HPLC-ELSD同時(shí)測定腺梗豨薟草中6個(gè)二萜成分的含量

殷 玥,張 璇,呼小娜

(1.長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥品食品學(xué)院,吉林 長春 130000 ; 2.遼寧天安生物制藥股份有限公司,遼寧 沈陽 110000 ;3.東北制藥集團(tuán)股份有限公司,遼寧 沈陽 110000)

《中華人民共和國藥典》(2020年版)收載豨薟草為菊科植物豨薟(SiegesbeckiaorientalisL.)、腺梗豨薟(SiegesbeckiapubescensMakino)或毛梗豨薟(SiegesbeckiaglabrescensMakino)的干燥地上部分。腺梗豨薟為豨薟草的藥典基原之一,具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)和解毒的功效,主治風(fēng)濕痹痛、四肢麻痹、半身不遂和風(fēng)疹濕瘡等癥[1]。腺梗豨薟草廣泛分布于吉林、遼寧、河北、甘肅和湖北等多個(gè)省份[2],其中主要含有以對映海松烯型和對映貝殼杉烷型為主的二萜類、倍半萜類和黃酮類等成分[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,腺梗豨薟草主要有抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓、保護(hù)心血管和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[4-5]。二萜類化合物是腺梗豨薟草的主要成分且具有廣泛的藥理活性,因此常作為腺梗豨薟草質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。《中華人民共和國藥典》(2020年版)中豨薟草的含量測定項(xiàng)僅采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)測定奇任醇的含量。蘇璇等[6]、劉贊等[7]和閆東旭等[8]建立了HPLC測定豨薟草藥材中奇任醇或豨薟精醇的含量。Jiang 等[9]建立了高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法(High performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry,HPLC-TOF/MS)測定豨薟草中二萜類和黃酮類組分的含量。由于腺梗豨薟草中對映海松烯型二萜類紫外吸收很弱,對映貝殼杉烷型二萜類甚至無紫外吸收,因此不能用高效液相色譜法-紫外檢測器同時(shí)測定這些類型的二萜類成分。HPLC-TOF/MS雖具有很高的靈敏度和選擇性,但檢測成本較高,不適用于日常分析工作。目前,有關(guān)腺梗豨薟草質(zhì)量控制方面的研究報(bào)道較少,且單一成分的含量測定并不能全面控制其質(zhì)量,分析方法亟待完善。因此,有必要建立一種可同時(shí)檢測腺梗豨薟草中多種有效成分含量的分析方法。

本試驗(yàn)建立了高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測器(High performance liquid chromatography - evaporative light scattering detector,HPLC-ELSD)同時(shí)測定腺梗豨薟草6個(gè)主要二萜成分(奇任醇、Hythiemoside B、豨薟精醇、對映-17,18-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸、對映-16β,17-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸和對映-16α氫-貝殼杉烷-17,19-二羧酸)的含量。6個(gè)二萜成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 腺梗豨薟草中6個(gè)二萜成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formulas of the six diterpenoids in Siegesbeckia pubescens MakinoA～C:對映海松烯型二萜; D～F:對映貝殼杉烷型二萜A-C:ent-pimarane; D-F:ent-kaurane

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 奇任醇、Hythiemoside B、豨薟精醇、對映-17,18-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸、對映-16β,17-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸和對映-16α氫-貝殼杉烷-17,19-二羧酸精制品(純度均>98.0%),均為本實(shí)驗(yàn)室自制;本試驗(yàn)所用2個(gè)批次的腺梗豨薟草藥材(批號1和2),均購自河北省安國振宇中藥飲片有限公司,經(jīng)沈陽藥科大學(xué)殷軍教授鑒定為菊科豨薟屬植物腺梗豨薟的干燥全草;甲醇、乙酸乙酯、乙醇(分析純)、甲酸和乙腈(色譜純),均購自天津康科德科技有限公司。

1.2 主要儀器 Jasco PU-2080 plus Pump(日本分光公司),ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器(美國Alltech公司),Sepu 3000 工作站(浙江大學(xué)),BS110S型電子天平(德國Sartorius公司),AB135-S十萬分之一天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照溶液的制備 對照儲備液:精密稱取奇任醇、Hythiemoside B、豨薟精醇、對映-17,18-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸、對映-16β,17-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸和對映-16α氫-貝殼杉烷-17,19-二羧酸精制品,分別加甲醇溶解制成濃度為1 mg/mL的對照儲備液。

混合對照儲備液:精密量取上述6個(gè)對照儲備液,置于 25 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成奇任醇、Hythiemoside B、豨薟精醇、對映-17,18-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸、對映-16β,17-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸和對映-16α氫-貝殼杉烷-17,19-二羧酸濃度分別為500、150、50、150、350和300 μg/mL的混合對照儲備液。

