胎盤(pán)絨毛跨膜蛋白CD81、Ang與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn)的關(guān)系

張曉英,董小敏,趙盼盼,于芳

(咸陽(yáng)市中心醫(yī)院,1.產(chǎn)科;2.檢驗(yàn)科,陜西 咸陽(yáng) 712000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)指育齡女性連續(xù)發(fā)生兩次及以上的自然流產(chǎn)[1]。臨床中80%以上的自然流產(chǎn)均出現(xiàn)在妊娠12周前,且隨流產(chǎn)次數(shù)的增加RSA再發(fā)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)會(huì)持續(xù)上升,因此需重視RSA女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生[2]。因胎盤(pán)絨毛正常的血管發(fā)育和血管新生是順利妊娠的必要條件,故胎盤(pán)血管發(fā)育不良、內(nèi)皮功能障礙與RSA的關(guān)系受到臨床關(guān)注[3-4]。CD81為四次跨膜蛋白家族成員,已有研究[5]證實(shí)CD81表達(dá)上調(diào)參與子癇的發(fā)生發(fā)展,但其與RSA的關(guān)系則缺少報(bào)道。血管生成素(angiopoietin,Ang)/Tie2體系是胚胎期血管發(fā)生過(guò)程中具有重要作用的血管形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其成員中Ang-1、Ang-2被證實(shí)與不孕、子癇、RSA等女性生殖相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6-7]。此外,早孕期血人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)反映絨毛活性,可促進(jìn)月經(jīng)黃體生長(zhǎng)發(fā)育為妊娠黃體,刺激妊娠黃體產(chǎn)生雌激素,確保妊娠過(guò)程完整[8]。本研究旨在探討胎盤(pán)絨毛跨膜蛋白CD81、Ang水平與RSA女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至2022年6月于咸陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科因RSA行清宮術(shù)的126例患者為研究對(duì)象(RSA組);另選取同期94例正常早孕行人工流產(chǎn)術(shù)的患者為對(duì)照組。RSA組納入標(biāo)準(zhǔn)：存在≥2次無(wú)誘因自然流產(chǎn)史,就診時(shí)經(jīng)超聲確認(rèn)胚胎停育[9];孕周<12周;擬行清宮術(shù);20～40歲;夫婦雙方染色體核型檢測(cè)均正常;對(duì)研究知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)超聲檢查顯示胚胎發(fā)育正常;(2)孕周<12周;(3)20～40歲;(4)因非計(jì)劃妊娠要求終止妊娠,行人工流產(chǎn)術(shù);(5)有≥1次正常妊娠史且無(wú)早產(chǎn)、死產(chǎn)等無(wú)不良孕產(chǎn)史;(6)對(duì)研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)生殖道感染或生殖器官畸形;(2)流產(chǎn)物染色體檢查異常;(3)凝血異常;(4)合并惡性腫瘤;(5)合并免疫系統(tǒng)疾病;(6)合并糖尿病、甲狀腺疾病等代謝性疾病;(7)有精神疾病史。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 方法

1.2.1 資料收集與樣本采集 由專(zhuān)人通過(guò)電子病歷收集患者一般資料,包括年齡、孕周、孕次、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。于手術(shù)當(dāng)日留取兩組患者胎盤(pán)絨毛組織標(biāo)本,分為兩份保存至無(wú)菌凍存管中,液氮保存。于手術(shù)當(dāng)日采集兩組患者血液標(biāo)本2 mL,離心處理留取血清,保存至-20 ℃冰箱待用。

1.2.2 胎盤(pán)絨毛中CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA檢測(cè) RT-qPCR法檢測(cè)。取胎盤(pán)絨毛組織,通過(guò)TRIzol法提取總RNA,再通過(guò)Prime Script RT reagent Kit試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),引物序列：(1)CD81：上游AGTACCTGCTCTTCGTCTTCA,下游GAACATCATGACAGCGCCCA;(2)Ang-1：上游TCCTGAGAGTACGACAGACCA,下游TCTCCGACTTCATGTTTTCCAC;(3)Ang-2：上游GATGGCAGCGTTGATTTTCA,下游ACATGCATCAAACCACCAGC。反應(yīng)條件：(1)CD81：95 ℃預(yù)變性3 min,(94 ℃變性30 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s)30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min;(2)Ang-1：94 ℃預(yù)變性3 min,(94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s)32個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min;(2)Ang-2：94 ℃預(yù)變性3 min,(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s)30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,2-△△Ct法計(jì)算獲得相應(yīng)mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白檢測(cè) Western blot法檢測(cè)。取胎盤(pán)絨毛組織加入蛋白酶裂解液提取蛋白,BCA法測(cè)量總蛋白濃度,計(jì)算50 μg蛋白上樣量;取蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,2 h后轉(zhuǎn)至PVDF膜,PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h,加入CD81、Ang-1、Ang-2一抗,4 ℃孵育過(guò)夜;PVDA膜經(jīng)Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌3次,10 min/次,加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記二抗(CD81稀釋1∶50 000,Ang-1/Ang-2稀釋1∶2 000),37 ℃搖床孵育2 h,封閉液洗膜,ECL顯色照相并分析結(jié)果。

1.2.4 血清HCG檢測(cè) 采用羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)血清HCG水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者的年齡、孕周、孕次及BMI比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA表達(dá)水平比較

RSA組患者胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA表達(dá)水平及Ang-1/Ang-2 mRNA比值均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者胎盤(pán)絨毛中CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA表達(dá)水平比較

2.3 兩組患者胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白表達(dá)及血清HCG水平比較

RSA組患者胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白表達(dá)水平及Ang-1/Ang-2比值均高于對(duì)照組,血清HCG水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白表達(dá)及血清HCG比較

