紅螯螯蝦源布氏檸檬酸桿菌分離鑒定和耐藥性分析

黃亞明,李長樂,覃詩君,陸 唯,張博洲,孫佳藝,張文旗,童 潼,張 琴

(廣西民族大學海洋與生物技術學院 廣西多糖材料與改性重點實驗室 廣西海洋微生物資源產業化工程技術研究中心,廣西 南寧 530006)

布氏檸檬酸桿菌(Citrobacterbraakii)屬于檸檬桿菌屬,為人和動物體內常見菌群,是一種條件性致病菌。在機體免疫力降低時,布氏檸檬酸桿菌可以感染包括人在內的多種生物,常引起患者嘔吐、腹瀉和高燒,嚴重者會引起膽囊炎或者急性腹膜炎[1-4]。患病蝦類則出現活動力差、螯足無力、食欲下降和應激遲緩,并伴有頭甲下大量腹水和肝胰腺腫大等[5-6]。近年來,人類感染布氏檸檬酸桿菌的相關報道越來越多[7-9],但罕見從紅螯螯蝦中分離到布氏檸檬酸桿菌的相關報道。本試驗于2021年1月,自紅螯螯蝦腸道內分離獲得形態大小一致的菌落,采用形態學觀察、生化鑒定、16S rDNA 測序和系統進化分析對分離菌株進行鑒定,通過人工感染斑馬魚確定其致病性,以Kirby-Bauer (K-B) 紙片擴散法進行藥物敏感性試驗確定其耐藥性,以期為紅螯螯蝦布氏檸檬酸桿菌感染的診斷和治療提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 病原材料來源 廣西壯族自治區南寧市吳圩鎮紅螯螯蝦養殖場內活動力差、螯足無力、食欲下降的紅螯螯蝦(采樣地點東經108.152 45°、北緯22.584 52°)。

1.2 主要試劑 硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS瓊脂培養基)、LB液體培養基和MH液體培養基,均購自青島海博生物技術有限公司;細菌總DNA提取試劑盒和PCR擴增試劑盒,均購自北京康潤誠業生物科技有限公司;16S rDNA通用引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;微量生化鑒定管,購自杭州微生物試劑有限公司;藥敏紙片,購自常德比克曼生物有限公司。

1.3 主要儀器 振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司;生物顯微鏡,麥克奧迪實業集團有限公司;臺式高速冷凍離心機,湘潭湘儀儀器有限公司;聚合酶鏈反應核酸擴增儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;紫外可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司。

1.4 細菌的分離和純化 在無菌環境下操作,先用生理鹽水沖洗紅螯螯蝦體表,再用乙醇擦拭,對紅螯螯蝦進行檢剖。取紅螯螯蝦腸道內容物至裝有少量0.9% 生理鹽水的無菌EP管中,將腸道內容物進行10倍梯度稀釋,取10 μL各梯度稀釋液,用涂布器均勻涂于TCBS瓊脂培養基上,于30 ℃恒溫倒置培養24 h。根據菌落形態挑取優勢單菌落進行純化培養,經2次以上純化培養,挑取單菌落接種于LB液體培養基,于36 ℃過夜培養,將菌液和甘油按2∶1體積比混勻,-80 ℃保存備用[10]。

1.5 細菌的鑒定 菌落形態觀察:取純化后的分離菌株劃線接種于TCBS瓊脂培養基,于36 ℃靜置培養12 h,觀察并記錄單菌落的形狀、大小、邊緣、表面和隆起形狀等表型特征。純化后的單菌落經LB液體培養基擴大培養后進行革蘭染色,置于光學顯微鏡下觀察分離菌株的染色特征。

生化鑒定:取純化后的分離菌株于0.9%生理鹽水中稀釋,至0.5麥氏比濁度的菌懸液,取10 μL菌懸液加至微量生化鑒定管中,并按照說明書操作進行生化鑒定。

16S rDNA鑒定:使用細菌總DNA提取試劑盒提取純化后分離菌株的總DNA,以16S rDNA通用引物27 F和1492 R進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)鑒定。PCR陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將序列上傳至NCBI進行Blast比對分析,通過MEGA X 軟件以最大似然法(Maximum likelihood method,ML)構建系統進化樹。

菌株生長曲線:取純化后的分離菌株至LB液體培養基中,于36 ℃培養,每隔1 h取適量菌液,于600 nm處使用分光光度計檢測光密度(Optical density,OD)值,連續檢測38 h,并以時間為橫坐標,OD600 nm值為縱坐標,繪制生長曲線。

