結核分枝桿菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10在肺結核組織中的表達

陳雪倩,方詩宇,于江,段紹琪,孫杰,劉鳳君

(川北醫學院附屬醫院感染科,四川 南充 637000)

結核病嚴重威脅人類健康。據世界衛生組織(WHO)估算,2020年全球新發結核病患者987萬例,死亡128萬例;我國新發結核病84.2萬例,發病率約為59/10萬,在30個結核病高負擔國家中我國估算結核發病數僅低于印度位居全球第二位[1]。為控制結核病,盡早明確診斷、及時治療尤為重要。結核最重要的確診依據是病原學檢查,目前常用的方法包括抗酸染色、結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)培養及分子生物學檢測,但靈敏度均不理想,無法滿足臨床需求[2-3]?？乖瓩z測也可作為病原學的診斷依據,2017年《中國結核病病理學診斷專家共識》[4]指出,采用免疫組化(immunohistochemical staining,IHC)可以檢測出結核病變組織中MTB特異性抗原的表達,且操作簡單,陽性信號易于觀察,無需使用油鏡,對結核病的診斷有參考價值。

研究[5-6]發現,ESAT-6和CFP-10是診斷結核的兩種重要抗原,其抗原編碼基因位于RD1區,編碼CFP-10的基因位于ESAT-6的上游,兩個基因共同轉錄,形成1：1的緊密復合物而發揮作用[7]。大多數非結核分枝桿菌和BCG菌株缺失該區段[8],故ESAT-6和CFP-10有著較好的特異性。目前臨床主要用于γ-干擾素釋放實驗(interferon gamma Release Assay,IGRA),也有學者[9]探索將ESAT-6和CFP-10融合抗原用于新型皮膚測試(EC),兩種方法與結核菌素試驗相比,有更好的特異性及敏感性,但均屬于免疫學方法,受人體免疫反應的影響,仍存在假陽性或假陰性結果。研究[10-13]報道,在結核性腦膜炎患者的腦脊液及腎結核組織中檢測到ESAT-6,在結核病患者的尿液中檢測到CFP-10,提示直接檢測兩種抗原可用于結核的補充診斷。關于肺結核組織中ESAT-6和CFP-10的檢測僅在2019年全國結核病學術大會上有報道,且為摘要,無法獲取具體實驗方法及結果[6]。本研究擬采用IHC檢測ESAT-6及CFP-10在肺結核組織中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2019年5月至2021年8月川北醫學院附屬醫院19例手術切除的經病理診斷為肺結核且已行抗酸染色的石蠟包埋肺組織標本,所屬患者痰/肺泡灌洗液抗酸桿菌涂片結核分枝桿菌DNA均為陰性;選取20例肺癌切除標本正常組織斷端為陰性對照。ESAT-6兔多克隆抗體(bs-13107R)、檸檬酸組織抗原修復液(100×)購于北京博奧森古生物技術有限公司;CFP-10兔多克隆抗體(ABIN285580)購于antibody-online公司;即用型免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(20×)購于福州邁新生物技術有限公司。本研究獲得川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準(批號：2022ER005-1)

納入標準：(1)結核病符合2017年《中國結核病病理學診斷專家共識》[4]I類或Ⅱ類診斷標準。Ⅰ類為明確結核病診斷,病變組織及細胞病理變化符合結核病病理變化特征,且具有結核病病原學證據,可作明確診斷;Ⅱ類為提示性診斷,病變組織及細胞病理變化具備結核病病理變化特征,但沒有明確結核病病原學證據,不能排除結核病可能性的可作提示性診斷;如“符合結核”“考慮為結核”“提示為結核”“疑診為結核”“不能排除(除外)結核”等。(2)術后抗結核治療有效。(3)非結核組通過病理診斷為正常肺組織(肺癌切除標本正常組織斷端),且均否認結核病史,IGRAs陰性。

1.2 方法

肺結核標本已由病理科行抗酸染色;蠟塊連續切片3張(厚度4 μm),1張用于蘇木精-伊紅染色(HE)染色,2張用于免疫組化染色。(1)HE染色：二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,蘇木素染色5～10 min后水洗,鹽酸-乙醇分化后水洗,1%氨水返藍5～10 s后水洗,0.5%伊紅染色1～3 min后水洗,二甲苯透明后中性樹膠封片。(2)免疫組織化學染色(SP法)：切片脫蠟、微波修復抗原、內源性過氧化物酶阻斷、非特異性染色阻斷劑血清封閉、一抗4 ℃冰箱孵育過夜、加二抗后濕盒內室溫孵育10 min、加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶、DAB顯色、蘇木素復染、封片。用PBS溶液代替一抗作陰性對照。

1.3 統計學分析

采用SPSS25.0軟件對數據進行處理與分析。計數資料以[n(%)]表示,采用Fisher精確概率法檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗酸染色及IHC染色結果

