柴胡皂苷D調(diào)控miR-34a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖與自噬的影響

劉曉熙,趙鵬偉,張靜,于慧玲

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤,調(diào)查[1]顯示,膠質(zhì)瘤發(fā)病率達(dá)到3.69/10萬。目前臨床上對于膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)、化療為主,但多數(shù)患者臨床療效仍然較差,5年總生存率不超過35%[2]。故尋找新的有效治療靶點和方案,對改善患者預(yù)后尤為重要。近年來,中醫(yī)藥在臨床腫瘤治療獲得了一定成果,柴胡作為常用中藥之一,其化學(xué)活性成份也受到明顯關(guān)注。柴胡皂苷類是柴胡最具代表性的化學(xué)活性成分,含有多種單體,其中柴胡皂苷D藥理活性最強,在抗腫瘤方面存在明顯生物活性[3]。以往研究[4]顯示,柴胡皂苷D可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)外移植瘤生長、遷移和侵襲。但關(guān)于柴胡皂苷D調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的具體機制尚處于探索中。miR-34a屬于腫瘤抑制基因,能夠調(diào)控多種因子表達(dá)繼而影響腫瘤增殖、凋亡等[5]。有研究[6]顯示,miR-34a可以抑制腦膠質(zhì)瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。基于此,本研究擬進(jìn)行細(xì)胞實驗,觀察柴胡皂苷D能否抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖和誘導(dǎo)其自噬,并驗證柴胡皂苷D是否可通過調(diào)控miR-34a來影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 主要材料

膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),柴胡皂苷D(四川維克奇生物科技有限公司),7300全自動熒光定量PCR儀及實時熒光定量PCR試劑盒(美國ABI公司),總RNA提取Trizol試劑及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司),放射沉淀免疫試驗(RIPA)裂解液(北京索萊寶科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司),TBST液、Western印跡轉(zhuǎn)膜緩沖液、Western印跡一抗稀釋液及Western印跡二抗稀釋液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司),凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司),胎牛血清(美國GIBCO公司),總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗鼠酶標(biāo)二抗IgG(北京博奧生物技術(shù)有限公司),CCK-8試劑(上海尚寶生物科技有限公司),miR-34a及U6引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6培養(yǎng),培養(yǎng)箱環(huán)境：溫度37 ℃,5% CO2。當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時,將其分為6組,分別予以終濃度為0、3、6、9、12、15 μmol/L的柴胡皂苷D處理48 h。

1.2.2 CCK-8實驗 在96孔板中進(jìn)行膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6接種,濃度為每孔6×103個細(xì)胞,之后在培養(yǎng)箱中孵育24 h,再加入CCK-8溶液10 μL/每孔,繼續(xù)孵育2 h,去上清,加入DMSO 150 μL/孔,低速振蕩5 min,通過酶標(biāo)檢測儀檢測波長在450 nm處吸光度(OD值),計算不同濃度柴胡皂苷D處理下膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的增殖率。每組設(shè)置6個復(fù)孔,獨立重復(fù)實驗3次。

1.2.3 蛋白免疫印跡法(Western blot) 各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中加入RIPA裂解液,冰上孵育30 min,3 000 r/min離心,提取細(xì)胞總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度,加入一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,二抗在37 ℃水溶箱中孵育1 h后,TBST液洗滌5 min×3次,加入顯色液,通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶表達(dá)情況,內(nèi)參半定量分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 采用Trizol試劑提取各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,行熒光定量PCR擴增,反應(yīng)體系為10 μL,樣品管和內(nèi)參(U6)管均設(shè)復(fù)管。預(yù)變性：95 ℃ 30 s,循環(huán)1次;反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)儀器自帶軟件分析熒光信號,獲取Ct值。采用2-△△CT法計算膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中miR-34a mRNA表達(dá)水平。miR-34a上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAG-3′,下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6融合至70%～80%時,在6孔板中鋪6×105個細(xì)胞,將細(xì)胞分成4組：對照組(Control組)、柴胡皂苷D組(Ssd組)、柴胡皂苷D+miR-34a陰性對照轉(zhuǎn)染組(Ssd+miR-34a NC組)、miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染+柴胡皂苷D組(Ssd+miR-34a inhibitor組)。對照組不予任何處理;Ssd組使用9 μmol/L柴胡皂苷D處理48 h;將miR-34a inhibitor、miR-34a NC分別轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6,室溫下靜置20 min,分別加入到培養(yǎng)孔中,再繼續(xù)孵育4 h。miR-34a inhibitor+Ssd組、Ssd+miR-34a NC組轉(zhuǎn)染后,進(jìn)行培養(yǎng)基更換,再用9 μmol/L柴胡皂苷D處理48 h。轉(zhuǎn)染操作均按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行,并檢測各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中miR-34基因表達(dá)情況和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷D對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖及自噬的影響

3、6、9、12、15 μmol/L組的柴胡皂苷D處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖率均低于0 μmol/L組(P<0.05);Beclin1表達(dá)水平均高于0 μmol/L組(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于0 μmol/L組(P<0.05)。見表1。

表1 柴胡皂苷D對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖及自噬的影響

2.2 柴胡皂苷D對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6 miR-34a表達(dá)的影響

3、6、9、12、15 μmol/L組的柴胡皂苷D處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6 miR-34a表達(dá)水平均高于0 μmol/L組(P<0.05)。見表2。

