DNMT1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究

鄒浩冬,楊飛,張莞嫣,王拓 ,邱亞,吳艷

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,1.口腔科;2.醫(yī)學(xué)研究中心,四川 南充 637000)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是全球第六大常見惡性腫瘤,口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma ,OSCC)是HNSCC中最常見的腫瘤類型,發(fā)病率占HNSCC發(fā)病率的90%[1-2],據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)[3],2020年全世界新增口腔癌37.7萬例,死亡新增17.7萬例,近20年來口腔鱗癌總體5年生存率不足50%[4-7]。在過去的幾十年中,雖然國內(nèi)外學(xué)者不斷探索口腔鱗癌治療的新思路和新方法,但病死率仍居高不下,且發(fā)病率還逐年升高,因此對(duì)口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的潛在機(jī)制的探索及對(duì)新的診斷方式、治療靶點(diǎn)的尋找十分重要。表觀遺傳修飾是調(diào)節(jié)基因表達(dá)而不改變DNA序列本身的過程,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān),DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要表現(xiàn)形式,DNA甲基化酶1(DNMT1)是負(fù)責(zé)DNA甲基化模式精確復(fù)制和維護(hù)的關(guān)鍵酶,抑癌基因(tumor suppressor genes,TSG)的頻繁高甲基化促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,目前DNMT1已在多種腫瘤中檢測到高表達(dá)并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后及耐藥性都存在密切相關(guān)性,如食管癌、下咽癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌等[8-10],因此通過阻斷DNMTs來去甲基化DNA是一種潛在的治療策略。然而目前關(guān)于DNMT1在口腔鱗癌中的作用的鮮有報(bào)道。本研究旨在探討DNMT1在口腔鱗癌中的表達(dá)情況及其對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

胎牛血清(FBS)、雙抗生素(青霉素和鏈霉素)、胰酶(EDTA)(以色列BI公司);DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)基(Vivacell公司);shRNA干擾DNMT1(sh-DNMT1)和sh-NC(陰性對(duì)照)序列(美國GeneCopoeia公司)設(shè)計(jì)合成;Matrigel膠、Transwell小室(美國Corning公司);一抗DNMT1、β-actin(Affinity公司);兔二抗(菲恩公司);BCA蛋白濃度測試試劑盒、嘌呤酶素、RIPA裂解液、PVDF膜(索萊寶公司);CCK-8試劑盒、PCR逆轉(zhuǎn)錄及qPCR試劑盒(諾唯贊公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 GEPIA2 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2;gepia2.cancer-pku.cn/)是一個(gè)能對(duì)癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因型組織表達(dá)數(shù)據(jù)集(The Genotype-tissue Expression,GTEx)來源的共9 736個(gè)腫瘤和8 587個(gè)健康樣本RNA序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的數(shù)據(jù)庫。本研究利用該平臺(tái)分析DNMT1在泛癌及HNSC癌組織和正常組織中的表達(dá)差異。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 分別用MEM完全培養(yǎng)基(含20%FBS及1%雙抗)、DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS及1%雙抗)、F-12完全培養(yǎng)基(含20%FBS及1%雙抗)于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人口腔上皮角化細(xì)胞HOK、口腔鱗癌細(xì)胞HSC3及口腔鱗癌細(xì)胞SAS。當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)70 %左右,用EDTA消化細(xì)胞,離心,棄上清液,收集細(xì)胞,清洗,重懸,傳代細(xì)胞。細(xì)胞長至70%～80%左右,分組,細(xì)胞慢病毒感染,提取總RNA或總蛋白。

