陜西西安閻良區及毗鄰區域奶山羊傳染性胸膜肺炎橫斷面調查和風險因素分析

董 釗,李忠軍,張 濤,王玉梅,陳 峰,楊厚安,朱 琳,張 飛,尤鵬飛,崔忠華,張 璞,何勇君0

(1. 西安市動物疫病防疫控制中心,陜西 西安 710061 ; 2. 西安市閻良區動物疾病預防控制中心,陜西 西安 710089 ; 3. 寧夏回族自治區動物疾病預防控制中心,寧夏 銀川 750004 ; 4. 山東省動物疫病預防與控制中心,山東 濟南 250100 ; 5. 西安市臨潼區動物疾病預防控制中心,陜西 西安 710600 ; 6. 中國動物衛生與流行病學中心,山東 青島 266032 ; 7. 西安市閻良區武屯鎮畜牧獸醫站,陜西 西安 710089 ; 8. 西安市閻良區關山鎮畜牧獸醫站,陜西 西安 710089 ; 9. 西安市高陵動物疫病防疫控制中心,陜西 西安 710200 ; 10.漢中市城固縣老莊鎮農業綜合服務站,陜西 漢中 723000)

奶山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)主要是由山羊支原體山羊肺炎亞種引起的一種高度接觸性的呼吸道傳染病[1];山羊支原體絲狀亞種和綿羊肺炎支原體也可導致感染該病[2]。該病可經呼吸道傳播,具有潛伏期長、感染率高、治療困難和死亡率高的特點。該病可分為最急性型、急性型和慢性型,其中前2種較為常見且最易感染,威脅最大;慢性型病癥較輕,致死率較低,卻最易復發和誘發其他病癥,難以徹底治愈[3],致使飼養成本增大,羊只利用年限降低。

陜西省作為全國最大的奶山羊生產基地,打造了千億級奶山羊全產業鏈。西安市奶山羊板塊主要布局在市轄區以東的閻良區、臨潼區和高陵區等地。陜西省重點建設的奶山羊特色小鎮坐落于閻良區,占全國產能的40%。近年的流行病學調查結果顯示,閻良區及毗鄰區部分奶山羊養殖場點曾出現CCPP。為了更好地促進區域內奶山羊產業健康發展,掌握該病感染抗體情況,分析疫病傳播的風險因素,本團隊于2021年7—8月在閻良區及毗鄰區域開展了調查分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象 確定研究區域、目標群和研究單元。研究區域為閻良區全區7個鎮(街道)以及毗鄰的臨潼區4個鎮(街道)和高陵區的2個鎮(街道),共計403個場點。目標群為區域內羊存欄量≥30只的場點245個和散養村158個(村內所有存欄量<30只的養殖戶視為1個群),共計403個場點(羊存欄量共58 468只)。研究單元分為場群層面和個體層面,場群層面為每個規模場或村,個體層面為1個場點內3～24月齡未免疫CCPP疫苗的山羊。

1.2 抽樣策略和樣本量 采取二階段抽樣,以區域內403個場點作為抽樣框,對場點進行編號。第1階段以估計流行率的計算公式(1)[4]估計場點數。

(1)

式中P代表預期流行率(Expected prevalence),設為50%;e代表可接受絕對誤差(Acceptable absolute error),設為10%;Z代表標準正態分布中概率為0.05所對應值,設為1.96。對抽樣框內場點進行簡單隨機抽樣,再根據3個區的場點數按比例分配抽樣數,在層內進行簡單隨機抽樣。第2階段以發現疫病的計算公式(2)和(3)[4]估計場內個體樣本量,在場內進行簡單隨機抽樣。

(2)

D=N×P

(3)

式中Se代表檢測試驗敏感性(Sensitivity),設為93%[5];CI代表置信區間(Confidence interval),設為95%;D代表群內陽性動物數;P代表預期流行率(Expected prevalence),設為20%(根據預調查確定);N代表群內個體數。

1.3 問卷調查和采樣檢測 經查閱資料設計結構化、封閉式問卷,并進行預調查,羅列出問場點概況、引種情況和病畜處置等因素作為風險因素分析的潛在因素。采集山羊血液并分離血清,按照山羊支原體山羊肺炎亞種抗體ELISA試劑盒(廣州悅洋生物技術有限公司)說明書進行檢測。

1.4 病例定義 陽性個體為經山羊支原體山羊肺炎亞種抗體ELISA試劑盒檢測為血清學陽性樣本所對應的個體。陽性場群為群體內至少有4只山羊確診為陽性個體所在的群體(根據Cut-off值確定)。

1.5 數據計算和統計

1.5.1 群敏感性(Herd sensitivity,HSe)和群特異性(Herd specificity,HSp) 根據公式(4)和(5)計算最適合檢測陽性數(Cut-off值)所對應的HSe和HSp,并根據公式(6)計算約登指數[4]。

HSe=1-[1-PSe-(1-P)(1-P)]n

(4)

HSp=Spn

(5)

