2例犬口腔肉瘤的病理學分析

蘇 真,惠天朝,韋方華,徐亞嵩,張舒六,許世軍,吳舊生,師福山,林 琳,王華南

[1. 浙江大學動物醫學中心 教學動物醫院,浙江 杭州 310030 ; 2.浙江大學動物科學學院 動物醫學系 ,浙江 杭州 310030 ; 3.元醫(杭州)科技有限公司 元醫動物醫學診斷實驗室,浙江 杭州 310059]

口腔是犬、貓腫瘤生長的常發部位,據報道,全部犬腫瘤中,口腔部位發病率占6%～7%[1-3],按發病率從高到低,常見的犬口腔腫瘤依次是惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma)和纖維肉瘤(Fibrosarcoma),高發口腔腫瘤多來源于間葉組織[3]。軟組織肉瘤(Soft tissue sarcoma,STS)是間葉組織來源的腫瘤,發病部位包括脂肪、肌肉、神經和神經鞘、血管及其他結締組織,約占所有犬腫瘤的15%,多發于犬的皮膚和皮下組織,在口腔中的發病率較低,每年約為35/100 000[4]。STS代表一組形態相似但病變不同的腫瘤,由于分化程度低,具體種類難以從外觀和細胞形態學上鑒別?？谇粣盒院谏亓?Oral melanoma,OM)在犬口腔腫瘤中占15%～20%,是口腔腫瘤病變和黑色素瘤的最常見形式[3,5],源于口腔黏膜上皮中的神經嵴衍生黑色素細胞的惡性轉化[6],具有一定的遺傳性和年齡好發性[7]。在犬中,OM常見于7～14歲或以上的中老齡犬和體重小于23 kg的小型犬[8-9]。OM雖具有高免疫原性,可以考慮免疫治療等途徑,但由于高轉移傾向和對常規治療的強抵抗力,預后很差,患犬術后1年的存活率僅20%[10],OM幾乎是致命的,因此盡早的診斷和及時的治療至關重要。STS的某些病理形態特征與無色素沉著的黑色素瘤(Amelanotic melanoma)具有極大的相似性,外觀和細胞形態學上難以區分。免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)作為特異性鑒別腫物類型的技術手段在人醫領域已廣泛使用,但在國內的獸醫領域應用較少。若臨床上難以根據蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,H.E.)染色判斷腫瘤具體種類時,可以通過IHC染色進行鑒別診斷,并為腫瘤的靶向治療提供依據。本試驗對犬口腔軟組織肉瘤和惡性黑色素瘤進行鑒別診斷,為犬口腔肉瘤的深入研究和治療提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 1號犬:13歲,雄性,已去勢,口腔右側有一系列腫瘤樣組織。取灰白色不規則組織3塊,其中4.0 cm×3.0 cm×3.0 cm大小的2塊,3.0 cm×1.5 cm×1.0 cm大小的1塊,切面均灰白質韌。2號犬:12歲8個月,雄性,口腔內和頸部皮下淋巴結附近腫大,均經手術切除。取口腔內組織2塊,大小均為4.0 cm×4.0 cm×3.0 cm,1塊切面呈白色和深褐色,質中,質地不均一;1塊切面呈深褐色,質中,質地相對均一。取頸部腫物4塊,大小均為3.5 cm×4.0 cm×2.0 cm,切面呈褐色,質軟,質地不均一。取材后肉眼觀察病變。

