腺病毒介導的肝細胞生長因子/血管內皮生長因子165對大鼠超比例隨意皮瓣成活的影響及機制研究

趙毅 閆洪偉 王玉琦 陳麗娟 洪城 田詩政

[摘要]目的：觀察術前注射腺病毒介導的肝細胞生長因子/血管內皮生長因子165（Ad-HGF/VEGF165）對大鼠超比例隨意皮瓣成活的影響和其機制的初步研究。方法：大鼠背部設計超比例隨意皮瓣模型，將其隨機分為Ad-HGF/VEGF165組、Ad-VEGF165組和對照組。術前7 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組分別于大鼠皮瓣及創(chuàng)緣內多點注射Ad-HGF/VEGF165及Ad-VEGF165，對照組注射等容量0.9%氯化鈉注射液。分別于術后7 d、14 d觀測皮瓣成活面積，切取皮瓣組織標本HE染色、免疫組化觀察微血管密度及組織間VEGF陽性率等指標，Western Blot檢測目的蛋白表達情況。結果：術后7 d、14 d，Ad-HGF/VEGF165組、Ad-VEGF165組皮瓣存活面積、組織間微血管數(shù)目、VEGF及細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）蛋白表達情況均高于對照組（P＜0.001），且Ad-HGF/VEGF165組明顯高于Ad-VEGF165組（P＜0.05）。結論：Ad-HGF/VEGF165具有協(xié)同作用，能顯著促進VEGF和ERK1/2信號因子表達，短期內促進血管網(wǎng)重建，改善皮瓣血液灌注，提高大鼠超比例隨意皮瓣成活面積。

[關鍵詞]超比例隨意皮瓣；基因治療；腺病毒；血管新生；肝細胞生長因子；血管內皮生長因子

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）02-0060-05

Experimental Study on the Influence of Adenovirus-mediated Hepatocyte Growth Factor/vascular Endothelial Growth Factor 165 on the Survival and Mechanism of Hyper-proportion Random Flap in Rats

ZHAO Yi1，2，YAN Hongwei2，WANG Yuqi1，CHEN Lijuan2，HONG Cheng2，TIAN Shizheng2

（1.Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，Liaoning，China; 2.Department of Burn Plastic Surgery，Shiyan People's Hospital/ Affiliated People's Hospital of Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China）

Abstract： Objective? To observe the effect of adenovirus-mediated hepatocyte growth factor / vascular endothelial growth factor 165 （Ad-HGF/VEGF165） injection before flap operation on the survival and Mechanism of Hyper-proportion random flap in rats. Methods? The model of Hyper-proportion random flap was designed on the back of rats and randomly divided into Ad-HGF/VEGF165 group， Ad-HGF/VEGF165 group and control group. Seven days before operation， Ad-HGF/VEGF165 group and Ad-HGF/VEGF165 group were separate multipoint injection Ad-HGF/VEGF165 and Ad-VEGF165 into the rat skin flap at multiple points in the experimental group， while 0.9% sodium chloride injection was injected in the control group. The survival area of the flap was observed on the 7 day and 14 day after operation， and the tissue samples of the flap were obtained for HE staining， the microvessel density and VEGF expression were observed by immunohistochemistry， and Western blot for detection of protein of target protein. Results? On the 7 day and 14 day after operation， skin flap survival area，the number of microvessels， VEGF and the expression of extracellular regulated protein kinase （ERK1/2） protein in the Ad-HGF/VEGF165 group and Ad-HGF/VEGF165 group were higher than those in the control group（P＜0.001）， and all indexes were significantly higher in the Ad-HGF/VEGF165 group than in the Ad-VEGF165 group （P＜0.05）. Conclusion? Ad-HGF/VEGF165 has a synergistic effect， which can significantly promote the expression of VEGF and ERK1/2 signal factors， increase the survival area of Hyper-proportion random flap， promote angiogenesis and improve the blood circulation of the flap.

