溴莫尼定聯合水合氯醛對大鼠和小鼠的麻醉效果

張 川,王曉輝,呂 楠,陳 斌

(天津市醫藥科學研究所,天津 和平 300020)

溴莫尼定是高選擇性腎上腺素能α2受體激動劑,除了具有降眼壓的臨床作用外,對小型動物有較好的麻醉和鎮痛效果,且對呼吸和心血管功能影響較小[1-2],可以滿足多種給藥方式,組織吸收性好[3]。然而,溴莫尼定單獨應用仍不足以達到完全理想的麻醉要求。

水合氯醛是常用鎮靜劑,可以激活γ-氨基丁酸A(Gamma-amino butyric acid A,GABAA)受體,有起效快和成本低等優勢[4]。但因水合氧醛沒有鎮痛作用,單獨使用不能滿足存活動物的外科手術麻醉要求,同時也違背實驗動物倫理要求[5]。在外科手術或有疼痛感受的檢查操作時,如果使用水合氯醛,需要與其他麻醉或鎮痛藥物合用。

目前,實驗室大鼠和小鼠手術中所用的非氣體麻醉藥物,因受到管控的影響導致選擇受限。常用的麻醉方案多采用α2受體激動劑與其他藥物合用,比如:右美托咪定與舒泰聯合麻醉,賽拉嗪與水合氯醛聯合麻醉,前一方案對大鼠較安全且效果較好[6],但對小鼠的治療指數狹窄[7]且藥物價格昂貴;后一方案對大鼠和小鼠的治療指數較狹窄,且頡頏劑催醒效果欠佳。

本試驗嘗試將溴莫尼定與水合氯醛聯合使用,通過發揮2種藥物的優勢,降低藥物的使用劑量,在使麻醉效果達到常規手術需求的同時,減少藥物對動物機體造成的傷害,同時控制麻醉成本。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物配制

1.1.1 主要試劑 阿替美唑粉劑(批號為20201218)和溴莫尼定粉劑(批號為AG08-PK20200701),均購自深圳市星凱越生物科技有限公司;水合氯醛粉劑(批號為20200324),購自天津科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 藥物配制 配制含9 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛聯合溶液,用于大鼠高劑量組的麻醉;配制含6 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛聯合溶液,用于大鼠低劑量組的麻醉。配制含3.6 mg/mL溴莫尼定的5%水合氯醛聯合溶液,用于小鼠高劑量組的麻醉;配制含2.4 mg/mL 溴莫尼定的5%水合氯醛聯合溶液,用于小鼠低劑量組的麻醉。配制濃度為0.2 mg/mL的阿替美唑溶液,用于大鼠高劑量麻醉和頡頏劑組的催醒;配制濃度為1 mg/mL的阿替美唑溶液,用于小鼠頡頏劑高劑量組和低劑量組的催醒。

1.2 主要儀器 ALC-NIBP無創血壓測量分析系統,購自上海奧爾科特生物科技有限公司;醫用電子體溫計,購自廣州倍爾康醫療器械有限公司。

1.3 實驗動物 健康SD大鼠(雄性,SPF級,體重180～200 g)和健康C57小鼠(雄性,SPF級,體重18～20 g),均購自北京維通利華實驗動物中心[實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2016—0006]。動物試驗在天津市醫藥科學研究所的動物室[使用許可證號:SYXK(津)2021—0005]完成。動物試驗經天津市醫藥科學研究所動物倫理委員會批準,許可編碼:IMPS-EAEP-Q-2020-01。試驗結束,所有動物麻醉后人道處死。

1.4 試驗方法

1.4.1 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射對大鼠的聯合麻醉作用 取10只大鼠隨機分為高劑量組和低劑量組,每組5只。高劑量組大鼠用含9 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛聯合溶液以1 mL/(kg·bw)劑量腹腔注射,給藥劑量為9 mg/(kg·bw) 溴莫尼定和100 mg/(kg·bw)水合氯醛;低劑量組大鼠用含6 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛聯合溶液以1 mL/(kg·bw)劑量腹腔注射,給藥劑量為6 mg/(kg·bw) 溴莫尼定和100 mg/(kg·bw)水合氯醛。觀察大鼠的麻醉反應:(1)大鼠行為和自主活動:外觀姿勢、精神狀態、鉗夾四肢和針刺尾尖刺激后反應情況等;(2)麻醉時間:從給藥到鉗夾和針刺反射消失的時間為麻醉誘導時間,反射消失到反射恢復的時間為麻醉維持時間。在大鼠進入麻醉時,雙眼上眼膏,以避免大鼠在麻醉期間因失去眨眼能力導致的角膜傷害。

