Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞糖代謝和自噬的影響

玉斯日古楞,白兆星,羅雨晨,么宏強(qiáng)

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ; 2. 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

Nesfatin-1是Oh-I等[1]于2006年首先發(fā)現(xiàn)的食欲抑制因子,其氨基酸序列在不同物種間有高度保守性[2]。Nesfatin-1不僅通過中樞和外周分泌的方式對(duì)機(jī)體的血糖穩(wěn)態(tài)和胰島素分泌進(jìn)行刺激,還可以抑制食欲和脂肪細(xì)胞分化,起到對(duì)糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用[3]。因此,近年來,越來越多的研究證明,Nesfatin-1作為一種新的能量調(diào)節(jié)肽,對(duì)糖尿病和肥胖等具有潛在的治療作用[4],但其作用機(jī)理仍有待于明晰。

雙峰駝經(jīng)過長(zhǎng)期的演變,具備了很多獨(dú)特的生物學(xué)特性。在惡劣的環(huán)境中可以長(zhǎng)時(shí)間不飲水和進(jìn)食,其駝峰中沉積大量的脂肪,且其血糖水平比其他反芻動(dòng)物高2倍多[5],但它們不會(huì)因此發(fā)生代謝性疾病或顯示相關(guān)的病理學(xué)特征。有報(bào)道稱,Nesfatin-1可參與改善機(jī)體胰島素靶器官對(duì)胰島素的敏感性,糾正血糖和血脂異常,從而改善糖尿病及其并發(fā)癥[6]。在前期的研究工作中,本課題組通過抗原表位分析和多肽合成方式,成功制備雙峰駝Nesfatin-1抗體,并分析雙峰駝體內(nèi)Nesfatin-1的分布表達(dá)情況。本試驗(yàn)試圖通過模擬雙峰駝高糖環(huán)境,探究Nesfatin-1對(duì)脂肪細(xì)胞糖代謝和自噬的影響,以期明確Nesfatin-1改善糖脂代謝的功能是否與自噬有關(guān),為研究糖尿病的發(fā)生發(fā)展和防治措施提供新的思路。

自噬(Autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的降解途徑,可降解細(xì)胞質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白、受損細(xì)胞器和脂質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)[7],是細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激的一種自我保護(hù)機(jī)制。饑餓、缺氧和寒冷等因素均可引發(fā)自噬[8]。自噬在脂肪細(xì)胞的分化過程中起著重要的作用,但是目前對(duì)于脂肪細(xì)胞分化過程中自噬的發(fā)生發(fā)展及其功能的研究還相對(duì)匱乏。Nesfatin-1改善脂肪代謝的作用,是否與細(xì)胞自噬存在一定的關(guān)系,目前尚無定論。因此,本試驗(yàn)主要探討Nesfatin-1對(duì)高糖狀態(tài)下3T3-L1脂肪細(xì)胞代謝的影響,并進(jìn)一步分析其對(duì)脂肪細(xì)胞自噬過程的影響,以期為Nesfatin-1的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清,均購自Gibco公司;高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,購自HyClone公司;胰島素、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、地塞米松(Dexamethasone,DEX)和油紅O染色試劑,均購自Sigma公司;Nesfatin-1,購自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司;非放射性葡萄糖吸收檢測(cè)試劑盒,購自Promega公司;丙酮酸含量檢測(cè)試劑盒、己糖激酶活性檢測(cè)試劑盒和磷酸果糖激酶活性檢測(cè)試劑盒,均購自北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒,購自Axygen Scientific公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒,均購自TaKaRa公司;LC3和p62抗體,均購自Abcam公司;PCR引物均合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器 恒溫CO2培養(yǎng)箱,Thermo-fisher公司產(chǎn)品;多功能酶標(biāo)儀,BioTek公司產(chǎn)品;TU-1901雙光束紫外可見分光光度儀,北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品;CFX96 熒光定量?jī)x,Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞 小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞(3T3-L1細(xì)胞株),購自上海青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 3T3-L1細(xì)胞株置于含10%胎牛血清、50 g/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);在細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度為70%～80%時(shí),用含0.01% EDTA、0.25%胰蛋白酶的消化液消化,進(jìn)行傳代。3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞融合后2 d開始進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)液(1.67 μmol/L 胰島素、1 μmol/L DEX和0.5 mmol/L IBMX),培養(yǎng)48 h,換只含1.67 μmol/L胰島素的全培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h,隨后以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞成熟。在培養(yǎng)6～8 d后如觀察到90%以上的細(xì)胞變圓并有大量脂滴出現(xiàn),則表明3T3-L1前脂肪細(xì)胞已被誘導(dǎo)成為成熟的脂肪細(xì)胞。