1.6 人工感染斑馬魚試驗 試驗所用斑馬魚購自杭州環特生物科技股份有限公司[生產許可證號:SCXK(浙)2022—0003]。試驗在廣西民族大學智能水產養殖室進行,在正式試驗開始前,先將斑馬魚在1.0 m×0.8 m×0.4 m的養殖水箱中馴養14 d,以適應試驗飼料和養殖環境。馴養結束后,取40尾體長(3.4±0.2)cm,體質量為(0.51±0.1)g的健康斑馬魚,隨機分為4個組:1.5×108CFU/mL組、0.75×108CFU/mL組、1.5×107CFU/mL組和陰性對照組(前3個組統稱為試驗組),每組10尾。1.5×108CFU/mL組處理方式:將分離菌株的單菌落轉接至MH液體培養基,于37 ℃培養12 h,以麥氏比濁法稀釋至濃度為1.5×108CFU/mL的菌懸液,取1 mL菌懸液用冷凍離心機于5 000 r/min離心2 min,棄上清,用0.9%生理鹽水洗滌沉淀1～2次,重復離心操作1～2次,最后加入50 μL 0.9%生理鹽水,以50 μL的劑量對斑馬魚進行腹腔注射。0.75×108CFU/mL組和1.5×107CFU/mL組參考1.5×108CFU/mL組制備不同濃度的菌懸液,陰性對照組注射50 μL無菌0.9%生理鹽水,連續觀察7 d,期間每天觀察記錄斑馬魚的癥狀和死亡情況,并對死亡的斑馬魚進行檢剖以及病原菌的分離和鑒定[11]。

1.7 細菌耐藥性試驗 采用K-B紙片擴散法檢測分離菌株對25種抗菌藥物的敏感性,判定標準依據美國臨床和實驗室標準研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 發布的標準[12],以抑菌圈直接大小作為敏感中介和耐藥的判定標準,每個試驗進行3次平行。

2 結果

2.1 細菌的鑒定 菌落形態觀察:將純化后的分離菌株接種于TCBS瓊脂培養基,單菌落呈現不規則、不透明、表面有光澤、亮黃色,并呈現向外圍擴散的生長趨勢(圖1A)。分離菌株革蘭染色為紅色短桿狀(圖1B),將此株優勢菌命名為171215-10。

圖1 分離菌株的菌落形態(A)和革蘭染色(100×)觀察(B)Fig.1 Colony morphology (A) and Gram staining (100×) observation (B) of the isolated strain

生化鑒定:根據分離菌株171215-10的生化鑒定試驗結果(表1),結合《伯杰細菌鑒定手冊》[13]和Brenner等[14]的研究,鑒定該菌株為布氏檸檬酸桿菌。

表1 分離菌株171215-10的生化鑒定Table 1 Biochemical identication of the isolated strain 171215-10

16S rDNA鑒定:對分離菌株171215-10 的16S rDNA基因進行PCR擴增和測序,并基于16S rDNA序列構建系統進化樹,結果顯示,分離株171215-10與布氏檸檬酸桿菌聚為一支(圖2)。

圖2 基于16S rDNA序列相似性構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences similarity▲:本試驗獲得分離株▲:The isolate obtained in this study

菌株生長曲線:如圖3 所示,分離菌株171215-10在0～5 h處于延滯期,5～16 h處于對數快速生長期,16～30 h處于穩定期,30 h后開始進入衰亡期。

圖3 分離菌株171215-10的生長曲線Fig.3 Growth curve of the isolated strain 171215-10

2.2 人工感染斑馬魚試驗 結果如圖4所示,1.5×108CFU/mL組斑馬魚在注射菌懸液后2 h開始出現死亡,至第2天時全部死亡,累計存活率為0%;0.75×108CFU/mL組斑馬魚在注射菌懸液后第5天不再死亡,累計存活率為30%;1.5×107CFU/mL組斑馬魚在注射菌懸液后第3天不再死亡,累計存活率為40%;陰性對照組第2天不再死亡,累計存活率為90%;分別從陰性對照組和各試驗組死亡的斑馬魚體內分離得到菌株,經細菌鑒定,除陰性對照組外,其余各試驗組菌株與注射菌株171215-10一致。

圖4 斑馬魚感染試驗結果Fig.4 Results of zebrafish infection experiment

2.3 細菌耐藥性試驗 結果如表2所示,分離菌株對β-內酰胺類抗菌藥苯唑西林、哌拉西林、頭孢唑林、頭孢哌酮和頭孢他啶耐藥,對頭孢曲松中介;對碳青霉烯類抗菌藥亞胺培南耐藥;對喹諾酮類抗菌藥諾氟沙星敏感,對氧氟沙星和環丙沙星中介;對酰氨醇類抗菌藥氯霉素敏感,對氟苯尼考中介;對多肽類抗菌藥萬古霉素耐藥,對多黏菌素B中介;對磺胺類抗菌藥復方新諾明耐藥;對林可霉素類抗菌藥克林霉素和林可霉素耐藥;對四環素類抗菌藥四環素耐藥,對米諾環素中介,對多西環素敏感;對大環內酯類抗菌藥紅霉素耐藥;對氨基糖苷類抗菌藥卡那霉素耐藥,對鏈霉素中介,對阿米卡星和慶大霉素敏感。