2.4 RSA胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表達(dá)與血清HCG間的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析顯示,RSA胎盤(pán)絨毛CD81 mRNA水平與Ang-1、Ang-2的mRNA水平正相關(guān)(r=0.421,0.465,0.472,P<0.05);RSA胎盤(pán)絨毛CD81蛋白表達(dá)量與Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)量正相關(guān)(r=0.413,0.451,0.463,P<0.05),胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白表達(dá)量均與血清HCG水平無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

2.5 胎盤(pán)絨毛跨膜蛋白CD81、Ang和HCG表達(dá)對(duì)RSA女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值

CD81 mRNA、Ang-1/Ang-2mRNA、CD81 蛋白、Ang-1/Ang-2蛋白、HCG均可用于預(yù)測(cè)RSA女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn)(AUC=0.881,0.864,0.777,0.836,0.759)。見(jiàn)表4及圖1。

表4 胎盤(pán)絨毛跨膜蛋白CD81、Ang和HCG表達(dá)預(yù)測(cè)RSA女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn)的ROC曲線(xiàn)分析

3 討論

妊娠是一個(gè)受到精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜生理過(guò)程,當(dāng)胎盤(pán)血管發(fā)育不良、出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙則可致胚胎血供不足,導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[10-11]。因此,與滋養(yǎng)細(xì)胞功能、血管生成相關(guān)的因子表達(dá)異常可能引起RSA患者早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn),深入分析相關(guān)因子的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)RSA早孕期流產(chǎn)防治具有重要臨床意義。

CD81是外泌體的重要標(biāo)志分子,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合及調(diào)控細(xì)胞遷移、血管內(nèi)皮損傷等生理過(guò)程,對(duì)免疫細(xì)胞具有廣泛調(diào)節(jié)作用[12]。目前已有研究[13]證實(shí),CD81可通過(guò)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞激活等機(jī)制影響正常妊娠胎盤(pán)形成過(guò)程,參與子癇前期的發(fā)病,但其在RSA中的作用則仍需探究。此外,Ang-1、Ang-2為血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的具有核糖核酸酶活性的促血管生成因子,二者均可與內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶Tie-2結(jié)合,在血管的重塑、成熟、出芽及生成分支中發(fā)揮著重要作用[14-15]。國(guó)內(nèi)外均有研究[16-17]顯示,血管生成素異常過(guò)表達(dá)可通過(guò)誘導(dǎo)妊娠期間子宮血管重塑、刺激滋養(yǎng)層侵襲等機(jī)制而影響正常妊娠過(guò)程。HCG水平則與滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量有關(guān),被用于臨床中判斷宮內(nèi)妊娠、異位妊娠、妊娠失敗等異常妊娠狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,RSA組胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平和Ang-1/Ang-2 mRNA比值、Ang-1/Ang-2蛋白比值均升高,而血清HCG水平降低,提示胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白異常表達(dá)參與RSA患者早孕期的復(fù)發(fā)流產(chǎn),且患者處于低血清HCG水平的妊娠異常狀態(tài)。相關(guān)性分析顯示,RSA胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2 間的mRNA水平正相關(guān),蛋白表達(dá)量間也呈正相關(guān),且三者mRNA及蛋白表達(dá)量與血清HCG水平無(wú)關(guān),提示胎盤(pán)絨毛CD81、Ang-1、Ang-2 高表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致RSA患者早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn),三者作用存在相關(guān)性且均與絨毛活性無(wú)關(guān)。余艷茹等[18]研究指出胎盤(pán)絨毛CD81異常高表達(dá)與RSA的發(fā)生有關(guān),趙駿達(dá)等[19]研究顯示絨毛組織Ang-1、Ang-2高度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致RSA的發(fā)生,均支持本研究結(jié)論。由此可推測(cè)CD 81異常表達(dá)可能通過(guò)其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合及調(diào)控細(xì)胞遷移的生理作用而降低滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)能力,影響血管生成過(guò)程和子宮螺旋動(dòng)脈重塑,使胚胎淺著床而發(fā)生RSA。Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白異常表達(dá)使Ang-1/Ang-2比例失衡,可能通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞凋亡,引起血管內(nèi)皮功能障礙,影響母-胎血液循環(huán)的建立,使胚胎缺血缺氧而發(fā)生RSA。ROC曲線(xiàn)顯示,CD81 mRNA、Ang-1/Ang-2mRNA、CD81蛋白、Ang-1/Ang-2蛋白、HCG均可用于預(yù)測(cè)RSA女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn),但單一評(píng)估指標(biāo)敏感性或特異性不足,且臨床實(shí)際中mRNA及蛋白檢測(cè)推廣存在一定難度,因此,后續(xù)臨床研究可考慮尋找與胎盤(pán)絨毛組織CD81、Ang-1、Ang-2水平變化相關(guān)的血清指標(biāo)用于預(yù)測(cè)評(píng)估,同時(shí)還可從改善胎盤(pán)絨毛組織CD81、Ang-1、Ang-2水平變化方面著手探究RSA防治方法。

綜上,胎盤(pán)絨毛組織上調(diào)CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白表達(dá)參與RSA的發(fā)病,CD81、Ang-1、Ang-2間可能存在相互作用共同影響RSA發(fā)病,且三者與反映絨毛活性的HCG的相關(guān)機(jī)制無(wú)關(guān),評(píng)估CD81、Ang-1、Ang-2、HCG表達(dá)水平在預(yù)測(cè)RSA女性早孕期復(fù)發(fā)流產(chǎn)方面具有一定診斷價(jià)值。