Key words： hyper-proportion random flap; gene-therapy; adenovirus; revascularization; hepatocyte growth factor; vascular endothelial growth factor

頭頸部腫瘤、急性外傷、重度燒傷及糖尿病等基礎疾病導致的皮膚創(chuàng)面缺損是臨床皮瓣修復手術中常見的疾病。隨意皮瓣移植因不受蒂部限制，設計和操作簡便、可重復性好，在臨床上得到了廣泛的應用[1]，但是，由于皮瓣遠端延遲或不完全的血管網(wǎng)重建，限制了隨意皮瓣術后的存活率。為了拓寬皮瓣的應用范圍，提高隨意皮瓣的存活面積，研究者通過不同的載體系統(tǒng)將多種類的外源性基因注射至受區(qū)，通過直接或旁分泌途徑提高生長因子濃度，從而誘導微血管形成[2-4]。但已有數(shù)據(jù)表明，僅靠一種生長因子并不能在皮瓣移植術后早期提供足夠的血運灌注和穩(wěn)定的血管網(wǎng)絡。將多種基因聯(lián)合應用后，發(fā)現(xiàn)可在同時期內建立更密集的小動脈分支[5-7]。此外，還應選擇適當?shù)淖⑸鋾r機，否則在外源性基因高表達前，皮瓣可能因血液供應不足而出現(xiàn)缺血性壞死。相關文獻顯示，與術后即刻注射相比，術前注射腺病毒介導的外源性基因在改善皮瓣存活率和血液循環(huán)方面效果顯著[8-9]。為了優(yōu)化生長因子潛在的療效，并確保在有限的時間內發(fā)揮其生物活性，本研究結合以往理論基礎，采用大鼠背部超比例隨意皮瓣模型，以腺病毒為載體，術前7 d于皮瓣遠端及創(chuàng)緣處局部注射Ad-HGF/VEGF165，觀察其對皮瓣成活的影響，同時測定與分析組織內微血管數(shù)目、生長因子的變化情況，現(xiàn)報道如下。

1? 材料和方法

1.1 實驗主要儀器與試劑：Ad-HGF/VEGF165、Ad-VEGF165為湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院臨床研究所王家寧博士惠贈，VEGF兔多克隆抗體（Immunoway）、CD31羊多克隆抗體（R&D）、ERK1/2兔單克隆抗體（Cell signaling Technology）。普通/熒光顯微鏡（Nikon公司）、凝膠成像儀（BIO-RAD）、電泳儀及轉膜儀（BIO-RAD）、石蠟切片機（Lecia德國）。

1.2 實驗動物和分組：選用12周齡SD雄性大鼠30只（湖南斯萊克景達公司），體重250～320 g，適應性飼養(yǎng)1周。按照隨機數(shù)字表法分為Ad-HGF/VEGF165組、Ad-VEGF165組和對照組，每組10只。動物實驗經(jīng)倫理委員會審批通過。

1.3 皮瓣模型制備及Ad-HGF/VEGF165運用：以大鼠背部中線為皮瓣縱軸，肩胛下緣為皮瓣蒂部，設計8 cm×2 cm超比例隨意皮瓣。術前7 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組分別在皮瓣的中遠端和邊緣處注射共計1 ml含有2×108滴度單位的Ad-HGF/VEGF165和Ad-VEGF165，每點注入0.05 ml，等距注射至深筋膜層，共20個點。對照組注入等容量的0.9%氯化鈉注射液。異氟烷氣體麻醉大鼠，俯臥位固定于操作臺，切開皮瓣皮膚，于深筋膜淺層將皮瓣自遠端向蒂部掀起，皮瓣掀起后，確保破壞創(chuàng)面床與創(chuàng)緣吻合的血管網(wǎng)，將皮瓣原位縫合。

1.4 觀察指標

1.4.1 皮瓣大體觀察及存活率：術后定期監(jiān)測大鼠皮瓣血運情況，測量皮瓣存活區(qū)域面積，計算各組皮瓣的成活面積，并求取其皮瓣平均存活率。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?。

1.4.2 病理學觀察：三組大鼠分別于術后7 d切取距存活與壞死組織交界處0.5 cm的近端皮瓣組織標本，10%多聚甲醛固定后包埋切片，二甲苯脫蠟處理，光鏡下進行病理學觀察。