1.4.2 聯合麻醉和頡頏劑對大鼠血壓、心率和體溫的影響 取10只大鼠隨機分為大鼠高劑量麻醉和頡頏劑組及大鼠高劑量組,每組5只。大鼠高劑量麻醉和頡頏劑組按1.4.1中大鼠高劑量組的方案給藥。給藥前將大鼠尾部固定在ALC-NIBP無創血壓測量分析系統的固定附件內,通過振蕩法無創測定基礎心率和血壓。大鼠腹腔注射麻醉后15、30和45 min,測定大鼠心率和血壓,記錄心血管動力學隨時間的變化。在麻醉后45 min時,檢測心率和血壓后,按0.1 mg/(kg·bw)劑量肌肉注射0.2 mg/mL的阿替美唑溶液,并在麻醉后50 min時再次檢測心率和血壓。大鼠高劑量組給藥方案同1.4.1,觀察期內不注射阿替美唑。在22 ℃的室溫環境下,分別于麻醉前以及麻醉后15、30、45、60、75、90、105和120 min時,用醫用電子體溫計測量并記錄大鼠的口腔溫度,觀察大鼠行為活動情況。

1.4.3 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射對小鼠的聯合麻醉作用 取10只小鼠隨機分為高劑量組和低劑量組,每組5只。高劑量組小鼠用含3.6 mg/mL溴莫尼定的5%水合氯醛聯合溶液以5 mL/(kg·bw)劑量腹腔注射,給藥劑量為18 mg/(kg·bw)溴莫尼定和250 mg/(kg·bw)水合氯醛;低劑量組小鼠用含2.4 mg/mL溴莫尼定的5%水合氯醛聯合溶液以5 mL/(kg·bw)劑量腹腔注射,給藥劑量為12 mg/(kg·bw)溴莫尼定和250 mg/(kg·bw)水合氯醛。待小鼠靜臥不動時,仰臥位置于保溫臺上保持體溫。觀察小鼠的麻醉反應,方法同1.4.1。

1.4.4 頡頏劑對聯合麻醉小鼠低體溫和尿潴留的預防作用 取10只小鼠隨機分為小鼠頡頏劑高劑量組和低劑量組,每組5只。用含2.4 mg/mL溴莫尼定和5%水合氯醛的低劑量麻醉聯合溶液以5 mL/(kg·bw)劑量腹腔注射。待小鼠靜臥不動時,仰臥位置于保溫臺上保持體溫。麻醉15 min后,用醫用電子體溫計測量并記錄小鼠的口腔溫度。小鼠頡頏劑低劑量組按0.8 mg/(kg·bw)劑量肌肉注射1 mg/mL的阿替美唑溶液,小鼠恢復活動后置于室溫環境,在給藥后5、10、15、20、25、30、60、90和120 min時,用醫用電子體溫計測量并記錄小鼠的口腔溫度,觀察小鼠行為活動情況。小鼠頡頏劑高劑量組按1.6 mg/(kg·bw)劑量肌肉注射1 mg/mL的阿替美唑溶液,小鼠恢復活動后置于室溫環境,同前測量并記錄口腔溫度。小鼠體溫低于32 ℃時停止溫度測量,放回保溫臺。進入蘇醒期5 h后,過量麻醉處死小鼠,解剖觀察膀胱充盈情況。

1.5 統計分析 用SPSS 17.0軟件進行統計學分析,用t檢驗方法將大鼠高劑量組和低劑量組之間以及小鼠高劑量組和低劑量組之間的麻醉誘導時間和麻醉維持時間進行比較。用方差分析法比較大鼠高劑量組各時間點血壓、心率和體溫的變化,并用dunnett-t檢驗將后續各時間結果與給藥前的血壓和心率進行比較。P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著,P<0.001 表示差異極其顯著。