HE染色顯示,肺結核組織呈慢性肉芽腫改變伴凝固性壞死;抗酸染色顯示,結核病灶中可見紅色細長、略彎曲、桿狀的抗酸桿菌;ESAT-6及CFP-10免疫組化染色顯示,陽性信號為深棕色顆粒,呈點狀、點簇狀或小斑片狀分布,著色部位中心顏色較深、周圍較淺,主要分布在結核病灶的壞死區及周圍巨噬細胞和多核巨細胞中,極少數見于淋巴細胞、上皮樣細胞中。而陰性對照的免疫組化染色未見陽性信號或僅可見少許淺淡棕色信號,且分布無特殊規律。見圖1。

2.2 ESAT-6、CFP-10免疫組化染色結果

19例肺結核組織標本中ESAT-6、CFP-10陽性分別有14例、12例,敏感度分別為73.68%、63.16%。20例正常肺組織標本中ESAT-6、CFP-10陽性分別有2例、1例,其特異度分別為90.00%、95.00%。見表1。

2.3 抗酸染色與ESAT-6、CFP-10免疫組化的敏感度比較

19例肺結核標本中有10例抗酸染色陽性,敏感度為52.63%;10例抗酸染色陽性的標本中兩種抗原免疫組化全部陽性,而在9例抗酸陰性的標本中,ESAT-6免疫組化陽性4例,CFP-10陽性2例。IHC檢測ESAT-6及CFP-10的敏感度分別為73.68%(14/19)、63.16%(12/19),高于抗酸染色,差異有統計學意義(P=0.011、0.001)。見表2。

表2 肺結核組織抗酸染色與ESAT-6、CFP-10免疫組化的敏感度比較

3 討論

病理學檢查是除病原學檢查外另一重要診斷方法,結核病的基本病理改變是滲出、增生及壞死,特征性病理改變為肉芽腫的形成伴干酪樣壞死,但這種改變也存在于其他感染性與非感染性疾病中[4]。因此,病理學聯合病原學檢測對結核的診斷更有意義?？顾崛旧栃月蕿?5.28%～37.30%[14-17],且需使用油鏡,尋找抗酸桿菌費時費力。研究[18]證明,分子病理學敏感性較抗酸染色有所提高,但可能因氣溶膠污染容易出現假陽性結果,對實驗室及操作人員要求較高,在基層醫院難以廣泛開展。

除了細菌和核酸以外,抗原也是病原學診斷的重要依據。朱雅娟等[10]在結核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者的腦脊液中發現抗結核治療前及治療1、2、4周后,TBM患者腦脊液中ESAT-6均高于非TBM患者,且腦脊液中ESAT-6水平隨病情改善而逐漸下降;孫立等[11]發現腎結核病灶中ESAT-6表達增強;另有研究[19]發現,在淋巴結結核病灶中可檢測到ESAT-6。本研究發現,ESAT-6及CFP-10抗原陽性信號沉積在結核病灶壞死區及其周圍巨噬細胞和多核巨細胞中,極少數見于淋巴細胞、上皮樣細胞中。信號分布與抗酸桿菌有關,范圍更廣,符合分泌蛋白不僅存在于MTB細胞內,還分泌到細胞周圍的特點。以上研究提示直接檢測抗原可能可作為結核病原學診斷依據之一。

孫立等[11]發現,免疫組化檢測腎結核組織中ESAT-6的敏感度和特異度分別為100%和83%;滿昌軍等[12]發現,腎結核組織中ESAT-6的敏感度和特異度分別為100%和87.13%;二者結果相似;Sumi等[19]發現,ESAT-6在淋巴結結核組織中的敏感度為88.6%、特異度為100%。本研究結果發現,ESAT-6在肺結核組織中的敏感度為73.68%、特異度為90.00%。上述結果的差異可能與組織來源的不同有關,也可能與IHC結果判讀標準不完全一致有關。對于CFP-10在組織中的表達情況,李曉霞等[6]曾以文獻摘要的形式報道在肺結核組織中檢測到該抗原,但無敏感性及特異性的數據。本研究研發,CFP-10在肺結核組織中的敏感度是63.16%、特異度是95%。本研究首次在肺結核病變組織中檢測到ESAT-6及CFP-10,為探討兩種抗原在肺結核診斷的意義提供了基礎。

本研究結果顯示,肺結核組織中抗酸染色敏感度為52.63%,而免疫組化檢測ESAT-6、CFP-10在抗酸陽性標本的敏感度均為100%,而抗酸陰性的標本中還有部分陽性,總體敏感度分別為73.68%、63.16%,提示免疫組化的敏感性較抗酸染色更高,該特點可能在菌陰肺結核及肺外結核的診斷中更有意義。另外免疫組化陽性信號易于觀察,不需要使用油鏡,可以有效提高工作效率。因此,采用免疫組化檢測MTB特異性抗原ESAT-6、CFP-10在結核診斷中有潛在的應用價值。

綜上,肺結核組織中可以檢測到結核分泌抗原ESAT-6、CFP-10的表達,且敏感性高于抗酸染色,在結核診斷中尤其對于菌陰肺結核及肺外結核有潛在的應用價值。