1.3.2 供試品溶液的制備 分別收集腺梗豨薟草藥材的葉、枝和莖,粉碎(過380 μm篩)。精密稱定不同部位干燥粉末40 g,分別加10倍量甲醇回流提取1次,再加10倍量乙酸乙酯回流提取2次,每次1 h,合并提取液,過濾,濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃水浴減壓除去溶劑,殘?jiān)眉状嫁D(zhuǎn)移至20 mL量瓶中,用甲醇溶解,定容并搖勻,即得腺梗豨薟草葉、枝和莖溶液。精密量取葉和枝溶液各5 mL,分別置于50 mL和10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,混勻,過0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液,供高效液相色譜儀分析。

1.4 檢測方法

1.4.1 色譜條件 流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度:103 ℃;霧化氣流速:3.0 L/min;進(jìn)樣量:20 μL;色譜柱:Symmetry ShieldTMRP18 色譜柱 (250 mm × 4.6 mm,5 μm,Waters);流動(dòng)相:A相為0.3%甲酸水溶液,B相為乙腈;梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照儲備液1、2、4、6、8和10 mL至10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得混合對照溶液。在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。以各對照品峰面積的對數(shù)值(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度的對數(shù)值(x)為橫坐標(biāo),進(jìn)行回歸計(jì)算。

1.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“1.4.2”項(xiàng)混合對照溶液在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄混合對照品色譜圖。

1.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一混合對照溶液在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定峰面積,并計(jì)算6個(gè)二萜類化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviaton,RSD)。

1.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批腺梗豨薟草藥材枝部位粉末(過380 μm篩),按“1.3.2”項(xiàng)方法平行制備供試品溶液6份,在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,計(jì)算6個(gè)二萜類化合物含量的RSD。同法在連續(xù)3 d內(nèi)進(jìn)行樣品測定,考察方法的日間精密度。

1.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定9 份批號1的腺梗豨薟草藥材枝部位粉末(過380 μm篩),每份約20 g。分別加入一定量的奇任醇、Hythiemoside B、豨薟精醇、對映-17,18-三羥基-貝殼杉烷-19-羧酸、對映-16β,17-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸和對映-16α氫-貝殼杉烷-17,19-二羧酸共6個(gè)二萜對照儲備液(約相當(dāng)于 20 g 藥材中所含各化合物的量),按“1.3.2”項(xiàng)方法分別制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液,在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,根據(jù)公式(1)計(jì)算回收率并計(jì)算RSD值。

回收率(%)=測得量÷加入量×100%

(1)

1.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份腺梗豨薟草藥材枝部位供試品溶液,室溫放置,分別于0、12、24、48和72 h后,在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,測定峰面積,并計(jì)算 6 個(gè)二萜類化合物峰面積的RSD。

1.4.8 樣品含量測定 取批號1和2的腺梗豨薟草藥材,按“1.3.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,在“1.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算樣品中 6 個(gè)二萜類化合物的含量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系考察 結(jié)果如表2所示,6個(gè)二萜類化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.999 2)。

表2 腺梗豨薟草中6個(gè)二萜類化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2 Regression equation,correlation coefficient (r) and linearity range for the six diterpenoids in Siegesbeckia pubescens Makino

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 如圖2A所示,混合對照品中6個(gè)二萜類化合物分離度良好,與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,各色譜峰的理論塔板數(shù)均不低于4 000。

圖2 混合對照品(A)和腺梗豨薟草葉(B)、枝(C)、莖(D)樣品提取物的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the standard mixture (A)and the leaves (B),branches (C),stems(D) of Siegesbeckia pubescens Makino

2.3 精密度試驗(yàn) 同一混合對照溶液重復(fù)測定6次,6個(gè)二萜類化合物峰面積的RSD為0.54%～1.1%,表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備的6份供試品溶液中6個(gè)二萜類化合物含量的RSD為1.0%～2.9%,連續(xù)3 d測定的6個(gè)二萜類化合物含量的RSD為1.5%～3.5%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 如表3所示,低、中、高 3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液中6個(gè)二萜類化合物含量的回收率介于96.5%～101.5%,RSD均小于2.3%,表明該方法具有良好的回收率和精密度,符合分析要求。

表3 腺梗豨薟草中6個(gè)二萜類化合物的加樣回收率試驗(yàn)Table 3 Recoveries of the six diterpenoids in Siegesbeckia pubescens Makino (n=3)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 腺梗豨薟草藥材枝部位供試品溶液于室溫放置0、12、24、48和72 h后,6 個(gè)二萜類化合物峰面積的 RSD值均小于 3.3%,表明供試品溶液于室溫放置 72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品含量測定 腺梗豨薟草葉、枝、莖樣品提取物的液相色譜圖見圖2B～2D。對2個(gè)批次的藥材樣品中6個(gè)二萜類化合物的含量進(jìn)行測定,結(jié)果如表4所示,葉中均未檢測到Hythiemmoside B,莖中均未檢測到豨薟精醇,枝中雖然檢測出6個(gè)二萜類化合物,但含量低于葉中含量。結(jié)果表明,采用HPLC-ELSD測定腺梗豨薟草葉、枝、莖中6個(gè)二萜類化合物的含量,方法簡便、準(zhǔn)確,且腺梗豨薟草不同部位(葉、枝、莖)的二萜成分含量差異較大。