1.4.3 免疫組化：采用SABC法，抗原修復后滴加山羊血清封閉50 min，滴加一抗，VEGF、CD31抗體濃度比分別為1∶200與1∶100。放于4℃冰箱孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）充分沖洗；二抗孵育1 h，蘇木素染色。檢測不同時期CD31標記皮瓣遠端存活區(qū)的微血管生成數(shù)目，400倍光學顯微鏡下，隨機求取5個不同視場的血管橫截面數(shù)目，求得各組皮瓣的新生血管數(shù)目，觀測VEGF在組織中陽性表達。

1.4.4 Western Blot：將皮瓣組織放入液氮進行研磨，勻漿放入EP管，離心后取上清液計算蛋白濃度。根據(jù)標準程序，進行SDS電泳，將制備膠轉移至PVDF膜上，放入5%脫脂牛奶置于搖床封閉30 min，隨后將一抗VEGF165、ERK1/2和P-ERK1/2放于4℃冰箱孵育過夜，濃度比1∶1 000。TBS-T中沖洗3遍，室溫下二抗孵育2 h。TBS-T中沖洗3遍，每遍15 min。最后在凝膠成像儀上對蛋白表達量進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 26.00軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均采用（xˉ±s）表示，三組間比較行單因素方差分析，通過t檢驗確定兩組間差異，采用Image-Pro-Plus6.0檢測VEGF的IOD值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 皮瓣大體觀察：術后12 h，皮瓣遠端區(qū)域皮溫稍涼，呈淡紫色。術后7 d，飲食及二便正常，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組皮瓣遠端缺血區(qū)域皮膚皺縮，繼而發(fā)黑干性壞死，部分創(chuàng)面破潰。對照組皮瓣壞死區(qū)域有少量膿性分泌物，與Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組相比壞死面積增大，存活與壞死區(qū)域界限清楚。術后14 d，對照組清除硬痂及壞死組織后基底欠新鮮，Ad-HGF/VEGF165組皮瓣末端發(fā)生血運障礙區(qū)域較另兩組明顯減少，壞死區(qū)痂皮溶脫，顯露基底新鮮肉芽組織。見圖1。

2.2 三組大鼠皮瓣成活率比較：術后7、14 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組大鼠背部皮瓣存活面積均高于對照組，且Ad-HGF/VEGF165組高于Ad-VEGF165組（P＜0.05）。采用LSD法兩兩比較，組間差異有統(tǒng)計學意義，且三組數(shù)據(jù)行單因素方差分析得出P＜0.001。見表1。

2.3 組織學檢測：光鏡下觀察，術后7 d對照組皮瓣壞死區(qū)域急性炎癥反應加重，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組皮瓣成活區(qū)表現(xiàn)出較厚的真皮層，可見大量成纖維細胞增生，周圍新生血管豐富，血管壁薄。對照組表皮層較薄，血管生成少見。見圖2。

2.4 三組VEGF陽性表達情況及微血管密度比較：術后7 d，Ad-HGF/VEGF165組血管周圍呈棕黃色染色呈團簇分布，表明有大量VEGF的表達，Ad-VEGF165組中陽性表達有所欠缺，對照組皮瓣成活區(qū)周圍組織少見。術后7 d、術后14 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組皮瓣微血管密度均高于對照組，Ad-HGF/VEGF165組新生微血管管腔結構良好，管壁薄。與Ad-VEGF165組相比，同時期內建立的小血管分支更密集（P＜0.01）。見圖3～4。

2.5 Western Blot：Western Blot檢測三組各時期VEGF蛋白電泳測定結果，術后7 d達到峰值，Ad-HGF/VEGF165組的VEGF表達明顯高于另兩組，術后14 d蛋白表達有所回落。術后7 d時，Ad-HGF/VEGF165組顯現(xiàn)出對VEGF和P-ERK1/2蛋白更高的活化潛能。見圖5～6。

