急性髓系白血病多次輸血患者血清存在抗-M、抗-Jka和抗-Wra抗體的鑒定、基因分析及配血策略

馬思飛,張建偉,楊紅梅

常州市中心血站,江蘇常州 213000

急性髓系白血病 (AML) 是一類來源于造血干細胞來源的克隆性血液系統(tǒng)疾病,患者骨髓、外周血和組織中往往存在大量異常白血病細胞,臨床上以感染、出血、貧血和髓外組織器官浸潤為主要表現(xiàn)。隨著紅細胞降低、血紅蛋白水平降至60 g/L以下且機體出現(xiàn)乏力、心慌氣促等貧血癥狀時,則需要輸注血液制品[1]。因多次輸血產(chǎn)生復雜意外抗體的患者數(shù)量呈現(xiàn)逐年增長趨勢,成為臨床輸血部門面臨的新挑戰(zhàn)。血液輸注是臨床救治患者的常規(guī)手段,不同血型紅細胞具有不同血型抗原,當患者與供血者的血型不合,則同種異體紅細胞進入患者體內,會刺激機體產(chǎn)生免疫性抗體,并引起同種免疫排斥,導致輸血反應發(fā)生。意外抗體是指不符合ABO系統(tǒng)Landsteiner法則的抗體,包括非ABO血型系統(tǒng)抗體和ABO亞型抗體[2]。多次輸血的患者可能會產(chǎn)生復雜的意外抗體,特異性抗體確定困難,且患者外周血中出現(xiàn)不同供血者的紅細胞而導致抗原分型困難。筆者發(fā)現(xiàn)1例因多次輸血導致配血不合的AML患者,經(jīng)鑒定,該患者血清中存在抗-M、抗-Jka和抗-Wra抗體,本研究就復雜意外抗體的鑒定、基因分析及配血策略進行分析,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1病例簡介 患者,女,46歲,因AML急性變而進入某三甲醫(yī)院治療,既往有妊娠史和多次輸血史,最近一次輸血日期為2023年2月28日。此患者因乏力、心慌加劇就診于江蘇省某三甲醫(yī)院,血紅蛋白35 g/L,就診醫(yī)院抗體篩查陽性,交叉配血不合,故于2023年3月20日送至本站做抗體鑒定及交叉配血,申請洗滌紅細胞6 U。

1.2標本采集 采集患者血液標本并分離血清。將患者紅細胞洗滌3次制備2%～5%的紅細胞懸液。

1.3儀器與試劑 使用主要儀器包括久保田KA-2200血清學專用離心機、貝索2020-2低速離心機、長春博研FYQ型試劑卡孵育器、貝索毛細管離心機2403及ORTHO工作站。使用主要試劑包括抗-A、抗-B單克隆抗體,抗-C、抗-c、抗-E、抗-e抗體,ABO血型反定型紅細胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司,批號:20220101、20220101、20223001、20223101、20223203、20223301、20235307),抗-D(IgM)單克隆抗體(北京金豪制藥股份有限公司,批號:20220601102),抗Jka、抗Jkb抗體(德國CE免疫診斷公司,批號:220-1、136-1),抗-M、抗-N抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司,批號:20220725、20200709);IgG型抗-Wra抗體(德國CE免疫診斷公司,MWraM033),進口抗體篩選細胞、譜細胞1(REAGENS公司,批號:702303、732303);譜細胞2(Sanquin公司,批號:8000458616);抗IgG+C3d、抗IgG和抗C3d試劑(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司,批號:20215001、20215103、20225201),凝聚胺試劑(珠海貝索生物技術有限公司,批號:A211203),2-巰基乙醇(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司),ORTHO抗球蛋白試劑卡(批號:AHC284H)。

