基于網絡藥理學和分子對接探討羌活勝濕湯治療頸椎病的作用機制*

王嘉璐 李 熠 王東杰 陳建鋒 陳洪波△

頸椎病(Cervical spondylosis)是指頸椎體及椎間盤由于多種原因導致椎間盤突出、骨贅增生、椎管狹窄等退行性病變的一種臨床綜合征[1]。臨床癥狀較為復雜,通常多表現為疼痛及眩暈等癥狀,國外學者發現,頸椎病還可能通過影響局部脊髓、咽氣道空間等間接導致殘疾、阻塞性睡眠呼吸暫停等嚴重情況[2]。近年來由于電子設備的廣泛使用,頸椎病患者人群年齡已逐步減小,日益受到人們的關注。目前頸椎病治療方法有很多,西醫治療大多通過服用NSAIDs藥物來緩解疼痛,但效果不明顯。中醫治療頸椎病具有辨證論治,一癥一方的優勢。

羌活勝濕湯由羌活、獨活、藁本、防風、甘草、川芎、蔓荊子組成。方中羌活、獨活為君,祛風濕、利關節;防風、藁本為臣,祛風止痛;佐以川芎活血;蔓荊子清利頭目,甘草調和諸藥。臨床使用羌活勝濕湯治療頸椎病具有良好效果,但具體機制尚不明確,本研究從網絡藥理學角度出發探討羌活勝濕湯治療頸椎病的作用機制,為今后的基礎研究和臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 羌活勝濕湯有效活性成分篩選及靶點預測在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)中以“羌活、獨活、藁本、防風、川芎、蔓荊子、甘草”為關鍵詞檢索,根據口服利用度(OB)≥30%,類藥物參數(DL)≥0.18篩選7味中藥的有效活性成分。初步篩選后獲取各中藥成分相關作用靶點,將靶點數據錄入UniProt數據庫對其蛋白名稱規范化。

1.2 頸椎病靶點及藥物治療頸椎病潛在作用靶點預測在人類基因數據庫(Genecards)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)、DisGeNET數據庫以“cervical myelopathy”“cervical spondylosis”“cervical spondylotic radiculopathy”作為檢索詞,獲取頸椎病相關靶點。經Venn 2.1.0 在線平臺獲取藥物和疾病的交集靶點韋恩圖。

1.3 中藥-活性成分-靶點網絡構建將中藥、活性成分、靶點信息整理導入Cytoscape 3.9.1軟件構建網絡圖,進行可視化分析。

1.4 蛋白質相互作用關系網絡(PPI)構建將藥物和疾病的交集靶點導入STRING在線數據庫,設定Organism為“Homosapiens”,建立交集靶點之間的PPI網絡,并通過Cytoscape 3.9.1繪制PPI網絡圖。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析將交集靶點導入Metascape在線數據庫,物種設置為智人(H.sapiens),選擇個性化分析,分別進行GO與 KEGG富集分析,通過微生信平臺將結果可視化。

1.6 分子對接根據PPI分析結果選取疾病核心靶點分別與藥物關鍵成分進行分子對接:從PDB數據庫下載靶點蛋白的3D結構,并使用 PyMOL軟件對蛋白質進行初步處理;在TCMSP數據庫中根據關鍵活性成分Chemical name獲取相應化合物3D結構式,通過AutoDock Vina軟件進行對接并利用PyMOL、R軟件可視化結果。

2 結果

2.1 羌活勝濕湯中藥活性成分及靶點經TCMSP查找共得到169個符合條件的活性成分,刪除無對應靶點的成分,最終得到157個活性成分,其中羌活13個、獨活8個、藁本1個、防風18個、川芎6個、蔓荊子23個、甘草88個。預測得到羌活勝濕湯藥物靶點205個。