表4 腺梗豨薟草不同部位的6個(gè)二萜類化合物的成分分析Table 4 Compound analysis of the six diterpenoids in different parts of Siegesbeckia pubescens Makino (mg/g,n=3)

3 討論

3.1 提取方法考察 前期試驗(yàn)采用單因素循環(huán)法,分別考察了提取時(shí)間(0.5、1.0和1.5 h)、提取次數(shù)(1、2和3次)、提取方式(超聲和回流)、提取溶劑(甲醇、80%乙醇、無水乙醇和乙酸乙酯)以及溶劑倍量(8、10和12倍)對提取效率的影響。由于6個(gè)二萜類化合物極性差別較大,最終選擇的提取方法為:10倍量甲醇回流提取1次,10倍量乙酸乙酯回流提取2次(每次1 h)。采用該提取方法使藥材中總二萜成分的提取效率最高,且目標(biāo)分析物的干擾最小。

3.2 色譜條件考察 流動(dòng)相的選擇對色譜峰分離度、峰形和化合物的離子化程度有重要影響。本試驗(yàn)考察了甲醇-水和乙腈-水體系作為流動(dòng)相,由于乙腈的洗脫能力強(qiáng)于甲醇,有助于在較短時(shí)間內(nèi)完成分析且峰形較好,因此選擇乙腈-水體系作為流動(dòng)相。由于部分化合物中含有羧基,在進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件的過程中考察了加入甲酸、冰醋酸和乙酸銨對化合物色譜行為的影響。結(jié)果顯示,采用0.3%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)色譜峰的峰形和分離度較好,因此選擇0.3%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相。

3.3 蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative light scattering detector,ELSD)參數(shù)考察 ELSD的檢測原理是首先將柱洗脫液霧化形成氣溶膠,然后在加熱的漂移管中將溶劑蒸發(fā),在光散射檢測池中檢測剩余的不揮發(fā)性溶質(zhì)顆粒[10]。本試驗(yàn)考察了ELSD的3個(gè)重要參數(shù):撞擊器操作模式、漂移管溫度和霧化氣流速,以使信噪比達(dá)到最大。ELSD 2000ES 有2種不同的撞擊器操作模式:開和關(guān)。在撞擊器處于關(guān)的模式下,氣溶膠不分流,全部樣品流都到達(dá)光散射檢測池以獲得最佳靈敏度,該操作模式適用于分析非揮發(fā)性樣品;在撞擊器處于開的模式下,大的液滴從廢液管排出,余下的液滴則通過漂移管到達(dá)光散射檢測池,該操作模式適用于分析半揮發(fā)性樣品或使用高流速流動(dòng)相時(shí)分析樣品。由于6個(gè)二萜類化合物為非揮發(fā)性化合物,因此選擇撞擊器關(guān)的操作模式。漂移管溫度和霧化氣流速的考察范圍分別為 90～110 ℃ 和 2.5～3.2 L/min,以信噪比作為選擇2個(gè)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。漂移管溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相在漂移管內(nèi)沸騰,過低則溶劑揮發(fā)不完全,2種情況均會(huì)使基線噪音增加,信噪比降低。霧化氣的流速越高,形成的液滴越小,越容易蒸發(fā),但同時(shí)小顆粒散射光少,會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低;而霧化氣流速過低,形成的液滴過大,溶劑蒸發(fā)不完全,基線噪音增加。結(jié)果表明,當(dāng)漂移管溫度為103 ℃,霧化氣流速為3.0 L/min時(shí)獲得的信噪比最高。

3.4 樣品測定結(jié)果分析 對2個(gè)批次的藥材樣品的測定結(jié)果表明,腺梗豨薟草藥材不同部位所含二萜成分含量差別顯著。藥材葉和莖中含量最高的成分為奇任醇,而枝中含量最高的成分則為對映-16β,17-二羥基-貝殼杉烷-19-羧酸。只有藥材的枝中能檢測到所有6個(gè)二萜成分,葉中未檢測到Hythiemoside B,莖中未檢測到豨薟精醇。另外,藥材葉中對映海松烯型二萜、對映貝殼杉烷型二萜和總二萜的含量遠(yuǎn)高于藥材枝和莖中的含量。以上這些差異與豨薟草藥材的質(zhì)量直接相關(guān)。鑒于葉中二萜類化合物活性成分含量最高,因此建議將葉作為最佳入藥部位。

綜上所述,本試驗(yàn)首次建立了準(zhǔn)確靈敏的 HPLC-ELSD同時(shí)測定豨薟草藥材中的2種類型(對映海松烯型和對映貝殼杉烷型)共6個(gè)二萜類化合物的含量。使用該方法成功測定了2批腺梗豨薟草藥材不同部位(葉、枝、莖)中二萜類化合物的含量,并比較了不同部位中對映海松烯型二萜、對映貝殼杉烷型二萜和總二萜含量的差異。該方法簡單、高效,適合常規(guī)分析,為腺梗豨薟草藥材全面的質(zhì)量評價(jià)和臨床應(yīng)用中最佳藥用部位的選擇提供了參考依據(jù)。