基于非靶向代謝組學的老年胃癌患者術前衰弱與代謝綜合征代謝特征研究

蔣小曼,郭銀寧,繆雪怡,徐 婷,徐欣怡,3,陳 麗,季明輝,許 勤△

1.南京醫(yī)科大學護理學院,江蘇南京 211166;2.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院胃腸外科,浙江杭州 310003;3.昆士蘭科技大學健康學院,澳大利亞昆士蘭 4702;4.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院/江蘇省人民醫(yī)院普外科,江蘇南京 211166

衰弱與代謝綜合征(MetS)均是常見的老年人健康問題,可作為疾病負擔加劇癌癥患者不良預后的發(fā)生。既往研究顯示,二者在發(fā)病機制層面可能存在密切聯(lián)系[1],然而現(xiàn)階段衰弱機制尚不明確,研究顯示衰弱的發(fā)生機制可能涉及內分泌失調、炎癥反應增強、免疫功能障礙、代謝失衡、氧化應激損傷等多個系統(tǒng)的病理生理過程,并且各系統(tǒng)間相互關聯(lián)[2]。另外,癌癥本身就是一種代謝性疾病,腫瘤細胞可改變代謝途徑,造成代謝重編程,使機體處于特異性的代謝狀態(tài),并形成有別于正常細胞與其周圍組織的微環(huán)境[3-4]。在此狀態(tài)下,衰弱所形成的代謝特征及與MetS老年胃癌患者的間的聯(lián)系尚不明確。代謝組學可以對機體小分子代謝物進行全面分析,從而反映基因組和環(huán)境在個體水平上相互作用的最終結果,在癌癥患者的健康管理中具有重要價值[5]。因此,本研究基于非靶向代謝組學檢測技術分析衰弱及MetS代謝特征,以及潛在作用途徑,闡明其對監(jiān)測術前營養(yǎng)代謝水平、確定干預靶點及制訂精準衰弱管理方案的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年8月至2022年8月南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院/江蘇省人民醫(yī)院普外科胃外病區(qū)收治的58例胃癌老年患者為研究對象。(1)納入標準:①年齡為65～80歲的老年人[6];②經胃鏡與CT檢查確診為胃癌,初次接受胃癌根治術;③神志清楚,能進行簡單書面及語言交流。(2)排除標準:①因嚴重軀體疾病、認知障礙或精神疾病無法配合完成研究;②患嚴重傳染性疾病;③合并其他部位腫瘤;④存在嚴重心腦血管疾病,肝、腎及肺功能不全;⑤體內安裝有金屬醫(yī)療器械;⑥服用影響身體成分測量的藥物;⑦術前接受過新輔助治療[7]。根據診斷,以非衰弱非MetS的胃癌患者25例作為對照組,單純衰弱胃癌患者10例作為衰弱組;單純合并MetS的胃癌患者13例作為MetS組,衰弱合并MetS的胃癌患者10例作為合并組。采用Fried衰弱表型量表進行衰弱測量[8],采用《中國2型糖尿病防治指南(2020年版)》[9]作為MetS診斷標準。所有研究對象自愿配合參加本研究,并簽訂知情同意書,本研究經南京醫(yī)科大學倫理審查委員會審查批準[批件號:南醫(yī)大倫審(2022)746號],且在中國臨床試驗注冊中心進行注冊(注冊號:ChiCTR2200060615)。

1.2儀器與試劑 主要儀器包括高分辨質譜儀(Q Exactive HFX,Thermo Fisher Scientific)、超高壓液相色譜儀(Vanquish,Thermo Fisher Scientific)、離心機 (Heraeus Fresco17,Thermo Fisher Scientific)、天平(BSA124S-CW,Sartorius)、超聲儀(PS-60AL,深圳雷德邦)。主要試劑包括甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水、超純水等。

1.3方法

1.3.1資料收集 采集患者年齡、性別、體質量指數(BMI)、合并癥情況、服用藥物數量(多重用藥定義為同時服用≥4種藥物)[10]、營養(yǎng)風險篩查量表2002(NRS2002)[11]、吸煙史、飲酒史、TNM腫瘤分期、腰圍等臨床資料。