1.4.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞的油紅O染色鑒定 吸棄誘導(dǎo)細(xì)胞的上清液,6孔板中的細(xì)胞每孔加入2 mL PBS緩沖液,輕柔漂洗3次。將6 孔板倒扣于濾紙上,靜置5 min晾干,加入現(xiàn)用現(xiàn)配的10%多聚甲醛固定1 h。吸棄多聚甲醛溶液,使用PBS緩沖液輕柔漂洗,室溫晾干,每孔加入0.5 mL油紅O染色試劑,室溫避光染色1 h,吸棄6孔板中的油紅O染色液,使用PBS緩沖液輕柔漂洗3次,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形態(tài)。油紅O是脂肪特異性染色劑,能與脂肪結(jié)合,使脂肪細(xì)胞中的脂滴著色,因此常用來染色分化成熟的脂肪細(xì)胞,以觀察脂肪細(xì)胞中脂肪的含量。

1.4.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取水平的測(cè)定 葡萄糖是維持細(xì)胞代謝和生命活動(dòng)的重要原料,細(xì)胞通過攝取葡萄糖為機(jī)體活動(dòng)提供能量。將3T3-L1脂肪細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,試驗(yàn)過程中均使用高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。參照參考文獻(xiàn)[9]的方法,試驗(yàn)組細(xì)胞以100 nmol Nesfatin-1干預(yù)1 h,對(duì)照組細(xì)胞使用等量生理鹽水進(jìn)行處理。按照非放射性葡萄糖吸收檢測(cè)試劑盒說明書操作,每孔加入1 000 μL 1 mmol 2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2DG),室溫孵育10 min;依次加入500 μL終止緩沖液和25 μL中和緩沖液,搖晃;加入100 μL 2-DG-6-磷酸(2-deoxyglucose-6-phosphate,2-DG6P),在室溫孵育1 h,采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)葡萄糖攝取水平。

1.4.4 3T3-L1脂肪細(xì)胞丙酮酸含量的測(cè)定 丙酮酸是糖代謝中具有關(guān)鍵作用的中間代謝物,是所有生物細(xì)胞糖代謝和體內(nèi)多種物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的重要中間體。在測(cè)定樣品的丙酮酸含量之前,首先使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,再分析樣品中丙酮酸的含量。通過Nesfatin-1干預(yù)后,對(duì)照組和試驗(yàn)組3T3-L1脂肪細(xì)胞離心后去上清,按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè))∶提取液體積(mL)為500～1 000∶1的比例加入提取液,超聲波破碎(超聲3 s,間隔10 s,重復(fù)30 次),靜置30 min,8 000 g離心10 min,取上清即為待測(cè)樣本。根據(jù)丙酮酸含量檢測(cè)試劑盒說明書,將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25和0 μg/mL。在96 孔板中加入75 μL標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣本和25 μL試劑I,混勻,靜置2 min,加入125 μL試劑II,混勻,于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(Optical density,OD)值。

1.4.5 3T3-L1脂肪細(xì)胞己糖激酶和磷酸果糖激酶活性的測(cè)定 己糖激酶在細(xì)胞葡萄糖代謝中起重要作用,是催化葡萄糖代謝的第一個(gè)必需步驟,用于催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖,能影響細(xì)胞內(nèi)葡萄糖通量的程度和方向。磷酸果糖激酶是一類催化不可逆反應(yīng)的激酶,可將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖二磷酸和ADP。所以己糖激酶和磷酸果糖激酶的活性對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的糖代謝起著至關(guān)重要的作用。