1.2.3 DNMT1基因干擾感染、分組及篩選 取對(duì)數(shù)生長期的HSC3、SAS細(xì)胞以每孔4.75×105個(gè)接種于6孔板,分為3組：未經(jīng)慢病毒感染處理的空白對(duì)照組(control組);感染無序列的慢病毒的陰性對(duì)照組(sh-NC組);感染敲低DNMT1慢病毒的敲低組(sh-DNMT1組)。次日根據(jù)分組加入sh-NC及sh-DNMT1慢病毒,感染12～16 h后吸去含慢病毒的培養(yǎng)液,重新添加含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2 d后在倒置熒光顯微鏡觀察熒光,隨后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染株。感染序列：sh-NC：Forward：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′,Reverse：5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′;sh-DNMT1：Forward：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′,Reverse：5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′,以上序列由GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)、合成。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 采用Trizol法提取HOK、HSC3、SAS細(xì)胞的總RNA并檢測濃度和純度,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。同時(shí),采用RT-qPCR檢測HSC3及SAS sh-NC、sh-DNMT1組細(xì)胞的DNMT1 mRNA表達(dá)量差異以確定轉(zhuǎn)染效率。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,并進(jìn)行了3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。以β-actin為內(nèi)參,檢測DNMT1基因的表達(dá),由生工生物設(shè)計(jì)合成。見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot(WB) 收集HOK、HSC3、SAS細(xì)胞后,用RIPA裂解法提取總蛋白,BCA法測蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(75 V電泳30 min后120 V電泳60 min),將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上(250 mA/120 min),用快速封閉液室溫下封閉20 min,加入一抗DNMT1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)4 ℃冰箱孵育過夜,1×TBST洗膜3次,每次10 min,加入二抗,室溫孵育1 h,再次洗膜3次后用ECL超敏顯色液顯影。同時(shí),提取HSC3及SAS 的sh-NC、sh-DNMT1組細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)以確定sh DNMT1敲低效率。用Image J軟件計(jì)算條帶灰度,分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集HSC3、SAS感染sh-NC、sh-DNMT1組細(xì)胞,將細(xì)胞以3 000個(gè)/孔接種至96孔板中,每孔體積100 μL,搖勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后,設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間0、1、2、3 d后,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)向孔內(nèi)加入10μL CCK8檢測液,培養(yǎng)箱中避光孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定每孔吸光度(OD值)并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集HSC3、SAS感染sh-NC、sh-DNMT1組細(xì)胞,以每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板中,培養(yǎng)約兩周,棄去原培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,PBS漂洗后晾干,拍照,使用 Image J 軟件量化克隆形成數(shù)量。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將HSC3細(xì)胞sh-NC、sh-DNMT1組分別以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層融合時(shí),用200 μL移液管槍頭劃痕,PBS清洗3次去除脫落的細(xì)胞,6孔板中更換成不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,在培養(yǎng)0、12、24 h使用倒置顯微鏡觀察劃痕區(qū)域并拍照記錄,使用 Image J 軟件,量化間隙面積。

1.2.9 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) (1)遷移實(shí)驗(yàn)：收集HSC3、SAS感染sh-NC、sh-DNMT1組細(xì)胞,用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸,制作出密度為1.5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,取200 μL加入Transwell小室上室中,下室加入500 μL完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后棄去上室中懸液,用棉簽輕拭去除未穿膜細(xì)胞后進(jìn)行多聚甲醛固定20 min,結(jié)晶紫染色10 min,染色后洗滌干燥,倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍照,用Image J軟件統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。(2)侵襲實(shí)驗(yàn)：用基礎(chǔ)培養(yǎng)基以8∶1稀釋Matrigel膠,然后均勻鋪于Transwell小室上室,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置1 h,凝固后棄去基礎(chǔ)培養(yǎng)基。余步驟同Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DNMT1在泛癌及HNSC中的表達(dá)情況

通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA2分析DNMT1在泛癌及HNSC中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,DNMT1在多種腫瘤中高表達(dá),在HNSC中表達(dá)明顯增高(P<0.05)。見圖1。

2.2 DNMT1在口腔上皮正常細(xì)胞和口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

通過RT-qPCR和WB實(shí)驗(yàn)分別檢測人口腔上皮角化細(xì)胞HOK及口腔鱗癌細(xì)胞系HSC3、SAS中DNMT1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)DNMT1在HSC3、SAS細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)量均相對(duì)HOK較高(P<0.05)。見圖2。

2.3 HSC3、SAS細(xì)胞系中DNMT1的敲低效率

control組細(xì)胞無熒光,經(jīng)慢病毒感染后的sh-NC組、sh-DNMT1組可見綠色熒光。用RT-qPCR、WB實(shí)驗(yàn)檢測DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示：與control組相比,sh-NC組DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與sh-NC相比,sh-DNMT1組DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。因此后期實(shí)驗(yàn)只設(shè)計(jì)sh-NC組作為對(duì)照。見圖3。

2.4 DNMT1對(duì)OSCC細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,與sh-NC組相比,sh-DNMT1組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DNMT1敲低后可顯著抑制口腔鱗癌細(xì)胞克隆數(shù)(P<0.05)。見圖4。