1.3.2標本采集及預處理 囑患者禁食12 h后于清晨空腹狀態(tài)下采集肘正中靜脈外周血5 mL,置于含抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管中,混勻血液和抗凝劑,然后以4 ℃,1 300×g離心力離心10 min分離血清,—80 ℃冷凍保存標本。檢測時室溫解凍,移取100 μL標本至EP管中,加入400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V),含同位素標記內標混合物],振蕩混勻后離心(4 ℃,12 000 r/min,15 min),取上清液于進樣瓶中上機檢測。所有標本另取等量上清液混合成QC樣品上機檢測。

1.3.3血漿樣品分析條件 使用超高效液相色譜儀,通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm × 100 mm,1.7 μm)液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜A相為水相,含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水,B相為乙腈。樣品盤溫度:4 ℃;進樣體積:2 μL。高分辨質譜儀能夠在控制軟件(Xcalibur,Thermo)控制下進行一級、二級質譜數據采集。詳細參數如下:護套氣流量30 Arb,輔助氣流量25 Arb,毛細管溫度350 ℃,全ms分辨率120 000,ms/ms分辨率7 500,碰撞能量NCE模式10/30/60,噴霧電壓3.6 kV(+)或—3.2 kV(—)。

2 結 果

2.1各組基線資料比較 衰弱組年齡明顯大于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);MetS組與合并組的BMI及合并癥發(fā)生率明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組其他基線資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組基線資料比較或n(%)]

2.2多元統(tǒng)計分析結果 PCA結果顯示,MetS組與對照組、衰弱組與對照組、合并組與對照組的x變量的解釋性(R2X)分別為0.501、0.526、0.520,表明各組的預測率可達50.1%、52.6%、52.0%,并且3組模型的主成分個數均為6,各組間均存在明顯生物學代謝差異,見圖1 a、b、c。在此基礎上,進行OPLS-DA,結果顯示3組兩樣本間分離良好,代謝物輪廓存在明顯區(qū)別,見圖2a、b、c。MetS組與對照組、衰弱組與對照組、合并組與對照組的擬合度(R2Y)及預測度(Q2)分別為0.953與0.109、0.922與0.193、0.891與0.185。

注:a為MetS組與對照組;b為衰弱組與對照組;c為合并組與對照組;A為對照組;B為MetS組;C為衰弱組;D為合并組;PC1為主成分1;PC2為主成分2。

注:a為MetS組與對照組;b為衰弱組與對照組;c為合并組與對照組;A為對照組;B為MetS組;C為衰弱組;D為合并組;t[1]O為正交主成分得分;t[1]P為第一主成分的預測主成分得分。

2.3組間差異代謝物篩選 本研究使用的卡值標準為t檢驗的P<0.05且OPLS-DA模型第一主成分的VIP>1.0。根據代謝物的二級質譜碎片信息對化合物進行定性后篩選各組正負離子模式下全部差異代謝物。與對照組比較,MetS組共檢測出41種具有明顯差異的代謝產物,主要涉及氨基酸類(7個)、脂質類(甘油磷脂類9個、鞘脂類1個、脂肪酸類6個)及糖類(6個),除多數脂質代謝物明顯上調外,其他代謝物多數明顯下調。衰弱組患者共檢測出32種具有明顯差異的代謝產物,主要涉及氨基酸類(5個)與脂質類(甘油磷脂類10個、鞘脂類1個、脂肪酸類6個),其中植物鞘氨醇等鞘脂類代謝物及花生四烯酸、琥珀酸半醛、肉豆蔻酸、α-亞麻酸、10E,12Z-亞油酸5種脂肪酸類代謝物明顯上調,精氨酰丙氨酸、N-乙酰纈氨酸、D-瓜氨酸、L-纈氨酸、L-天冬酰胺等5種氨基酸及大多數甘油磷脂類代謝物整體明顯下調。合并組患者共檢測出52種具有明顯差異的代謝產物,涉及氨基酸類(9個)、脂質類(甘油磷脂類5個、鞘脂類3個、脂肪酸類5個)、核苷及核苷酸類(7個)、糖類(2個)及酸性化合物類(6個)等,其中假尿苷、N-乙酰胞嘧啶核苷、乳清酸核苷等5種核苷酸及多巴胺-3-O-硫酸鹽等4種酸性化合物明顯上調。植物鞘氨醇明顯升高是衰弱組與合并組的共同特征。根據VIP值排序,各組前10種代謝物見表2～4。