1.2 主要試劑 福爾馬林固定液(10%、500 mL),購自泰州思研生物科技有限公司;二甲苯(20220517),購自湖州雙林化學科技有限公司;無水乙醇(2204073606)、95%乙醇(20220326)和75%乙醇(2203134303),均購自安徽安特食品股份有限公司;蘇木精染色液(PH0516)、伊紅染色液(PH0516)、分化液(PH1813)、返藍液(PH1330)和中性樹膠(PH0407),均購自福州飛凈生物科技有限公司;鼠源波形蛋白(Vimentin)抗體(UMAB159)、鼠源細胞角蛋白(Ckp)(廣譜)抗體(AE1/AE3)、鼠源黑色素-A(Melan-A)抗體(A103)、鼠源人類黑色素瘤標記物-45(HMB45)抗體(HMB45)、鼠源人角蛋白抗原決定簇(Cam5.2)抗體(OTT1B12)、鼠源抗上皮細胞膜抗原(EMA)抗體(GP1.4)、鼠源抗α-平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體(UMAB237)、兔源抗中間絲狀體蛋白(Desmin)抗體(OTIR4A8)、兔源抗肌細胞生成素(Myogenin)抗體(EP162)和鈣結合蛋白(S-100)抗體(兔多抗),均購自中杉金橋生物技術有限公司;免疫組織化學試劑盒和DAB顯色液,均購自Leica BIOSYSTEMS。

1.3 主要儀器 載玻片(10127101P-G)和蓋玻片(10212440C),均購自江蘇世泰實驗器材有限公司;脫水機(KD-TS3A)、包埋機(KD-BM.BL)、冷凍臺(KD-BM.BL)、攤片機(KD-P)和病理切片機(KD-P),均購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司;烤片機(GZM-9140MBE)和病理顯微鏡(Motic BA210),均購自浙江洛邦進出口有限公司;病理切片掃描儀(KF-PRO-005),購自寧波江豐生物信息技術有限公司。

1.4 石蠟切片的制作

1.4.1 固定與切片制作 將送檢樣本置于10%福爾馬林固定液中固定24 h后,經過梯度酒精逐級脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片(3 μm)、展片、烘烤,完成切片制作。

1.4.2 脫蠟與水化 將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各10 min進行脫蠟,梯度乙醇(高至低:100%、95%、80%和70%)各2 min水化后,水洗5 min。

1.5 H.E.染色 將石蠟切片放入蘇木精染液中染色5 min后水洗返藍,浸入1%鹽酸乙醇30 s后立即取出水洗,浸入氨水1 min中和酸。水洗后將切片依次放入70%、80%、90%乙醇、100% 無水乙醇Ⅰ和Ⅱ中各1 min,進行脫水透明。浸入伊紅染色液中染色2 min,后用無水乙醇脫水2 min,二甲苯Ⅰ和Ⅱ分別透明3 min和2 min,取出切片,滴加中性樹脂封片,于病理顯微鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學檢測

1.6.1 抗原修復 將1.4.2中脫蠟和水化后的石蠟切片浸入1 000 mL EDTA修復液煮沸2.5～3 min。冷卻后用蒸餾水沖洗數秒,先后浸入3瓶相同PBS緩沖液內5～10 s,取出后,擦干組織周圍殘留液體。

1.6.2 血清封閉 將切片平放入濕盒內,滴加封閉劑,使得封閉劑液體完全覆蓋標本組織,停留10～15 s后,棄去封閉劑,擦干組織周圍殘留液體。

1.6.3 一抗孵育 按比例稀釋一抗,向每個標本滴加一抗(約100 μL),使液體完全覆蓋組織,孵育1 h后清洗,操作同1.6.1。

1.6.4 二抗孵育 向每個標本滴加二抗,使液體完全覆蓋組織,孵育30 min后清洗,操作同1.6.1。

1.6.5 顯色 向每個標本滴加DAB顯色液,反應5 min后清洗,操作同1.6.1。

1.6.6 復染和封片 用蘇木精染色液復染10 s,水洗;再用返藍液染色5～6 s,水洗;經無水乙醇充分脫水后,二甲苯透明濕封,干燥后于病理顯微鏡下觀察組織病變。

2 結果

2.1 眼觀病變 1號犬:口腔右側牙齦腫物呈不規則魚肉樣和圓粒狀分布,患犬的犬齒至臼齒均被其包裹(圖1A)。2號犬:口腔下頜的2塊腫物均呈中等大小(圖1B),位于口腔臼齒附近的腫物表面呈褐白干酪狀,位于口腔前庭右下臼齒到犬齒處的腫物呈紅褐色,質軟(圖1C)。2塊切除得到的新鮮腫物表面均呈光滑鮮粉紅色,有局部無規則形狀的黑色斑紋(圖1B)。頸部腫瘤形似圓球,表面呈鮮粉紅色,粗糙魚肉樣分布(圖1D)。