1.4方法 直接抗球蛋白試驗、抗體篩選試驗、2種譜細胞抗體鑒定、酸放散試驗、抗體效價測定、吸收放散試驗、毛細管離心法及交叉配血試驗等步驟嚴格按照《全國臨床檢測操作規(guī)程》及試劑說明書進行。2-巰基乙醇滅活血清試驗步驟參照試劑說明書及文獻[3]。設計特異性引物擴增RHCE基因和MN基因。RHCE和MN等位基因命名方法參照ISBT血型抗原等位基因數(shù)據(jù)庫,該試驗由天津秀鵬生物技術開發(fā)有限公司完成。本研究經(jīng)過本站醫(yī)學倫理委員會審批通過(倫理審批號:xz202204)。

1.5統(tǒng)計學處理 采用Excel2007軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析。

2 結 果

2.1血清學試驗結果 患者血型為B(凝集強度4+)、CcDEe(C凝集強度4+;c凝集強度3+,紅細胞呈現(xiàn)混合外觀;D凝集強度3+;E凝集強度3+,紅細胞呈現(xiàn)混合外觀;e凝集強度3+)、Jka-b+、MN(M凝集強度3+,紅細胞呈混合外觀;N凝集強度3+,紅細胞呈混合外觀)、Wra-(陰性);E、c、M、N表型呈混合外觀,考慮患者近期有輸血史,故采用毛細管離心法分離近心端(新生細胞)和遠心端(陳舊細胞)細胞,再次進行分型。患者Rh系統(tǒng)分型為CcEe,MN系統(tǒng)分型為MN(M凝集強度變弱,仍呈混合外觀),見表1。

2.2RhCE基因序列分析 根據(jù) ISBT 網(wǎng)站提供的(ISBT 004) RHCE blood group alleles v6.2-31-MAR-2022,以 RHCE*01(RHCE*ce,NG_009208.3)為參考序列,測序結果顯示該標本RHCE基因在外顯子1～10的情況,其中在外顯子2和外顯子5位上存在堿基突變,見圖1。

注:箭頭所指表示此處波峰異常,堿基突變。測序結果提示該標本為RHCE*CcEe,但值得注意的是缺少c.48G>C的突變,該突變并未被 ISBT 數(shù)據(jù)庫收錄,其血清學意義值得進一步探索。

2.3MN血型基因測序結果 參照ISBT發(fā)布的 Names for MNS (ISBT 002)blood group alleles v4.1 170119,以GYPA*01基因(NG_007470.3)為參考序列,發(fā)現(xiàn)MN血型基因特異性關鍵位點在GYPA基因的第2外顯子的第59號位、第71號位和第72號位。證實該患者血液標本屬于GYPA*N型純合標本,其MN血型的表型為NN,見圖2。

注:箭頭所指表示此處波峰異常,堿基突變。

2.4直接抗球蛋白試驗 患者多抗(IgG+C3d)弱陽性,抗-IgG陰性,抗-C3d弱陽性。對患者紅細胞酸放散液與抗體篩查細胞進行檢測,酸放散試驗未檢出意外抗體。

2.5抗體篩選試驗 鹽水介質中,患者血清與含M抗原的細胞凝集,考慮存在IgM型抗-M抗體。根據(jù)劑量效應(即純合子基因編碼的抗原量多于雜合子的抗原量),在抗球蛋白、凝聚胺介質中患者血清與M雜合子細胞凝集,而M純合子未出現(xiàn)凝集,與鹽水介質下格局不符,考慮患者血清中存在其他系統(tǒng)IgG型抗體。

2.6抗體特異性鑒定試驗 將患者血清與譜細胞1中細胞反應,結果見表2。在鹽水介質下,經(jīng)離心出現(xiàn)2、6、8號(M純合子)弱凝集,由于抗-M 抗體存在劑量效應,與純合子細胞反應明顯強于雜合子細胞,且血清中抗-M抗體與紅細胞反應較血漿中弱,出現(xiàn)假陰性的結果或不反應,易漏檢,故再次用血漿與譜細胞1反應,格局符合抗-M抗體,借助譜細胞1可確認患者存在抗-M抗體。患者血清經(jīng)2-巰基乙醇滅活后與譜細胞1細胞加入抗球蛋白試劑卡結果顯示3、9和11號出現(xiàn)弱凝集,提示存在其他系統(tǒng)抗體。劑量效應發(fā)現(xiàn)3、9和11號為Jka純合子,考慮可能存在抗-Jka,但譜細胞1中凝集強度較弱不能確定,此時患者血清較足量且抗體復雜,需借助譜細胞2完成抗體鑒定。譜細胞2顯示抗-Jka抗體存在,但值得注意的是患者血清中還存在抗-Wra抗體。患者紅細胞MN、Kidd系統(tǒng)分型及Wra抗原見圖1,與血清中檢出結果吻合。結合以上結果,判斷患者血清中存在抗-M、抗-Jka和抗-Wra,共3種意外抗體。