參照1.4.4所描述的方法,將超聲波處理后的細(xì)胞離心取上清待測(cè)。按照己糖激酶和磷酸果糖激酶活性檢測(cè)試劑盒說明書操作,在96 孔板中分別加入180 μL和170 μL試劑II、10 μL試劑III和10 μL試劑IV、10 μL樣本,混勻,立即記錄340 nm處20 s時(shí)的OD值,檢測(cè)后將96孔板放入37 ℃恒溫箱中反應(yīng)5 min,再記錄340 nm處20 s時(shí)的OD值。

1.4.6 3T3-L1脂肪細(xì)胞總RNA的提取和cDNA的合成 收集細(xì)胞,按照RNA提取試劑盒說明書操作提取3T3-L1脂肪細(xì)胞總RNA,純化后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,并用分光光度儀測(cè)定其濃度和純度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到相應(yīng)的cDNA,并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3T3-L1脂肪細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成自噬相關(guān)基因引物(引物序列見表1),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)微管相關(guān)輕鏈蛋白(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、Beclin-1(也稱BECN1基因)和p62(Sequestosome 1,自噬選擇性底物)蛋白的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析,以α-微管蛋白(α-tubulin)作為內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(25 μL):SYBR 12.5 μL,上、下游引物各1 μL(10 pmol/μL),cDNA模板2 μL,無RNA酶的去離子水8.5 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸60 s,45個(gè)循環(huán)。

表1 引物信息Table 1 Primer details

1.4.8 Western blot檢測(cè)3T3-L1脂肪細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 為探索Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞自噬的影響,參照1.4.4所描述的方法,將收集的細(xì)胞中加入PIPA裂解液,提取其總蛋白。運(yùn)用BCA法測(cè)定蛋白濃度后,以α-tubulin為內(nèi)參,采用Western blot檢測(cè)LC3-II和p62蛋白的表達(dá)。使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值,統(tǒng)計(jì)分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示。熒光定量PCR結(jié)果數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和油紅O染色鑒定 光學(xué)顯微鏡下觀察,3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似,呈長(zhǎng)梭型,細(xì)胞內(nèi)沒有脂肪積聚,油紅O染色后細(xì)胞不著色(圖1)。誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞形態(tài)變圓,胞漿出現(xiàn)脂滴,隨著分化程度的加深,脂滴積聚增多。誘導(dǎo)分化8 d后,90%以上的細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型,胞漿中積聚大量脂滴,油紅O染色后著色(圖2)。

圖1 前脂肪細(xì)胞顯微鏡觀察(40×)Fig.1 Microscopic observation of preadipocytes (40×)

圖2 油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞(40×)Fig.2 Oil red O staining for adipocyte observation(40×)

2.2 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取水平的影響 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,通過Nesfatin-1干預(yù)后,試驗(yàn)組脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取水平極顯著降低(P<0.01)(圖3),表明3T3-L1脂肪細(xì)胞的糖消耗量明顯降低。

圖3 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取水平的影響Fig.3 Effects of nesfatin-1 on glucose uptake levels in 3T3-L1 adipocytes與對(duì)照組比較,*:P<0.05,差異顯著; **:P<0.01,差異極顯著; ***:P<0.001,差異非常顯著;下同Compared with the control group,*:P<0.05,significant difference; **:P<0.01,very significant difference; ***:P<0.001,extremely significant difference. The same as below

2.3 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞丙酮酸含量的影響 結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)品的丙酮酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.025 7x+0.081 9,R2=0.999 7,符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(圖4)。對(duì)照組與試驗(yàn)組3T3-L1脂肪細(xì)胞的丙酮酸含量沒有顯著差異(P>0.05)(圖5)。

圖4 丙酮酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of pyruvate content

圖5 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞丙酮酸含量的影響Fig.5 Effects of nesfatin-1 on pyruvate contents of 3T3-L1 adipocytes