表2 MetS組與對照組的差異代謝物信息

表3 衰弱組與對照組的差異代謝物信息

表4 合并組與對照組的差異代謝物信息

2.4差異代謝物的代謝通路分析 將篩選出的差異代謝物導入KEGG代謝通路數據庫進行代謝通路富集分析,以Impact> 0.1且P<0.05為標準,篩選3組差異性代謝通路。與對照組比較,MetS組無明顯代謝途徑,衰弱組差異代謝物主要涉及丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑,合并組差異代謝物主要涉及甘油磷脂代謝途徑,見表5。

表5 各組關鍵代謝途徑及代謝物

3 討 論

本研究以非衰弱非MetS老年胃癌患者為對照組,基于非靶向超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術探究了衰弱組、MetS組與合并組的差異代謝物及代謝通路。結果顯示,與對照組比較,MetS組以甘油磷脂類等脂質代謝物明顯升高為特征;衰弱組以D-瓜氨酸、L-纈氨酸、L-天冬酰胺等氨基酸代謝物及多數甘油磷脂明顯下降,且肉豆蔻酸、α-亞麻酸等脂肪酸及植物鞘氨醇明顯升高為特征;合并組以假尿苷、N-乙酰胞嘧啶核苷、乳清酸核苷等核苷酸類代謝物及多種酸性化合物明顯升高為特征。丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑在衰弱組中明顯富集,甘油磷脂代謝途徑在合并組中明顯富集。

氨基酸代謝是蛋白質分解的中心內容,在腫瘤微環(huán)境中免疫細胞激活和功能發(fā)揮中也有重要作用[12]。與對照組比較,衰弱組精氨酰丙氨酸、N-乙酰纈氨酸、D-瓜氨酸、L-纈氨酸、L-天冬酰胺這5種氨基酸類物質全部明顯下降,除了與衰弱過程中肌肉質量或力量減少外有關[13],NEPAL等[14]發(fā)現(xiàn)D-瓜氨酸、L-纈氨酸、L-天冬酰胺是與衰老相關的代謝物,提示衰弱與衰老之間可能存在相同的代謝物與調節(jié)通路。國外研究者基于歐洲MetaboFrail項目對衰弱合并糖尿病人群及衰弱對照人群進行了37種氨基酸靶向測定,揭示了老年糖尿病衰弱患者的特異性氨基酸代謝特征[15]。合并組產生明顯代謝變化的谷氨酰胺[16]、谷胱甘肽[17]、N-乙酰-L-丙氨酸[18]、正纈氨酸[19]、(S)-β-氨基異丁酸[20]等氨基酸類物質已被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療及預后密切相關,因此,未來研究可關注衰弱及MetS人群腫瘤相關代謝差異,揭示其氨基酸代謝模式。脂質代謝重編程是腫瘤代謝的重要特征之一,腫瘤細胞能夠增加脂肪酸的攝取和氧化以產生能量和脂質積累,并且脂肪酸代謝異常可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展[21-22]。盡管衰弱組多數甘油磷脂類代謝物明顯下調,但植物鞘氨醇這一鞘脂類代謝物明顯升高,這也是衰弱組與合并組的共同特征。動物實驗研究結果顯示植物鞘氨醇與大鼠衰老存在正相關關系[23],提示衰弱組與合并組在衰老層面的代謝關聯(lián)。此外,RATTRAY等[24]基于英國老齡化隊列研究對1 191例人群進行血清非靶向分析,提出在衰弱狀態(tài)下機體整體脂質發(fā)生改變,與衰弱相關的肉堿水平降低可能是細胞脂質代謝惡化的潛在跡象。代謝通路分析結果顯示,合并組甘油磷脂代謝途徑明顯富集,盡管從臨床診斷或評估指標層面合并組同時具備了衰弱與MetS的特征,但其脂肪代謝特征不同于其他兩組,研究者需關注此組人群細胞脂質代謝情況,基于前瞻性研究驗證其預后。

