak were used as experimental animals, and the CDS sequences ofin cattleyak were cloned by RT-PCR and analyzed by bioinformatics. The differential expression ofin the testis tissues of cattleyak and yak was analyzed by RT-qPCR. The expression vector ofwas constructed by homologous recombination, and the overexpression efficiency and the expression of downstream target genes were detected by RT-qPCR. The effect of overexpression ofon the undifferentiated spermatogonia of cattleyak was detected by PDT, CCK-8, EdU, and immunofluorescence. 【Result】The CDS region of thewas cloned, and it was found by bioinformatics analysis that the protein sequence encoded by the gene did not contain transmembrane domain and signal peptide sequence, and its tertiary structure was mainly α helix and random curl. Phylogenetic tree analysis showed that theof cattleyak was more closely related to theof cattle. The prediction of tertiary structure showed that although the tertiary structure of PLZF protein of cattleyak, yak and cattle was highly similar, the PLZF protein of yak was quite different from that of cattleyak and cattle at amino acids 531-540. RT-qPCR found that the expression levels ofgene in the testis tissue and undifferentiated spermatogonia of cattleyak were significantly lower than that in yak (＜0.05). After overexpression of, the expression ofin the undifferentiated spermatogonia of the cattleyak was up-regulated by 13.8 times (＜0.01), and the proliferation activity of the undifferentiated spermatogonia of the cattleyak was significantly increased (＜0.05), which showed that the down-regulation ofexpression affected the proliferation activity of undifferentiated spermatogonia of cattleyak. In addition, after overexpression of, the proliferation activity of undifferentiated spermatogonia was significantly increased All proliferation-related genes (,,and) were significantly up-regulated (＜0.05), and all differentiation-related genes (,,and) were significantly down-regulated (＜0.05), indicating thatcould promote the proliferation of undifferentiated spermatogonia by up-regulating the expression of proliferation-related genes and down-regulating the expression of differentiation-related genes.【Conclusion】The abnormal expression ofin cattleyak undifferentiated spermatogonia reduced the proliferative activity of cattleyak undifferentiated spermatogonia, resulting in its decrease in number and affecting the spermatogenesis of cattleyak. This study provided a theoretical basis for further elucidation of the mechanism of spermatogenesis and stagnation in cattleyak, and a new idea for solving the problem of male sterility in cattleyak.

cattleyak; PLZF; undifferentiated spermatogonia; proliferation

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.02.013

2023-05-11；

2023-10-07

西南民族大學“雙一流”項目（XM2023019）、四川省科學技術廳應用基礎科技項目（2021YJ0268）

張鵬，E-mail：zhangpeng0536@126.com。通信作者蔡欣，E-mail：caixin2323@126.com。通信作者鐘金城，E-mail：zhongjincheng518@126.com

（責任編輯 林鑒非）