圖1 2例患犬口腔腫物外觀Fig.1 Appearance of oral masses in two affected dogsA:1號犬口腔腫物; B:2號犬口腔腫塊(左:7.0 cm×5.0 cm×3.0 cm,右:6.0 cm×3.0 cm×3.0 cm); C:2號犬口腔腫物;D:2號犬頸部腫塊(6.5 cm×6.5 cm×3.0 cm)A: Oral mass of Dog 1; B: Oral mass of Dog 2(Left: 7.0 cm×5.0 cm×3.0 cm, Right: 6.0 cm×3.0 cm×3.0 cm); C: Oral mass of Dog 2; D: Neck mass of Dog 2 (6.5 cm×6.5 cm×3.0 cm)

2.2 H.E.染色 低倍鏡視野下,1號犬腫物上皮樣細胞大量分布于黏膜下方,表面有炎癥反應,細胞間散在壞死(圖2A);2號犬大量梭形細胞浸潤脂肪組織(圖2B),侵犯涎腺組織(圖2C),視野中有大面積出血和多處血管密集,大量粉紅色基液和炎性細胞聚集成團,發生凝固性壞死現象(圖2D)。2例患犬切片中皆可見梭形細胞彌漫增生,密部(圖2E)和疏部(圖2F)相間,形成束狀(圖2E)、漩渦狀(圖2G)等多種排列方式。高倍鏡視野下,增生部位細胞具有多形性和異型性(圖2H和2I,圖2H還可見胞核異型性),明顯核仁(圖2H黑色箭頭)和核分裂象(圖2I綠色箭頭),局灶可見黑色素顆粒(圖2H紅色箭頭)或褐色沉積(圖2I黃色箭頭)。

圖2 2例患犬口腔腫物組織的H.E. 染色觀察Fig.2 H.E. staining observation of tissues from oral masses in two affected dogsA:1號犬上皮樣細胞大量分布于黏膜下方,細胞間散在壞死; B:2號犬大量梭形細胞浸潤脂肪組織; C:2號犬大量梭形細胞侵犯涎腺組織; D:2號犬大面積出血,大量粉紅色基質和炎性細胞聚集,凝固性壞死; E:1號犬梭形細胞呈束狀排列,彌漫性增生,排列密集; F:1號犬局部組織細胞排列松散; G:2號犬梭形細胞和卵圓形細胞呈漩渦狀排列,彌漫性增生,排列密集; H:1號犬組織細胞多形性和胞核異型性明顯; I:2號犬組織細胞具有明顯的多形性和異型性(黑色箭頭:核仁明顯; 紅色箭頭:黑色素顆粒; 綠色箭頭:核分裂象; 黃色箭頭:褐色沉積)A: Abundant distribution of epithelioid cells beneath the mucosa in Dog 1, with scattered necrosis between cells; B: Massive infiltration of spindle-shaped cells into adipose tissue in Dog 2; C: Extensive invasion of spindle-shaped cells into salivary gland tissue in Dog 2; D: Extensive bleeding, with abundant pink matrix and inflammatory cell aggregation, coagulative necrosis in Dog 2; E: Bundled arrangement of spindle-shaped cells with diffuse proliferation in Dog 1; F: Loose arrangement of cells in the local tissue of Dog 1; G: Whorled arrangement of spindle-shaped and oval cells with diffuse proliferation in Dog 2; H: Significant pleomorphism and nuclear atypia in tissue cells of Dog 1; I: Pronounced pleomorphism and atypia in tissue cells of Dog 2(Black arrow: Prominent nucleoli; Red arrow: Melanin granules; Green arrow: Mitotic figure; Yellow arrow: Brown deposit)