核苷酸代謝被認為是腫瘤發(fā)生和腫瘤細胞復制的最關鍵環(huán)節(jié)[25]。研究顯示,腫瘤組織合成DNA和RNA的聚合酶活性較正常組織高,核苷酸合成增加且分解減少,因此,在癌癥狀態(tài)下核苷酸代謝物上調以滿足腫瘤細胞不受控制和快速的自我增殖需求[26-27]。假尿苷[28]及N-乙酰胞嘧啶核苷[29]水平上調、5-甲基胞嘧啶[30]水平下調等合并組產生的核苷酸類代謝物質變化已被發(fā)現(xiàn)與癌癥診斷、腫瘤侵襲轉移、治療及預后密切相關,這預示了合并組代謝異常受腫瘤細胞本身影響更大,后續(xù)需進一步關注腫瘤相關臨床指標及治療預后。另外,機體內酸堿平衡失調也是造成代謝差異的重要因素,例如酸性環(huán)境會增強泛酸介導的蛋白質降解途徑并減弱肌肉生物合成相關信號通路,最終導致肌肉蛋白分解增加[31-32]。其中,酸中毒是腫瘤組織代謝環(huán)境的基本特征之一,表現(xiàn)為細胞內堿性和細胞外酸性的微環(huán)境[3]。本研究結果顯示,合并組區(qū)別于其他組的代謝特征之一為多種酸性化合物明顯升高,這可能與合并組患者較高的腫瘤分期有關。酸性細胞外環(huán)境可增加膽固醇合成酶的表達,有助于腫瘤細胞生長,并降低腫瘤患者生存率,因此,通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境以改善腫瘤患者預后也是進行代謝調控的重要方式之一[33]。

本研究結果顯示,與對照組比較,衰弱組丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑明顯富集,合并組甘油磷脂代謝途徑明顯富集。ANGIONI等[34]基于MAPT研究數據進行了二次分析,區(qū)分了年齡相關衰弱與疾病相關衰弱的臨床特征,并提出需根據具體特征采取不同的衰弱預防和管理策略。這提示盡管現(xiàn)有的評估工具可明確區(qū)分衰弱與非衰弱,但只能識別已發(fā)生的臨床表現(xiàn),不能反映衰弱相關的病理、生理過程,而相同的表型所對應的病因及疾病發(fā)展機制不同,即使給予同樣的干預措施,所得效果也有所差異。未來可探索氨基酸或脂肪代謝調節(jié)對年齡相關衰弱與疾病相關衰弱人群衰弱發(fā)生、發(fā)展的作用,并制訂特異性的代謝調節(jié)措施。

然而值得注意的是,OPLS-DA得到的R2Y表示模型的可解釋性,R2Y>0.5說明所建模型有效性高,Q2表示模型的可預測性,Q2>0.45說明模型對于后續(xù)樣本的預測結果合理,可做出有意義預測。在本研究中,3組R2Y均大于0.5,但Q2值較低,說明所建模型有效性較高,可解釋各組兩樣本間的代謝物差異現(xiàn)象,但若有新的數據參與構建模型,對其分組準確度的可預測性較低。這可能與本研究所納入樣本較少、研究場所單一有關。

綜上所述,衰弱的老年胃癌患者以氨基酸與甘油磷脂類代謝物明顯下調、脂肪酸類代謝物明顯上調為特征,合并MetS的老年胃癌患者以脂質類代謝物明顯上調為特征。衰弱合并MetS患者存在氨基酸、脂質、核苷酸、酸性化合物等多類代謝物異常,可能與腫瘤相關代謝紊亂有關。未來研究者需關注相同衰弱表型下所對應的不同病因及疾病發(fā)展機制,給予針對性、靶向性的衰弱干預措施。然而本研究所納入的樣本較少,數據預測性不足,推廣性有限,未來仍需要基于大樣本血液檢測數據對本研究結果進行驗證。