表2 患者血清與譜細胞1反應格局及結果

2.7吸收放散試驗 血型系統(tǒng)抗體可能會干擾譜細胞試驗而影響反應格局,為確定患者血清中抗體特異性,筆者繼續(xù)進行吸收放散試驗,挑選M抗原陰性、Jka抗原陽性的細胞與患者血清結合,采用熱吸收酸放散(37 ℃,30 min吸收),將放散液與吸收后的血清再次進行譜細胞試驗,試驗表明患者血清中存在抗-M和抗-Jka抗體。遺憾的是該試驗無法篩選到M-/Jka-/Wra+的獻血者,無法對抗-Wra進行吸收放散試驗。

2.8效價測定 采用試管法對血漿/血清進行倍比稀釋,總體系為100 μL,抗-M效價室溫(IS)為4,4 ℃為8,抗球蛋白介質<1。抗球蛋白介質中抗-Jka效價為2。抗-Wra抗體未進行效價測定。本站以出現(xiàn)±的最低稀釋倍數(shù)為最終效價。

2.9交叉配血試驗 患者就診醫(yī)院先后3次送檢患者標本至本站,共篩選6袋B型洗滌紅細胞(分型為NN、Jka-、Wra-)與該患者進行交叉配血,主側在鹽水、抗球蛋白及凝聚胺介質中均無凝集、無溶血。回訪醫(yī)院,得知患者發(fā)生輸血無不良反應。

3 討 論

AML是較慢性淋巴細胞白血病異質性更強的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,是成人中最常見的急性白血病,具有惡性程度高、易復發(fā)、并發(fā)癥多和預后差的臨床特點。輸血是臨床支持治療的重要手段。目前,紅細胞血型已命名了 45個血型系統(tǒng),共有360種紅細胞血型抗原。多次輸血可產(chǎn)生多種意外抗體,導致抗體鑒定的難度增加,為避免輸血不良事件發(fā)生,需要能夠準確鑒定抗體以確定患者紅細胞各系統(tǒng)表型分型的技術手段。當單一譜細胞難以鑒定出全部意外抗體的特異性時,需要采取抗體篩查細胞結合多種譜細胞的方案。在中國合格評定國家認可委員會制定的《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在輸血醫(yī)學領域的應用說明》中也提到抗體篩查必須至少使用2種以上的譜細胞。當患者體內檢出的意外抗體與患者紅細胞抗原表型不吻合,這時需借助毛細管離心法分離新生細胞和陳舊細胞,進一步鑒定其表型,但該類患者可能因近期多次輸血導致外周血循環(huán)中出現(xiàn)不同供血者的紅細胞,毛細管離心法也不能準確分型時,需進行基因測序。但有研究報道,堿基測序技術進行基因分型易產(chǎn)生假陰性或假陽性[4],雖然筆者并未觀察到該現(xiàn)象,但從輸血安全考慮假陰性可接受,還需進一步研究。