表2 柴胡皂苷D對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6miR-34a表達(dá)的影響

2.3 miR-34a轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖及自噬的影響

Ssd組、Ssd+miR-34a NC組、Ssd+miR-34a inhibitor組膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖率均低于Control組;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1表達(dá)水平均高于Control組(P<0.05),Ssd組、Ssd+miR-34a NC組膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖率均低于Ssd+miR-34a inhibitor組;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1表達(dá)水平均高于Ssd+miR-34a inhibitor組(P<0.05)。見圖1-圖2及表3。

表3 各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6自噬相關(guān)蛋白灰度值比較

3 討論

膠質(zhì)瘤惡性程度高,具有侵襲性強、治愈率低、復(fù)發(fā)率高等特點,發(fā)病率及致死率在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中均處于第一位,對人類健康威脅大。隨著中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展和在臨床上的推廣,通過中藥來預(yù)防和治療腫瘤也越發(fā)受到重視,探討中醫(yī)藥在抗腫瘤方面的作用機制已成為醫(yī)學(xué)研究熱點。

柴胡皂苷是柴胡主要活性成分,其中柴胡皂苷D活性最顯著。近年來研究[7]發(fā)現(xiàn),柴胡皂苷D具有多種藥理作用,包括保肝、抗腫瘤、抗癲癇等。時薛麗等[8]研究顯示,柴胡皂苷D可以抑制胃癌細(xì)胞生長和遷移。黨鋒等[9]研究認(rèn)為,柴胡皂苷D可通過誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬來抑制癌細(xì)胞增殖。自噬是一種分解代謝過程,細(xì)胞自噬與其衰老、凋亡均為非常重要的生物學(xué)現(xiàn)象,在生物生長和發(fā)育中起到了重要作用。報道指出,細(xì)胞自噬異常與惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)[10-12]。細(xì)胞自噬會受到自噬相關(guān)基因以及多種信號通路的調(diào)控,細(xì)胞收到相關(guān)信號或經(jīng)過刺激后,能夠啟動III型磷脂酰肌醇激酶(VPS34)與Beclin1結(jié)合,形成吞噬泡后和自噬相關(guān)因子進(jìn)行組裝對接并形成自噬小體,待其成熟后再與溶酶體進(jìn)行結(jié)合,最終降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì),起到自噬作用。Beclin1可以調(diào)控自噬體膜合成,繼而調(diào)控細(xì)胞自噬,故而Beclin1蛋白表達(dá)水平也能在一定程度上顯示細(xì)胞自噬情況[13]。功能延伸為細(xì)胞自噬過程的重要環(huán)節(jié),在功能延伸階段,LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ并存在于自噬體膜上,在各類自噬接頭中起到重要作用,故而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以反映細(xì)胞自噬情況[14]。以往關(guān)于柴胡皂苷D與癌細(xì)胞自噬的研究[9]顯示,柴胡皂苷D會影響人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中LC3相關(guān)蛋白水平,自噬抑制劑3-MA,可以對柴胡皂苷D誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。本研究探討柴胡皂苷D對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖和自噬的影響,結(jié)果顯示,經(jīng)柴胡皂苷D處理48 h后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖率明顯受到抑制,且隨著柴胡皂苷D濃度增加,增殖率逐漸下降,在濃度為9 μmol/L時增殖受限最為顯著,故而選擇將9 μmol/L作為后期工作濃度。自噬結(jié)果顯示,經(jīng)柴胡皂苷D處理后,自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯升高,提示柴胡皂苷D可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬,抑制其增殖。

目前有關(guān)柴胡皂苷D是通過何種途徑影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的研究報道很少。有研究[15]發(fā)現(xiàn),經(jīng)小柴胡湯處理過的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中miR-34a表達(dá)水平隨著小柴胡湯作用時間延長而升高。miR-34a是miR-34家族成員,可以調(diào)控多種靶基因(如抑癌基因p53)表達(dá)和信號通路(如Wnt、TGF-β/Smad3/4信號通路)活性,繼而影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為[16]。過去研究[17]顯示,miR-34a能夠調(diào)控TGF-β/Smad4信號通路而促使細(xì)胞自噬發(fā)生,繼而降低結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和骨肉瘤的研究中也發(fā)現(xiàn),miR-34a能夠促進(jìn)癌細(xì)胞自噬發(fā)生[18-19]。這些研究結(jié)果提示,miR-34a與癌細(xì)胞自噬關(guān)系密切,其表達(dá)水平升高促進(jìn)癌細(xì)胞自噬發(fā)生。本次研究分析miR-34a轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖及自噬的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Ssd組、Ssd+miR-34a NC組和Ssd+miR-34a inhibitor組膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖率均明顯下降,而自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯升高,且與Ssd+miR-34a inhibitor組相比,Ssd組、Ssd+miR-34a NC組對腫瘤增殖的抑制作用更為顯著,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表達(dá)水平更高,提示提示柴胡皂苷D可能是通過調(diào)控miR-34a實現(xiàn)來誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6自噬。

綜上,膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6實驗從細(xì)胞水平驗證了柴胡皂苷D可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖和誘導(dǎo)自噬發(fā)生,這種作用機制可能是通過調(diào)控miR-34a實現(xiàn)的。