Youden Index=HSe+HSp-1

(6)

式中Se代表檢測試驗敏感性,設為93%;Sp代表檢測試驗特異性,設為88%;P代表流行率,設為20%;n代表平均個體抽樣數,為個體抽樣總數與場群抽樣總數相除所得值;Youden Index代表約登指數。

1.5.2 表觀流行率和真實流行率計算 將抽樣數、陽性數、Se、Sp等指標帶入公式(7)～(11)[4],計算群表觀流行率、個體表觀流行率、群真實流行率、個體真實流行率和95%CI。

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

式中HAP代表群表觀流行率(Herd apparent prevalence);AP代表個體表觀流行率(Apparent prevalence);HTP代表群真實流行率(Herd true prevalence);TP代表個體真實流行率(True prevalence);Se代表檢測試驗敏感性,設為93%;Sp代表檢測試驗特異性,設為88%;95%CI代表95%置信區間;n代表抽樣數;P代表流行率;Z代表標準正態分布中概率為0.05所對應值,設為1.96。

1.5.3 數據統計分析 將問卷信息Excel 錄入,采用IBM SPSS Statistics 25軟件進行統計分析。將陽性群和陰性群與各因素之間進行卡方檢驗計算關聯,篩選潛在風險因素。將單因素分析篩選出的因素作為自變量,實驗室檢測所判定的陽性群和陰性群作為因變量,按照二元Logistic回歸的方法進行多因素分析,得到回歸模型,繪制ROC曲線(Receiver operating characteristic curve),評估模型的擬合度。

2 結果

2.1 樣品采集 實際抽取場點共計79個(圖1,其中閻良區38個、高陵區14個、臨潼區27個),個體樣本共計1 233份。

圖1 采樣場點分布Fig.1 Distribution of sampling regions圓點:場點分布(藍色:閻良區; 粉色:臨潼區;黃色:高陵區); 五角星:檢測陽性場點分布Dots: Distribution of sampling sites (Blue: Yanliang District; Pink: Lintong District; Yellow: Gaoling District); Five-pointed stars: Distribution of positive test sites

2.2 HSe和HSp計算 經計算,當Cut-off值為1和2時,HSe達到95%以上,但對應的HSp太低,會導致檢測陰性的樣本中出現假陰性的概率較高;當Cut-off值為3和4時,計算約登指數分別為57.10%和58.60%。因此,選擇約登指數最大值對應的Cut-off值,即當Cut-off值為4時,HSe為70.2%、HSp為88.4%,可以較好確保感染群被檢出的可能性又兼顧特異性,結果見表1。

表1 不同Cut-off值對應的群敏感性和群特異性Table 1 Herd sensitivity and herd specificity corresponding to different Cut-off value (%)

2.3 血清學流行率 群體層面共抽取了79個場點,檢出陽性場點20個,HAP為25.32%,HTP為23.41%(14.07%～32.74%),其中閻良區、高陵區和臨潼區HTP分別為16.13%(4.44%～27.83%)、28.96%(5.20%～52.72%)和30.77%(13.36%～48.18%)(表2)。個體層面共抽取了1 233份樣本,檢出陽性樣本129份,AP為10.46%(8.81%～12.31%),由于檢測方法固有的Sp相對較低(88.00%),無法直接計算TP。

表2 血清學檢測結果Table 2 Serological test results

2.4 風險因素

2.4.1 單因素分析 對79個場點進行流行病學問卷調查,問卷回收率100%。將問卷中的風險因素轉換為二分類變量,經關聯強度測量和相關性檢驗篩選出3個具有統計學意義的因素(P<0.05),分別為“是否中大規模場點”“場內是否建立免疫程序”“病羊是否采取隔離、治療”(表3)。

表3 羊傳染性胸膜肺炎傳播風險單因素分析Table 3 Univariate analysis of the transmission risk of contagious pleuropneumonia in sheep

2.4.2 多因素分析 考慮到所調查的風險因素個數較多,篩選條件予以放寬,在此將單因素回歸0.05≤P<0.2的3個因素(“車輛及物料入場是否消毒”“是否定期驅蟲”“經濟人是否允許進入生產區”)和單因素分析所篩選的P<0.05的3個風險因素(“是否中大規模場點”“病羊是否采取隔離、治療”“場內是否建立免疫程序”)進行多因素Logistic回歸;Hosmer-Lemeshow檢驗顯示,回歸模型擬合度較好(P>0.05)。回歸結果顯示,“是否中大規模場點”和“病羊是否采取隔離、治療”在陽性場與陰性場之間差異顯著(P<0.05),是CCPP傳播的主要風險因素,回歸方程為Logit(P)=-2.580+1.466X1+2.357X2(表4)。繪制ROC曲線,曲線下面積為0.822(95%CI:0.694～0.950)(圖2),表明回歸模型預測性能符合預期。

表4 Logistic回歸結果Table 4 Logistic regression results

圖2 Logistic 回歸模型預測概率的ROC曲線Fig.2 ROC curve of Logistic regression model predicting probabilities