2 結果

2.1 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射對大鼠的聯合麻醉作用 注射后大鼠先表現躁動,逐漸出現共濟失調,隨后動作減少,呼吸減慢變深,眼球突出,最后針刺和鉗夾反射消失。如圖1所示,大鼠高劑量組麻醉維持時間[(27.8±13.3)min]較低劑量組[ (6.2±2.7) min]極顯著延長(P<0.01);高劑量組麻醉誘導時間[(4.0±1.4)min]較低劑量組[(11.6±1.8)min]極其顯著縮短(P<0.001);麻醉期內所有大鼠都有逐滴排尿現象。

圖1 大鼠的麻醉誘導時間和麻醉維持時間Fig.1 Induction time and maintenance time of anesthesia in rats低劑量組與高劑量組相比,**:P<0.01; ***:P<0.001Comparison between Low-dose group and High-dose group,**:P<0.01;***:P<0.001

2.2 聯合麻醉和頡頏劑對大鼠的血壓、心率和體溫的影響 如圖2所示,2個組大鼠的血壓在麻醉后變化平穩,各個時間點的高壓、低壓和平均動脈壓均沒有顯著差異(P>0.05)。高劑量麻醉和頡頏劑組在阿替美唑麻醉后(50 min),高壓、低壓和平均動脈壓與麻醉前的各時間點相比,也均沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 大鼠聯合麻醉后的血壓變化Fig.2 Changes of blood pressure of rats after combined anesthesiaA:高劑量麻醉和頡頏劑組; B:高劑量組A: High-dose anesthesia and reversal group; B: High-dose group

如圖3所示,大鼠高劑量組麻醉期間(麻醉后0～50 min)各時間點與麻醉前(0 min)相比,心率呈下降趨勢(P<0.05或P<0.01)。高劑量麻醉和頡頏劑組麻醉期間(麻醉后0～45 min)各時間點與麻醉前(0 min)相比,心率呈顯著下降趨勢。與麻醉前[(373.3±21.6)次/min]相比,麻醉后15 min時大鼠心率[(310.6±34.8)次/min]顯著下降(P<0.05),麻醉后30 min時心率[(350.3±5.2)次/min]和45 min時心率[(235.6±2.7)次/min]極顯著下降(P<0.01)。但麻醉后30和45 min時,大鼠鉗夾和針刺反射恢復。阿替美唑注射5 min后,所有大鼠恢復活動,心率回升到(376.9±22.4)次/min,但此時的心率仍極顯著低于麻醉前的心率(P<0.01)。

圖3 大鼠聯合麻醉后的心率變化Fig.3 Changes of heart rate of rats after combined anesthesia與麻醉前(0 min)相比,高劑量組:*:P<0.05,**:P<0.01;高劑量麻醉和頡頏劑組:#:P<0.05,##:P<0.01Compared with pre-anesthesia(0 min), high-dose group: *: P<0.05, **: P<0.01;high-dose anesthesia and reversal group: #: P<0.05, ##: P<0.01

如圖4所示,2個組大鼠麻醉后體溫有輕度下降的趨勢,與麻醉前體溫(38.0±0.4)℃相比,高劑量組在各時間點的體溫均無顯著性差異(P>0.05)。在高劑量麻醉和頡頏劑組,麻醉前體溫(37.8±0.3)℃分別與麻醉后15、30和45 min時的體溫,即(37.7±0.4)℃、(37.3±0.5)℃和(37.1±0.6)℃相比,均沒有顯著性差異(P>0.05),之后大鼠逐漸恢復自主運動,體溫保持平穩。單只大鼠的最低溫度為35.9 ℃,為高劑量麻醉和頡頏劑組麻醉后75 min的時間點測得。