3? 討論

在整形與重建外科手術中，皮瓣移植術后早期促進新生血管網(wǎng)的形成與穩(wěn)定性是提高皮瓣存活的重要因素[10-11]。經(jīng)實驗觀察，高壓氧治療、血管擴張劑、磷酸二酯酶抑制劑等均可提高皮瓣移植后組織的氧含量并減輕炎癥反應，使皮瓣的存活率一定程度上得到改善[12-14]，但在擴大皮瓣運用面積效果方面并不理想。近年來，研究者們利用合適的載體，將外源性生長因子直接注射入皮瓣中遠端，可有效提高小動脈供血及毛細血管網(wǎng)的形成，降低了皮瓣的壞死率[15-16]。其中，腺病毒作為常見的載體。在轉染后的5～7 d，外源性基因蛋白的表達達到高峰，有效表達數(shù)周后消失。這種自限性能確保發(fā)揮細胞的生物學活性，并避免由于長期的基因表達而導致的病理性腫瘤[9，17-18]。在此基礎上，本研究設想在術前7 d進行術區(qū)注射，避免外源性基因高表達前，皮瓣末端已發(fā)生缺血性壞死。通過免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)，術后初期，基因治療組皮瓣遠端成活面積和再血管化均有明顯的改善。HE染色顯可見大量的新生微血管及成纖維細胞，同時VEGF在內皮細胞胞質間的陽性表達及Western Blot的檢測結果表明皮瓣組織間生長因子濃度明顯增高，也證實了上述猜測。相關研究亦發(fā)現(xiàn)，于皮瓣缺血損傷前1周注射，使皮瓣遠端有充足的時間構建支持性血管[8]。本研究結合現(xiàn)有理論基礎，建立大鼠超比例隨意皮瓣動物模型，術前7 d局部皮下注射Ad-HGF/VEGF165，論證基因聯(lián)合治療能有效提高并延長皮瓣移植術后局部生長因子生物學濃度，增強皮瓣遠端血管新生和側支循環(huán)的形成，為突破隨意皮瓣長寬比例限制提供參考。

術后7 d觀測皮瓣存活面積，發(fā)現(xiàn)Ad-HGF/VEGF165組可顯著改善皮瓣遠端的血運，僅有少數(shù)邊緣區(qū)域組織缺血壞死。而Ad-VEGF165組皮瓣遠端壞死相對嚴重。以往的研究中，Slobodkina E等[19]也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用后可明顯提高毛細血管生成數(shù)目及側支循環(huán)形成，微血管管腔長度增大，同時HGF與VEGF聯(lián)合應用能更好的促進ERK1/2蛋白的磷酸化。這與本研究結果一致。其機制可能是：①除HGF和VEGF通過各自途徑促進血管內皮細胞增殖，HGF還可通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）誘導VEGF的分泌和表達，并在細胞外基質促進VEGF的活性成倍增加[20-23]。②VEGF與HGF聯(lián)合應用后，ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯高于單獨應用一種因子時[19]。ERK1/2通過誘導特定蛋白的表達或活化，進而調控細胞的增殖和代謝[24-25]。在促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的實驗中抑制ERK1/2通路，發(fā)現(xiàn)血管生成數(shù)目、創(chuàng)面愈合速率明顯降低[26]。③基因聯(lián)合應用能增強Rho的活性及Rac的調控，使皮瓣遠端的新生血管與和創(chuàng)緣預先存在的血管網(wǎng)進行功能性重塑，形成了新的小動脈分支。同時HGF與VEGF聯(lián)合應用可提高抗凋亡基因Bcl2和A1的mRNA水平，增強血管內皮細胞在組織嚴重缺血和炎性反應環(huán)境中的存活能力[27-29]。

綜上所述，本實驗證實了HGF和VEGF165聯(lián)合應用能顯著增強ERK1/2蛋白的磷酸化和VEGF-A的分泌與表達，并且術前7 d注射使受損組織有充足的時間構建支持性血管，從而有效改善術后早期皮瓣中遠端成活能力。但是，其協(xié)同效應的機制仍需更深入研究。雖然目前尚無關于兩種基因聯(lián)合應用在體內的適當藥物劑量和注射時間的可復制性數(shù)據(jù)，以確保患者治療后的長期安全性，但在促進血管新生和改善皮瓣存活方面，基因治療仍是值得期待的研究方向。

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[收稿日期]2022-10-28

本文引用格式：趙毅，閆洪偉，王玉琦，等.腺病毒介導的肝細胞生長因子/血管內皮生長因子165對大鼠超比例隨意皮瓣成活影響及機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2024，33（2）：60-63，97.