表2 分離菌株171215-10的耐藥性分析Table 2 Drug resistance analysis of the isolated strain 171215-10

3 討論

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)又名澳洲淡水龍蝦,因其肉質細膩、味道鮮美被廣泛傳播到世界各地[15-17],我國于1992年首次將其引進湖北省試養,并逐漸向全國推廣[18]。紅螯螯蝦的商業需求不斷增長,但養殖產量卻不見增加,這主要是由于種苗培育技術和病害防治等方面的研究不夠深入,同時這也成為紅螯螯蝦養殖可持續發展的技術瓶頸。本試驗從紅螯螯蝦腸道內分離到革蘭陰性菌株171215-10,其生化特征與Brenner等[14]發現的布氏檸檬酸桿菌基本吻合,可初步鑒定該菌株為布氏檸檬酸桿菌。采用16S rDNA序列進行同源性比較,經系統進化樹分析,分離菌株171215-10與Citrobacterbraakii聚為一支,因此可將菌株171215-10鑒定為布氏檸檬酸桿菌(Citrobacterbraakii)。人工感染斑馬魚試驗結果顯示,該分離菌株具有較強的致病性,1.5×108CFU/mL組可致斑馬魚在2 d內100%死亡,累計存活率為0%,且人工感染斑馬魚分離得到的細菌與原感染菌的形態和生化特征一致。

布氏檸檬酸桿菌最早由Brenner等[14]鑒定,為檸檬酸桿菌屬中的條件性致病菌。當有基礎性疾病的患者同時感染布氏檸檬酸桿菌時,通常治療難度會增加。Tollkuci等[19]研究發現,1名造血干細胞移植患者因發生了布氏檸檬酸桿菌引起的血液感染(Centralline-associated blood stream infection,CLABSI)。Seo等[20]報道顯示,1名白血病患者因感染布氏檸檬酸桿菌而引起休克。Oyeka等[21]報告了1名多病癥患者因感染布氏檸檬酸桿菌而出現組織炎和胸腔積液癥狀,最終治療無效而死亡。此外,研究人員已從多種水生生物中分離鑒定出布氏檸檬酸桿菌,如鯰魚(Ictaluruspunctatus)[22]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[23]、彩虹魚(MelanotaeniaPraecox)[24]、鮐魚(Pneumatophorusjaponicus)[25]和青魚(Mylopharyngodonpiceus)[26]等。而本試驗從紅螯螯蝦腸道內分離出布氏檸檬酸桿菌,這在此前的研究中尚未發現。布氏檸檬酸桿菌為人獸共患病原菌,嚴重感染時可致宿主死亡,應引起重視。

本藥物敏感試驗結果顯示,布氏檸檬酸桿菌171215-10 僅對25種抗菌藥中的5種藥物敏感,包括諾氟沙星、氯霉素、多西環素、阿米卡星和慶大霉素。不同魚體內分離得到的布氏檸檬酸桿菌對抗菌藥的耐藥性不同,可能與宿主來源和環境差異有關。此外,本藥敏試驗結果顯示,布氏檸檬酸桿菌171215-10對碳青霉烯類抗菌藥高度耐藥,這一發現在布氏檸檬酸桿菌的研究中已多次被驗證,Yao等[27]的研究檢測出10株布氏檸檬酸桿菌有碳青霉烯耐藥基因KPC-2,Dong等[28]首次對產KPC-2碳青霉烯酶布氏檸檬酸桿菌進行質粒回收,這些報道均表明布氏檸檬酸桿菌有可能成為環境中碳青霉烯類抗菌藥耐藥性的潛在傳播者。多黏菌素B是對抗產生碳青霉烯酶的多重耐藥性革蘭陰性菌的重要抗菌藥[29-30],本藥物敏感試驗結果中,多黏菌素B對布氏檸檬酸桿菌171215-10為中介。此外,據農業農村部公告《水產養殖用藥明白紙》[31]顯示,在水產養殖中已禁止使用諾氟沙星和氯霉素,本試驗中對布氏檸檬酸桿菌171215-10敏感的防控藥物也將越來越少。因此,在水產動物病害防治中應及時進行病原分離和藥敏試驗,以科學且有針對性地進行治療。