圖4 大鼠聯合麻醉后的體溫變化Fig.4 Changes of temperature of rats after combined anesthesia

2.3 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射對小鼠的聯合麻醉作用 注射后小鼠逐漸出現共濟失調,隨后動作減少,呼吸減慢變深,眼球突出,最后針刺和鉗夾反射消失。如圖5所示,小鼠低劑量組麻醉誘導時間為(6.4±1.9)min,麻醉維持時間為(9.4±2.7)min,高劑量組麻醉誘導時間為(5.4±1.1)min,麻醉維持時間為(12.4±2.9)min,兩組差異不顯著(P>0.05)。麻醉期內小鼠沒有排尿現象。

圖5 小鼠的麻醉誘導時間和麻醉維持時間Fig.5 Induction time and maintenance time of anesthesia in mice

2.4 頡頏劑對聯合麻醉小鼠低體溫和尿潴留的預防作用 頡頏劑高劑量組和低劑量組小鼠肌肉注射阿替美唑后,所有小鼠均于2 min內起身,多數小鼠在起身前十幾秒大量排尿。小鼠可自主活動,但有明顯的共濟失調表現。

頡頏劑低劑量組小鼠脫離溫箱保溫環境后,體溫在20 min內降至32 ℃以下,低于測量儀器的測溫最低值,隨著體溫降低,小鼠的行動逐漸減少、靜臥,但碰觸后仍可活動,皮膚發冷明顯;5 h后部分小鼠體溫回升到32 ℃以上,并恢復自主活動。頡頏劑高劑量組小鼠脫離溫箱保溫環境后,體溫在30 min內有所下降,最低體溫為33.2 ℃(2號小鼠,25 min),所有小鼠仍能自主活動,90 min后體溫恢復到脫離溫箱之前的水平(圖6)。

圖6 阿替美唑給藥后麻醉小鼠的體溫變化Fig.6 Changes of the temperature of anesthetized mice which were injected intramuscularly with atipamezole

小鼠恢復活動5 h后,解剖觀察發現,頡頏劑低劑量組有1只小鼠膀胱明顯充盈,組內其余小鼠和頡頏劑高劑量組小鼠膀胱充盈均不明顯。

3 討論

麻醉劑量的水合氯醛易使大鼠發生室性心動過速[8]、腸動力抑制和腸粘連[9],溴莫尼定與水合氯醛聯合麻醉小型動物時,在中樞有協同鎮靜作用,很大程度降低了水合氯醛的用量,并降低其副作用,彌補了單用水合氯醛和鎮痛作用的不足[10]。研究表明,將賽拉嗪[10 mg/(kg·bw),腹腔注射]與水合氯醛[150 mg/(kg·bw),腹腔注射]合用,可導致大鼠翻正反射消失,麻醉誘導時間1.5 min,麻醉維持時間1.5 h,但大鼠翻正反射消失并不足以證明藥物組合可達到外科麻醉的深度,需要鉗夾反射的消失和恢復作為觀察指標[11]。另有研究將賽拉嗪[12]或賽拉唑[13]與水合氯醛合用麻醉家兔,但因賽拉嗪和賽拉唑本身的安全范圍不大,導致這些聯合麻醉方案有一定危險性,容易麻醉過量[14-15]。Chen等[1]研究表明,0.4 mg/(kg·bw)和0.5 mg/(kg·bw)的溴莫尼定分別對小鼠和大鼠有較好的鎮痛作用,0.6 mg/(kg·bw)溴莫尼定和30 mg/(kg·bw)水合氯醛聯合麻醉對家兔具有較好的麻醉效果,安全范圍廣,不良反應輕。這提示溴莫尼定與水合氯醛的組合也可以用于大鼠和小鼠的聯合麻醉。

本試驗中,溴莫尼定與水合氯醛聯合腹腔注射,所有大鼠和小鼠都觀察到鉗夾和針刺反射消失,表明溴莫尼定與水合氯醛聯合使用具有較穩定的麻醉效果。9 mg/(kg·bw)溴莫尼定與100 mg/(kg·bw)水合氯醛聯合麻醉對大鼠的麻醉維持時間,以及12 mg/(kg·bw)溴莫尼定與250 mg/(kg·bw)水合氯醛聯合麻醉對小鼠的麻醉維持時間均可滿足簡單手術所需,麻醉深度較好,無動物死亡。