2.3 免疫組織化學檢測 結果如表1和圖3所示,2例患犬腫瘤都顯示了間葉組織來源的腺體上皮細胞、上皮樣細胞和梭形細胞等各種形態的細胞中Vimentin呈陽性(圖3A和3B),黑色素相關標記HMB45、Melan-A和S-100均呈陰性,肌源性標記Myogenin呈陰性。1號犬的腫物中,SMA僅在局部梭形細胞和血管壁細胞中呈陽性,在大部分增生組織呈陰性(圖3C);Desmin在上皮樣細胞中表達,但不在梭形細胞中表達(圖3D);CKp在表面上皮呈陽性,但在腫瘤細胞呈陰性(圖3E);EMA呈陰性。2號犬檢測標志中,除了Vimentin呈陽性外,其余均呈陰性。

表1 2例口腔肉瘤犬的免疫組織化學分析Table 1 Immunohistochemical analysis of the two cases of oral sarcoma in dogs

圖3 2例患犬口腔腫物組織的免疫組織化學染色觀察Fig.3 Immunohistochemical staining observation of tissues from oral masses in two affected dogsA:1號犬Vimentin檢測; B:2號犬Vimentin檢測; C:1號犬SMA檢測; D:1號犬Desmin檢測; E:1號犬CKp檢測A: Vimentin detection in Dog 1; B: Vimentin detection in Dog 2; C: SMA detection in Dog 1; D: Desmin detection in Dog 1; E: CKp detection in Dog 1

3 討論

STS眼觀像假包膜的肉質腫瘤,邊界不明,手術切除腫物后,常見局部復發,對化學藥物治療和放射治療的反應通常很差[4]。OM具有特征性的黑色素顆粒沉著現象,但需要注意的是,在實際臨床案例中,有近三分之一的OM并無色素沉著,形態特征與高級別肉瘤相近,因此常有漏診發生[1,3,7]。

從眼觀病變角度分析,蔡彤等[8]、張玉仙等[9]和葉明福等[11]觀察到的幾例黑色素瘤形態與本試驗相似,腫物均呈紅褐色,表面有黑色條紋分布。本試驗中2例患犬口腔腫物的病理切片中可見大量梭形細胞增生和局部分布的褐色沉積細胞,因此,首先考慮黑色素瘤的可能性。需要注意的是,在病理組織學層面觀察到的褐色沉積細胞不一定就是黑色素瘤細胞,可能存在正常基底黑色素細胞增生、巨噬細胞吞噬黑色素顆粒和切片制作過程中存在污染等情況。因此,僅根據H.E.染色觀察難下定論。

從組織細胞學角度分析,本試驗2例患犬口腔腫物的病理切片在形態上均具肉瘤的典型特征,即存在組織、細胞和胞核等多個層面的多形性,部分細胞可見核分裂象;梭形細胞彌漫增生,呈束狀或巢狀排列,其間充滿粉紅色黏液基質;組織表面可見潰瘍,顯微鏡下可見炎性細胞聚集;細胞生長沒有明顯邊界;此外,2號犬的H.E.染色切片上可見明顯的浸潤性增長。蔡彤等[8]和張玉仙等[9]觀察到的幾例黑色素瘤中,均有明顯的核分裂象和細胞異型性等特征,與本試驗病例的特征類似。低分化度惡性腫瘤生長較快,短期內可形成明顯的腫塊,并且由于誘導血管形成和營養供應相對不足,易發生壞死和出血等繼發改變。2號犬的腫塊大面積出血,繼發炎癥感染,與腫瘤的惡性增生密切相關。由于OM具有多種細胞形態、組織學類型和間質變化,亦可出現不同程度的促纖維形成、黏液樣變性、炎性細胞浸潤或間質肉芽腫性改變等多種復雜病變[7],在細胞形態學上很難對惡性黑色素瘤與軟組織肉瘤進行鑒別診斷。

從免疫組織化學的角度而言,Vimentin是正常間葉細胞及其來源的腫瘤的特異性標志,在2例患犬口腔腫物切片中Vimentin的陽性表達進一步確認了2例腫瘤均為間葉來源的肉瘤。Cam5.2、CKp和EMA均為上皮來源標記,2例患犬口腔腫物的CKp均呈陰性,基本可排除低分化癌(Poorly differentiated carcinoma)的可能。1號犬的EMA檢測呈陰性和2號犬的Cam5.2檢測呈陰性的結果,進一步排除了腫瘤上皮源性的可能。