MNSs血型系統(tǒng)在臨床上的重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)和Rh血型系統(tǒng)[5]。抗-M抗體多為天然產(chǎn)生,大多數(shù)為IgM型,少數(shù)為IgG型,4 ℃活性最強。紅細胞保存溫度為2～6 ℃,輸入M抗原陽性的供血者紅細胞極易與高效價的抗-M抗體結合,從而引起溶血,若此時補體參與,則可加劇紅細胞的溶解破壞,嚴重時可危及患者生命[6]。近年來,關于Kidd和Diego血型系統(tǒng)抗體的研究越來越多。抗-Jka抗體屬于Kidd系統(tǒng),常為IgG型,少見IgG和IgM混合物,該抗體的產(chǎn)生多由輸血引起[7]。長期不受抗原刺激的Kidd系統(tǒng)抗體效價會很快降低,臨床極易因其效價低而漏檢,且隨著抗體的消逝,輸血風險隨之增加,此時輸注抗原陽性血液會很快引起記憶反應,抗體效價激增,結合補體則可引起嚴重的溶血反應[8]。因此,當抗體篩查細胞或1種譜細胞不能排除抗-Jka抗體的存在時,需結合另1種譜細胞,保證該類患者再次輸血時選取的是抗原陰性的血液。值得注意的是,血漿中由于含有去鈣抗凝劑,可能會掩蓋該抗體的檢出,故本站在抗體鑒定時應用的是患者血清。Wra(DI3)是Diego血型系統(tǒng)中的低頻抗原,抗原頻率<0.01%,抗-Wra是一種相對常見的抗體,可以是37 ℃以下,由IgM類抗體導致的凝集,也可以只是抗球蛋白介質中IgG類抗體導致的凝集,常合并其他抗體出現(xiàn),但也有抗-Wra單獨引起輸血性溶血和新生兒溶血反應的報道[9],這提示即使誘導的是非免疫性抗體的低頻抗原,在臨床血液輸注及鑒定中也應提高警惕。筆者發(fā)現(xiàn)REAGENS抗體篩查細胞和譜細胞中沒有該抗原,極易漏檢,所以,輸血實驗室有必要配備至少2種譜細胞,才能提高抗體特異性鑒定的精準性,保障輸血安全。

本例患者患病3個月,既往抗體篩查試驗陰性,交叉配血相合,因多次輸血產(chǎn)生抗-M、抗-Jka和抗-Wra3種意外抗體。遺憾的是醫(yī)院在此期間并未送檢該患者標本,所以本站無法知曉3種抗體是否同時產(chǎn)生。且筆者推測在抗-M抗體和抗-Jka抗體產(chǎn)生初期,效價低,抗體篩查極易漏檢,配血結果也相合,此時臨床很可能輸注M抗原和Jka抗原陽性血液而使抗體效價升高,加重溶血。因患者血紅蛋白下降至35 g/L,乏力、心慌加劇,急需輸血,故送標本至本站檢測,本站先進行交叉配血試驗。由于該患者RH系統(tǒng)C、c、E、e 4種分型皆有,故選取的獻血者暫不考慮RH分型,篩選NN、Jka-和Wra-陰性紅細胞與患者血液標本進行配血。M抗原的抗原頻率與Jka抗原頻率相似。本站配血方案先篩選M陰性紅細胞,再篩選Jka陰性紅細胞,后進行交叉配血,相合的血液再鑒定低頻抗原Wra。將相合血液且Wra陰性血液緊急發(fā)往醫(yī)院救治患者,追蹤臨床得知患者輸血效果良好。針對該患者后續(xù)配血試驗,本站會關注其抗體篩查情況、監(jiān)測抗體效價,做到持續(xù)追蹤記錄。針對患者E、c、M、N分型呈現(xiàn)混合外觀繼續(xù)進行基因測序分析,確定患者自身紅細胞抗原分型,保證試驗的完整性、可靠性。缺乏c.48G>C突變是否影響RhCE血清學試驗分型結果尚未可知,筆者將在后續(xù)的研究中進一步探索其意義。

意外抗體的產(chǎn)生原因中,輸血因素往往大于妊娠因素,對于臨床上多次輸血的患者需要額外注意,鑒定其意外抗體時應多種試驗聯(lián)合進行,將基因測序與血型血清學試驗相結合,以便更加準確鑒定抗體并做到同型輸注,避免或延緩意外抗體的產(chǎn)生,一旦病情惡化急需輸血時,無或者較少的意外抗體患者較容易找到相合血液,可爭取最佳搶救時間。