2.5 DNMT1對(duì)OSCC細(xì)胞遷移、侵襲的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DNMT1敲低使口腔鱗癌細(xì)胞HSC3遷移能力降低(P<0.05);Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在HSC3、SAS細(xì)胞中,與陰性對(duì)照組相比,DNMT1敲低組細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞侵襲能力均明顯降低(P<0.05)。見圖5。

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要表現(xiàn)形式,DNA高甲基化可以區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞,這導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)指示生長抑制的信號(hào)不敏感,并通過抑制腫瘤抑制基因來逃避程序性細(xì)胞死亡,還可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成及影響抗炎反應(yīng)等機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療耐藥性,和癌癥患者的生存率也顯著相關(guān)[11-14]。DNMT1是DNA甲基化的關(guān)鍵酶,既往研究[15-16]表明其在多種惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著調(diào)控作用。一項(xiàng)研究[8]表明,在胰腺組織中DNMT1的表達(dá)水平從炎性的正常胰腺管到癌前病變?cè)俚揭认侔┏手饾u升高的趨勢,DNMT1通過抑制胰腺癌細(xì)胞分化和促進(jìn)其增殖、遷移和侵襲能力及誘導(dǎo)胰腺癌癌癥干細(xì)胞的自我更新能力等機(jī)制起致癌作用,而這些作用是通過TSG啟動(dòng)子高甲基化實(shí)現(xiàn)的,包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制因子和腫瘤抑制因子miRNA等。DNMT1沉默載體在膀胱癌細(xì)胞及食管鱗癌細(xì)胞中降低腫瘤生長、減少侵襲遷移、減弱治療抗性并能抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力,DNMT1可能是預(yù)測膀胱癌患者腫瘤分期和臨床結(jié)果的重要指標(biāo)及治療的潛在靶點(diǎn)[17-18]。

口腔癌的發(fā)生是一個(gè)長期的過程,是腫瘤相關(guān)基因的遺傳和表觀遺傳改變累積的結(jié)果,其中DNA的甲基化尤為重要[19-21]。本研究通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)DNMT1在頭頸部鱗癌、胰腺癌及甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中均高表達(dá),且在頭頸部鱗癌中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨后在蛋白及mRNA水平初步探索了DNMT1與口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HOK相比,HSC3、SAS細(xì)胞中DNMT1的mRNA及蛋白表達(dá)量均較高(P<0.05),提示DNMT1可能參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。既往研究[22-23]就DNMT1的表達(dá)與OSCC生存率關(guān)系做了探索,Supic等[22]的研究首次證明DNMT1 mRNA過度表達(dá)和遺傳變異在調(diào)節(jié)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者生存率方面發(fā)揮重要作用,Yang等[23]研究構(gòu)建了口腔鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型來探索DNMT1在癌變中的作用及與腫瘤微環(huán)境改變的關(guān)系,結(jié)果表明DNMT1表達(dá)水平與口腔鱗狀細(xì)胞癌小鼠存活時(shí)間負(fù)相關(guān)。盡管DNA甲基化在各種人類腫瘤中的重要性現(xiàn)在變得越來越明顯且在OSCC中發(fā)揮著重要作用,但在OSCC中觸發(fā)或?qū)е庐惓NA甲基化的具體機(jī)制仍然不清楚。為了進(jìn)一步探究DNMT1在OSCC腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等方面的作用機(jī)制,本研究采用shRNA慢病毒干擾技術(shù)敲低HSC3、SAS細(xì)胞中的DNMT1基因表達(dá),再利用嘌呤霉素抗性實(shí)驗(yàn)篩選獲得DNMT1低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。隨后我們通過RT-qPCR、Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)慢病毒感染后的HSC3、SAS細(xì)胞中的DNMT1基因表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示sh-DNMT1組的DNMT1 mRNA和蛋白表達(dá)均較sh-NC組低,說明DNMT1低表達(dá)穩(wěn)系構(gòu)建成功。用CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HSC3、SAS細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果表明,敲低DNMT1可以抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖能力;利用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HSC3、SAS細(xì)胞遷移、侵襲能力,發(fā)現(xiàn)敲低DNMT1表達(dá)可以減弱HSC3、SAS細(xì)胞遷移、侵襲的惡性行為。

綜上,DNMT1在口腔鱗癌細(xì)胞中高表達(dá),對(duì)口腔鱗癌的增殖、遷移和侵襲發(fā)揮重要的調(diào)控作用,能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。