惡性黑色素瘤的典型免疫組織化學檢測結果為HMB45、Melan-A、S-100和Vimentin呈陽性[12]。HMB45標記未成熟的黑色素顆粒,靈敏度不高但特異性強;Melan-A是間葉組織來源標記,用于黑色素細胞瘤和轉移性腫瘤的鑒別診斷,具有高敏感度[3];S-100是神經組織來源標記,可在唾液腺和少數間葉組織中呈陽性表達,而切片中只有細胞間質和極少部分的細胞胞質呈弱陽性,不在作為陽性反應部位的細胞核表達,由此可先排除神經鞘瘤(Peripheral nerve sheath tumors)的可能。3種惡性黑色素瘤的常用標志物均不在各自的標記部位表達,基本排除OM的可能性。

世界衛生組織(World Health Organization,WHO)對犬口腔腫瘤的分期標準,可為STS的判定提供依據。2例患犬口腔腫瘤直徑均大于4 cm,沒有淋巴結轉移和遠處轉移現象,屬于第3期[12],惡性程度嚴重。2號犬頸部腫瘤未發現淋巴結構組織,是口腔腫瘤的多結節生長或者普通頸部轉移。肉瘤的區域淋巴結轉移較為罕見,多通過血液途徑轉移,有高達25%的病例報道稱肉瘤通過血液轉移[4];而在OM中,75%的病例存在淋巴結或肺部轉移[2]。

纖維肉瘤由惡性成纖維細胞和產生膠原的混合間質細胞構成,瘤體質地堅實,形狀不規整,邊界不清,可長期生長而不擴散。纖維肉瘤內血管豐富,因而切除和活檢時容易出血[13]。本試驗2例患犬腫瘤外觀和H.E.染色結果與纖維肉瘤的特征接近,但相較于生長緩慢、大多數為良性的纖維肉瘤,本試驗中的腫瘤生長速度快,惡性程度高。

1號犬的口腔腫物切片中,另有SMA和Desmin呈陽性表達,應考慮腫瘤的肌源性。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,SMA)存在于血管壁和各種組織間質中,可在肌成纖維細胞和肌上皮細胞中表達,主要標記平滑肌和肌上皮細胞[14];Desmin是一種肌節間蛋白,也稱為細胞骨架蛋白,主要分布于肌肉細胞膜、肌節間膜和細胞核膜[15]。1號犬SMA免疫組織化學檢測結果顯示,只有部分肌纖維細胞的胞漿呈褐色,說明局部伴肌纖維母細胞分化;Desmin免疫組織化學檢測結果顯示,上皮樣細胞呈陽性表達,而梭形細胞中表達較少。有關平滑肌肉瘤(Leiomyosarcoma)等肌源性腫瘤的研究顯示,當SMA或至少2種肌源性標志物的免疫組織化學結果呈陽性時可納入案例整合分析[16],但要精確推斷是哪種類型的肌源性分化,目前尚未找到最適合的抗體組合[17]。本試驗可以確定1號犬的腫瘤部分來源于肌組織。

綜上,2例患犬口腔腫瘤均屬于STS,其中1號犬為肌源性惡性腫瘤,2號犬為高級別肉瘤。STS因其局部侵襲性和預后局部高復發率,應及時進行局部腫瘤治療,尤其是對于無法完全切除的軟組織肉瘤,術后一般采用放射治療和以阿霉素為基礎的輔助化療[18]。近年來研究表明,在人醫領域發現程序性死亡受體-1(Programmed cell death-1,PD-1)與程序性死亡受體-配體1(Programmed cell death-ligand 1,PD-L1)結合的靶向治療對STS均有一定的療效[19]。本試驗通過實驗室的免疫組織化學方法完成了2例口腔肉瘤的精確診斷,大大提高了臨床病例診斷的科學性,有助于為患寵提供更優的治療方案。同時,在靶向治療和基因療法研究盛行的當下,期待未來免疫組織化學方法能被更多獸醫臨床診斷所使用,為下一步的精準治療提供參考。