本試驗觀察到麻醉過程中大鼠血壓保持穩定,但心率下降,其原因可能是聯合麻醉使動物交感壓力降低,調高了動脈壓力感受反射敏感性,使不高的血壓也能反射性降低心率[16]。α2受體激動劑單獨使用能調高動脈壓力感受反射敏感性[17],而水合氯醛單獨使用則降低反射敏感性[18]。

本試驗結果顯示,阿替美唑可使麻醉大鼠和小鼠快速蘇醒且心率回升。阿替美唑能有效且迅速頡頏溴莫尼定與水合氯醛的麻醉作用,與之相比,苯噁唑頡頏賽拉嗪和水合氯醛聯合麻醉的方案則有催醒作用不佳的缺點[19]。苯噁唑是α2受體頡頏劑,且有一定的α1受體頡頏活性,適合用于α2/α1中等選擇性的賽拉嗪鎮靜劑的頡頏劑[20]。Yarbrough 等[19]研究發現,中等選擇性的α2受體頡頏劑苯噁唑對10 mg/(kg·bw)賽拉嗪和250 mg/(kg·bw)水合氯醛聯合麻醉小鼠的催醒劑量區間很窄,因為如果使用劑量稍高,頡頏劑的α1受體頡頏活性可以和水合氯醛再次產生協同鎮靜作用,動物則不會被催醒。阿替美唑是高選擇性α2受體頡頏劑,α1受體頡頏活性極低[21],對高選擇性α2受體激動劑和水合氯醛聯合麻醉的小動物使用較高劑量時,不會產生類似苯噁唑的再次鎮靜作用。

本試驗觀察到在麻醉時大鼠都有逐滴排尿的現象,小鼠在麻醉過程中不排尿,不用頡頏劑的全部小鼠和使用低劑量頡頏劑的少數小鼠在麻醉后可見膀胱充盈明顯。這可能是溴莫尼定作用于下丘腦室旁核α2受體,抑制抗利尿激素的釋放,導致尿量增多,同時麻醉過程中溴莫尼定抑制去甲腎上腺素的釋放,抑制膀胱的收縮[22],這是大鼠多尿且逐滴排尿,小鼠解剖發現膀胱充盈的原因。鎮靜劑右美托咪定也有類似的作用[23-24]。Wells 等[25]研究發現,0.5 mg/(kg·bw)右美托咪定給藥后,有3%的雄性小鼠在24～72 h內出現了嚴重的尿道阻塞,甚至死亡。肌肉注射0.1 mg/(kg·bw)阿替美唑的大鼠和肌肉注射1.6 mg/(kg·bw)阿替美唑的小鼠因頡頏劑的作用,膀胱收縮恢復,在蘇醒前大量排出存尿,有效避免了尿潴留。

小鼠麻醉狀態下保持體溫的能力較弱,容易因明顯的體溫過低造成損傷[26],故要求小鼠在麻醉操作中需要做好保溫。聯合麻醉后的小鼠肌肉注射較高劑量[1.6 mg/(kg·bw)]的阿替美唑,在快速催醒、有效防止尿潴留的同時,還可預防體溫過低。在室溫下,大鼠聯合麻醉體溫雖有輕度下降,但總體穩定,對麻醉過程影響不大,沒有出現體溫過低情況,不需要專門保溫措施。

本試驗中還發現,大鼠和小鼠在麻醉過程中眼球明顯外凸,蘇醒時眼球縮回正常位置。溴莫尼定對人有縮小瞳孔和降低眼壓的作用,但對大鼠和小鼠的影響有物種差異性,使用溴莫尼定后反而會表現為擴瞳[27],可能由此引起大鼠和小鼠眼壓增高,使眼球外凸。

綜上所述,溴莫尼定與水合氯醛聯合麻醉具有效果穩定、操作方便、性價比高和心血管動力學影響較小等優點,是一種可行的小動物手術麻醉方案,也可為溴莫尼定與其他擬GABA鎮靜劑的合用提供參考和指導,阿替美唑作為其頡頏劑進一步增加了這種麻醉方案的安全性。