2.2 頸椎病靶點及藥物治療頸椎病的潛在作用靶點通過GeneCards、OMIM、DisGeNET數據庫,去重后得到頸椎病相關疾病靶點680個。通過Venn 2.1.0平臺對2組靶點取交集,獲得羌活勝濕湯治療頸椎病的潛在作用靶點55個。見圖1。

圖1 羌活勝濕湯-頸椎病靶點韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-靶點網絡圖分析通過Cytoscape 3.9.1軟件構建“中藥-活性成分-靶點”網絡圖。見圖2。圖中共有353個節點、1850條邊。其中節點代表中藥及其活性成分和靶點,度(Degree)值越高,節點越大,根據Degree值排序可見:化合物中槲皮素(quercetin)連接度最高,預測槲皮素為羌活勝濕湯治療頸椎病的最主要成分;其次為山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。靶點中PTGS2連接度最高,預測其發揮主要作用;其次為AR、NCOA2、SCN5A、GSK3B、 ESR2、PTGS1等。

注:菱形為靶點,方形為藥物,六邊形為活性成分,圓形為藥物共同活性成分;QH:羌活;DH:獨活;CX:川芎;FF:防風;MJZ:蔓荊子;GC:甘草;GB:藁本。圖2 羌活勝濕湯中藥-活性成分-靶點網絡圖

2.4 PPI網絡圖分析通過STRING數據庫獲取羌活勝濕湯治療頸椎病潛在作用靶點的互相作用關系,通過Cytoscape 3.9.1軟件繪制PPI網絡圖。見圖3。圖中共有55個節點、717條邊。根據Degree值排序依次為:蛋白激酶1 (AKT1)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤抑制因子P53(TP53)、白細胞介素-1β(IL-1β)、基質金屬蛋白酶-9(MMP9),缺氧誘導因子1-α(HIF1A)、過氧化氫酶(CAT)、白細胞介素-4(IL-4)、表皮生長因子受體(EGFR),預測其為羌活勝濕湯治療頸椎病的關鍵靶點。

圖3 羌活勝濕湯治療頸椎病PPI網絡圖

2.5 GO與KEGG富集分析結果GO分析得到生物過程(Biological Process,BP)相關條目1041條,主要包括:細胞分化的負調控、細胞對脂質的反應、對脂多糖的反應等生物學過程。細胞組成(Cell Component,CC)相關條目37條,主要與膜筏、膜微區、黏著斑等有關。分子功能(MolecularFunction,MF)相關條目81條,主要涉及細胞因子活性、信號受體激活劑活性、細胞因子受體結合等。見圖4。

圖4 羌活勝濕湯治療頸椎病的GO分析結果

KEGG分析結果顯示,羌活勝濕湯治療頸椎病涉及的信號通路147條,主要信號通路有:癌癥通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)通路、白細胞介素17(Interleukin 17,IL-17) 通路、磷酯酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(Phosphoinositide-3-kinase-serine / threonine kinase,PI3K-Akt)通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路等。見圖5。

圖5 羌活勝濕湯治療頸椎病的KEGG分析結果

2.6 分子對接結果經TCMSP數據庫得到槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、柚皮素3D結構式,PDB數據庫得到AKT1(編號6HHF)、IL-6(編號1ALU) 、TNF(編號5M2J)、TP53(編號2G3R)、IL-1β(編號1L2H) 3D結構式,處理后進行對接,結果顯示結合能均<-5 kcal·mol-1。見圖6。表明以上活性成分與靶點間具有較強結合活性,初步證實了研究預測結果。

圖6 羌活勝濕湯治療頸椎病主要活性成分與關鍵靶點的結合能(kcal·mol-1)

3 討論

中醫認為頸椎病屬“項痹”范疇,其筋骨、肌肉損傷等發病過程與中醫理論中肝主筋、腎主骨、脾主肌肉的思想不謀而合[3]。由于肝腎氣血不足、脾氣虛弱,致使筋骨失其濡養,肌肉失其所充,加之外感風寒濕邪乘虛侵襲,導致頸部經脈痹阻不通,從而引起頸部強直、冷痛麻木等癥狀。