2.4 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞己糖激酶和磷酸果糖激酶活性的影響 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組3T3-L1脂肪細(xì)胞的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性非常顯著地降低(P<0.001)(圖6)。

圖6 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞己糖激酶(A)和磷酸果糖激酶(B)活性的影響Fig.6 Effects of nesfatin-1 on hexokinase (A) and phosphofructokinase (B) activities of 3T3-L1 adipocytes

2.5 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞自噬相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,以Nesfatin-1干預(yù)后,試驗(yàn)組3T3-L1脂肪細(xì)胞LC3和Beclin-1 mRNA表達(dá)量并沒有顯著改變(P>0.05),但p62 mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)(圖7)。

圖7 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞LC3(A)、Beclin-1(B)和p62(C) mRNA表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of nesfatin-1 on the mRNA expression levels of LC3(A),Beclin-1(B) and p62(C) in 3T3-L1 adipocytes

2.6 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞LC3-II和p62蛋白表達(dá)量的影響 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組3T3-L1脂肪細(xì)胞的LC3-II蛋白表達(dá)量無顯著差異(P>0.05),而p62蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)(圖8)。

圖8 Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞LC3-II和p62蛋白表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of nesfatin-1 on the protein expression levels of LC3-II and p62 in 3T3-L1 adipocytesA:Western blot結(jié)果(1:對(duì)照組; 2:試驗(yàn)組); B:LC3-II蛋白表達(dá)量的檢測(cè); C:p62蛋白表達(dá)量的檢測(cè)A:Western blot results (1:Control group; 2:Experimental group); B:Expression level of LC3-II protein; C:Expression level of p62 protein

3 討論

3T3-L1前脂肪細(xì)胞作為一種成熟的細(xì)胞系,具有一定分化能力,通過特定誘導(dǎo)液的誘導(dǎo),可以將其誘導(dǎo)為成熟的脂肪細(xì)胞。因此,在脂肪細(xì)胞的研究中常將3T3-L1前脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象。本試驗(yàn)通過誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化,并在細(xì)胞分化后,以Nesfatin-1進(jìn)行干預(yù),探討在高糖狀態(tài)下Nesfatin-1對(duì)脂肪細(xì)胞糖代謝和自噬的影響。

前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞后,有2個(gè)主要特征:一是細(xì)胞形態(tài)的變化,由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形;二是成熟脂肪細(xì)胞開始合成甘油三酯,以脂滴的形式儲(chǔ)存在胞質(zhì)內(nèi),并且脂滴的數(shù)量和大小能夠間接反映脂肪細(xì)胞的分化程度[10]。在本試驗(yàn)中,誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化后,細(xì)胞形態(tài)變化符合以上描述,表明誘導(dǎo)細(xì)胞分化成功,油紅O染色結(jié)果也提示誘導(dǎo)細(xì)胞分化成功。

Nesfatin-1是一種新型飽腹因子,經(jīng)側(cè)腦室注射可呈現(xiàn)攝食行為抑制,并可控制體重增長(zhǎng),由此將其命名為Nesfatin (減肥之意),并將其歸為厭食肽[11],它的氨基酸序列在不同物種間有高度的保守性[2]。Nesfatin-1廣泛地分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中,尤其在下丘腦、垂體、肝臟和脂肪組織中大量表達(dá)?，F(xiàn)已證實(shí),Nesfatin-1參與脂肪代謝、攝食、睡眠、生殖、胃功能、心血管以及血糖等多種生理和病理過程的調(diào)控[12],但目前其在脂肪細(xì)胞代謝中的作用和機(jī)制并不十分清楚。本試驗(yàn)試圖探究在高糖狀態(tài)下Nesfatin-1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞糖代謝和自噬的影響。