3 討論

CCPP是一種高度傳染性呼吸道疾病,該病出現在全球40多個國家,尤其是非洲、亞洲和中東。本調查通過概率抽樣方法掌握了CCPP的HSP并研究傳播風險因素。病例定義中,將陽性群定義為群內至少有4只山羊確診為陽性個體,降低了假陽性出現的概率。通過橫斷面調查發現,西安市閻良區及毗鄰區域該病的HTP為23.41%(14.07%～32.74%)、AP為10.46%(8.81%～12.31%),對所檢出的129個陽性樣本進行背景調查,絕大多數山羊未出現典型的癥狀,說明CCPP在該區域存在一定的流行,但處于溫和感染狀態或非急性型感染。閻良區的HTP和AP在3個區中較低,這是由于該區近3年來對轄區內所有羊只逐年開展一遍布魯氏菌病血清學檢測[6],在調查和采樣期間也對CCPP等羊只主要傳染病予以發現和防控。由于CCPP為非強制免疫病種,該疫苗在區域內的實際接種率較低且主要用于緊急免疫。李勝等[7]對新疆伊犁地區規模羊場綿羊CCPP的免疫效果進行研究,免疫1次山羊支原體肺炎滅活疫苗的山羊感染CCPP情況較免疫前降低了8.3%。因此,建議本調查區域內風險較高的場點可采用山羊支原體肺炎滅活疫苗預防。單因素風險分析結果顯示,“中大規模場點”“場內未建立免疫程序”“病羊未采取隔離、治療”共3個因素存在顯著差異,初步提示與CCPP傳播具有關聯;進一步將單因素分析0.05≤P<0.2的變量納入多因素分析,是考慮到一些變量雖然經單因素分析P≥0.05,但該變量在多因素回歸中有可能P<0.05,以盡量不漏掉可能的因素。回歸結果顯示,“中大規模場點”“病羊未采取隔離、治療”是CCPP傳播的主要風險因素。“中大規模場點”風險與“散養村場點”風險的比值比為4.33(1.16～16.24),這是由于受感染羊只和羔羊之間的密切接觸對于有效傳播至關重要;群規模越大,病健羊只間接觸的頻次越高[8]。當地飼養模式多為放牧/混養模式,未能做到合理分欄管理;相比小群,大群中各種病原體持續存在并可導致混合感染[9];另外,小群易于管理,有利于快速消除病原體感染。雖然“中大規模場點”作為篩選出的風險因素,但目前調查區域內在鼓勵發展奶山羊產業,飼養規模趨向于集約化,在規模上升的同時要加強生物安全管理水平,減少羊只接觸,特別是減少12月齡以上羊只和幼羊的接觸,降低幼羊潛在風險因素。另外,“病羊未采取隔離、治療”場點風險與“病羊采取隔離、治療”場點 風險的比值比為10.56(2.60～42.97),這與Kipronoh等[9]和Elemo等[10]的研究結果相符,他們注意到CCPP血清學陽性與無法獲得治療之間存在顯著的關聯;這可能由于缺乏治療可導致更多的疾病傳播,病原體會在沒有治療或沒用抗生素的情況下持續較長時間,導致疾病反復發生。Lignereux等[11]進行的沙瞪羚群CCPP傳播動力學研究發現,疫病遠距離傳播盡管實施了生物安全措施,但CCPP可以從一組圍欄傳播到另一組相距達80 m的圍欄。本調查區域CCPP處于溫和發展,臨床難以觀察且出現臨床癥狀的動物得不到有效隔離,導致疫病傳播。養殖場應及時隔離治療或者淘汰患病羊,有條件的場點可開展CCPP檢測凈化。

羊CCPP的流行病學研究較少,在國際上以暴發調查和病原分離研究為主,而關于血清流行率和相關風險因素的報道很少;CCPP在國內確認暴發的報道很少,該病的真實流行情況在很大程度上仍然未知。本調查在國內開展了CCPP橫斷面研究,對掌握區域內該病的分布和傳播風險因素具有重要意義。但本調查還存在一定的局限性,例如所采用ELISA檢測方法的Se和Sp相對不高;所得AP為10.46%,與1.2中設定的預期流行率(20%)有所差距,這可能是由于預期流行率設置的較高導致樣本量較少,從而引起陽性數有所偏差。本調查中未考慮年齡因素,經查閱相關文獻,12月齡以上的羊只CCPP感染率(48.83%)大于6月齡以下的羊只(16.27%)[12];把現飼養規模是否≥30只作為飼養規模變量的界限會導致一定的選擇偏倚;此外,本調查未考慮氣候因素,Fasil等[13]研究結果顯示,血清陽性與季節之間存在的顯著關聯,表明動物的易感性在冬季增加,冬季血清陽性病例(81.39%)多于夏季(18.6%),尤其是從10月末到次年3月。此外,本調查的問卷設計還需要完善,調查員可能會誤報或瞞報,導致回憶偏倚和選擇偏倚。