羌活勝濕湯具有祛風除濕、通絡止痛的功效。臨床研究證實羌活勝濕湯治療各類型頸椎病均具有較好療效,如李新偉等[4]發現其能有效緩解頸型頸椎病患者肌肉緊張;張楊立[5]發現其能減緩神經根型頸椎病患者疼痛。此外,藥理學表明方中含有甘草酸、蛇床子素、阿魏酸等生物成分[6],能夠降低軟骨細胞中炎癥因子的水平、抑制破骨細胞的形成和骨吸收,達到抗炎鎮痛以及保護骨質的作用[7]。

本研究從網絡藥理學出發,探討羌活勝濕湯治療頸椎病的作用機制。根據中藥-活性成分-靶點網絡分析結果顯示羌活勝濕湯主要活性成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、柚皮素等,說明其在防治頸椎病的活動中起到了很大作用。研究表明槲皮素能夠調控髓核細胞凋亡進程,減少炎癥因子表達,保護細胞外基質(ECM),防止椎間盤變性[8]。山奈酚、木犀草素均具有抗炎作用,能夠減緩頸椎病引起的神經根性疼痛,并且可通過激活成骨細胞自噬作用來保護骨骼[9]。漢黃芩素能夠影響破骨細胞分化,抑制炎性通路,上調Ⅱ型膠原蛋白表達減輕椎間盤病變。柚皮素可通過巨噬細胞調控炎癥因子表達,進而修復骨骼肌和椎間盤損傷[10]。

根據PPI網絡分析結果顯示羌活勝濕湯治療頸椎病關鍵靶點為AKT1、IL-6、TNF、TP53、IL-1β等。研究表明AKT1參與細胞生長、代謝調節和癌癥等反應,可通過降解ECM影響椎間盤[11]。IL-6、TNF、IL-1β是一類炎癥介質,在基質破壞、細胞增殖與凋亡過程中起重要作用,可通過釋放促炎因子誘導ECM降解,加劇椎間盤退變;還可通過炎癥因子,激活神經膠質細胞引發神經炎癥反應造成機體神經性疼痛[12]。TP53屬于人體抑癌基因的一種,在退化的椎間盤組織中作用于新生血管,加速椎間盤組織退化。

根據GO分析結果推測羌活勝濕湯活性成分主要作用于靶點蛋白的膜筏、膜微區、黏著斑等部位,通過細胞分化的負調控、細胞對脂質、脂多糖、細菌來源的反應影響細胞因子活性、受體結合等過程。KEGG富集分析可推測羌活勝濕湯主要通過TNF、IL-17、PI3K-Akt、MAPK等信號通路治療頸椎病。TNF是引起椎間盤退變的主要炎癥物質,能夠引起椎間盤內分解代謝和合成代謝之間的不平衡,進而導致椎間盤變性、引起頸椎疼痛[13]。IL-17通路可通過激活轉錄因子-κB,誘導相關因子傳導,促進IL-17-NF-κB驅動的促炎和抗微生物基因的表達,引發頸椎病。PI3K-Akt通路能夠影響頸后伸肌細胞自噬、凋亡平衡[14],MAPK通路可介導血清疼痛介質釋放,減輕疼痛反應,二者可通過抑制炎癥反應、影響頸椎間盤軟骨細胞的凋亡水平,抑制髓核細胞凋亡,延緩頸椎間盤退變[15]。由此可見,羌活勝濕湯主要通過影響炎性反應、軟骨細胞與髓核細胞凋亡進程,調控頸椎病的發展。根據分子對接結果表明主要活性成分與關鍵靶點間均具有較強結合活性,初步驗證了研究結果。

綜上所述,羌活勝濕湯通過多成分、多靶點、多通路作用于頸椎病,這為羌活勝濕湯治療頸椎病的基礎和臨床研究提供了新方向,但本研究還存在一定局限性,今后還需深入挖掘和實驗驗證。