自噬是真核細(xì)胞通過溶酶體途徑,采用“丟卒保車”方式降解細(xì)胞質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白、受損細(xì)胞器和脂質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì),是一種基本的調(diào)控細(xì)胞物質(zhì)代謝(包括糖代謝)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的方式[13-14]。自噬對(duì)機(jī)體糖代謝的變化非常敏感,自噬缺失將導(dǎo)致組織葡萄糖耐受性下降[15]。另有研究發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠肝臟自噬功能的阻斷是造成胰島素抵抗和代謝損傷的重要原因[16];高糖環(huán)境下腎小球足細(xì)胞存在自噬功能紊亂[17];急性高糖條件可誘導(dǎo)自噬,通過自噬清除受損線粒體,恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡[18]。以上結(jié)果均提示,細(xì)胞糖代謝與自噬之間存在密切聯(lián)系。此外,Tao等[8]研究發(fā)現(xiàn),在3T3-L1 前脂肪細(xì)胞白色成脂分化過程中,Beclin-1 表達(dá)顯著上調(diào),表明自噬在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。那么,Nesfatin-1的脂肪代謝調(diào)節(jié)作用與脂肪細(xì)胞的自噬過程是否有關(guān)聯(lián)?在高糖應(yīng)激下,Nesfatin-1會(huì)影響脂肪細(xì)胞的自噬嗎?目前尚無定論。

本試驗(yàn)體外誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞后,在高糖狀態(tài)下以Nesfatin-1對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),并檢測(cè)脂肪細(xì)胞的糖代謝和自噬情況。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[9],本試驗(yàn)中均選擇100 nmol Nesfatin-1,時(shí)間點(diǎn)確定為1 h。一般情況下,細(xì)胞糖代謝主要涉及葡萄糖的攝取、糖酵解生成丙酮酸等過程,涉及多種蛋白,如己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶等,最終合成大量ATP,供給細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),通過Nesfatin-1干預(yù)后,高糖狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取水平極顯著降低(P<0.01),同時(shí),細(xì)胞內(nèi)己糖激酶和磷酸果糖激酶活性也非常顯著地減弱(P<0.001)。此結(jié)果表明,Nesfatin-1能夠有效地降低3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)糖的消耗量,其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

同時(shí),細(xì)胞脂質(zhì)和葡萄糖代謝的變化會(huì)影響自噬。研究發(fā)現(xiàn),I型糖尿病病人腦內(nèi)自噬分子LC3的表達(dá)增加[20]。LC3編碼的蛋白是在高等真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第1種自噬體膜蛋白,細(xì)胞內(nèi)存在2種形式的LC3分子(LC3-I和LC3-II),可作為自噬標(biāo)志性分子以監(jiān)測(cè)自噬活動(dòng),反映自噬進(jìn)展,因此被作為自噬體的標(biāo)記分子[21]。Beclin-1是自噬的關(guān)鍵啟動(dòng)子,在自噬早期發(fā)揮重要作用,在細(xì)胞自噬發(fā)生的早期促進(jìn)自噬體膜的形成和擴(kuò)張[22]。p62是一種多功能蛋白,參與自噬等多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控。自噬發(fā)生時(shí),p62蛋白在細(xì)胞質(zhì)中會(huì)不斷被降解;自噬發(fā)生受到阻礙或自噬功能出現(xiàn)缺陷時(shí),p62蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積增多。因此,p62被認(rèn)為是反映自噬活性的標(biāo)記蛋白之一[23]。

在本試驗(yàn)的脂肪細(xì)胞自噬檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組p62 mRNA和蛋白表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01),Beclin-1 mRNA以及LC3 mRNA和蛋白表達(dá)量并沒有顯著性差異(P>0.05)。此結(jié)果表明,Nesfatin-1干預(yù)不僅能降低脂肪細(xì)胞的糖消耗能力,還能上調(diào)脂肪細(xì)胞的自噬水平。因此,Nesfatin-1可能通過上調(diào)自噬水平,降低3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,從而保護(hù)高糖對(duì)脂肪細(xì)胞的損傷,但其機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。在今后研究中,本課題組將從細(xì)胞線粒體指標(biāo)測(cè)定和相關(guān)蛋白表達(dá)量測(cè)定、細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)等方面進(jìn)行相關(guān)探討,以便從多個(gè)方向、多個(gè)角度和多個(gè)水平對(duì)Nesfatin-1對(duì)高糖作用的機(jī)制進(jìn)行更加深入的探究。