蔓越莓預防兒童神經源性膀胱發生尿路感染的藥學研究

李桂鳳,薛進,朱增燕（蘇州大學附屬兒童醫院,江蘇 蘇州 215001）

神經源性膀胱（neurogenic bladder，NB）是神經源性膀胱尿道功能障礙的簡稱，由神經本身的病變或外傷、手術等對神經損害所引起，表現為膀胱逼尿肌或（和）尿道括約肌的功能障礙導致儲尿和排尿異常，最后引起雙腎功能的損害[1]。尿路感染（UTIs）是神經源性膀胱患兒常見的并發癥之一，有文獻報道NB患者UTIs的發生率約每年2.5次，且超過1/3的患者需要住院治療，同時超過1/5的患者需要反復住院治療[2]，若反復發生尿路感染，會導致腎瘢痕形成，甚至發展為慢性腎功能不全和腎性高血壓[3]。隨著全球抗生素耐藥性和UTIs復發率的增加，人們開始探索新的防治策略，作為一種天然的替代品，新鮮蔓越莓或干果的攝入量，以及來自它們的產品（果汁、提取物等）已被廣泛推薦，國內外指南中均提到其可作為植物藥用于預防尿路感染，但是目前關于蔓越莓的臨床療效存在一定的爭議，可能歸因于不同的蔓越莓產品中有效成分含量不同、沒有統一的使用劑量標準、缺乏系統的受試者選擇和臨床試驗方案等。本文旨在篩選出適合兒童服用的蔓越莓產品和劑型，為NB兒童確定合適的劑量和頻次提供依據。

1 儀器與試劑

SPARK 204型全波長酶標儀（美國帝肯公司）；TGL-20M型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；QUINTIX125D-1CN型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；乙醇、鹽酸（36.5%）、丙酮、乙酸（均為分析純，國藥集團有限公司）；原花青素標準品（批號：1 2 2 6 P 0 2 1，北京索萊寶科技有限公司）；4-（二甲氨基）肉桂醛（批號：BCCJ1129，西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司）。

2 方法與結果

2.1 觀察蔓越莓粉預防尿路感染的效果 回顧性分析40名服用蔓越莓產品的兒童，同時滿足以下四項條件：①既往有先天性神經管發育不良或神經損傷病史，影像學或尿動力學檢查符合神經源性膀胱診斷[1]；②年齡在4-18歲；③有反復發作性尿路感染[7]：6個月內發作≥2次，或1年內發作≥3次；④既往長期服用抗菌藥物預防尿路感染。

該40名兒童中男孩、女孩各20名，年齡在4-18歲，都曾長期服用呋喃妥因、頭孢克洛、復方磺胺甲惡口唑、頭孢克肟等抗菌藥物預防尿路感染，后停用抗菌藥物，口服蔓越莓產品。服用的蔓越莓產品和劑量沒有統一標準，服用時間在1-6個月不等，其中2名兒童口服蔓越莓產品1個月、4名兒童口服3個月、4名兒童口服6個月后出現尿液渾濁，尿白細胞計數偏高、尿白細胞酯酶陽性；4名兒童口服蔓越莓產品2個月、4名兒童口服蔓越莓產品3個月、22名兒童口服6個月未出現尿路感染癥狀，尿常規檢查結果正常。見表1。結果表明，口服蔓越莓粉2個月內預防尿路感染的有效率為75%，3個月內預防尿路感染的有效率為65%，6個月內預防尿路感染的有效率為55%。

表1 口服蔓越莓產品預防尿路感染的效果

2.2 篩選合適的蔓越莓產品 本試驗搜集了市面可售的5種蔓越莓產品，劑型有口服液、散劑、膠囊和片劑，具體結果見表2。說明書中明確提及兒童可用的有1號蔓越莓口服液和3號蔓越莓粉，其中蔓越莓提取物含量較高的為3號蔓越莓粉，因此選擇3號蔓越莓粉作為本試驗的受試產品。

表2 不同蔓越莓產品的比較

2.3 建立蔓越莓產品中原花青素的含量測定方法

2.3.1 配制標準品溶液 精密稱取原花青素（PAC）標準品5mg，用無水乙醇溶解定容至50mL容量瓶中，配制成100mg/L的PAC標準品，分別稀釋至50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L。

2.3.2 配制4-（二甲氨基）肉桂醛（DMAC）溶液 玻璃瓶中加入12.5mL去離子水和75mL無水乙醇，再加入12.5mL鹽酸（37%）配制成酸化乙醇溶液。精密稱取DMAC50mg用酸化乙醇溶液定容至50mL容量瓶，配制成0.1%DMAC溶液。

2.3.3 建立標準曲線 采用DMAC法測定蔓越莓產品中原花青素的含量[4]。精密吸取70μL的空白溶液（80%乙醇）和不同濃度PAC標準品溶液加入到96孔板中，分別在每個孔中加入210μL 0.1%DMAC試劑，充分混勻后將平板放入平板閱讀器中，用酶標儀在640nm進行吸光度讀數，每5min讀取一次數值，重復3次，每個時間點的吸光度讀數減去對應的空白吸光度讀數，取平均值。以吸光值為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x），繪制的標準曲線方程為：y=0.0072x-0.0022，R2=0.9997。結果表明，PAC在濃度6.25mg/L-100mg/L范圍內線性關系良好。

2.4 測定蔓越莓粉中原花青素含量 配制PAC萃取液：將75mL丙酮轉移到一個裝有24.5mL去離子水的玻璃瓶中，并加入0.5mL乙酸。稱取蔓越莓粉0.5g放入50mL錐形管中，再加入PAC萃取液20mL，室溫超聲30min，然后在20℃以2000g離心10min，收集上清液，按2.3.3方法進行DMAC法測定，計算每袋蔓越莓粉中的PAC含量為（82.47±2.91）mg。

2.5 測定蔓越莓粉服用后尿液中原花青素含量 招募10名4-14歲健康兒童為志愿者，男女各5名，在服用蔓越莓粉1包后2h、4h、8h、12h、24h收集中段尿液作為服用后不同時間的樣品，樣品在4℃條件下保存。按2.3.3方法分別測定不同時間點尿液中PAC濃度。服用蔓越莓粉后，人尿液中PAC含量逐漸升高，服用后8h尿液中PAC含量最高，平均值為（54.76±1.11）mg/L，服用后24h尿液中PAC含量均值為（29.95±0.98）mg/L，結果見圖1，因服用后24h尿液中PAC含量仍較高，建議蔓越莓粉可口服每日一次，每次1包。

圖1 不同時間點尿液中原花青素濃度（n=10）

3 討論

目前，抗菌藥物仍然是UTIs治療和預防的金標準，國內外指南推薦的可預防兒童UTIs抗菌藥物有甲氧芐啶、呋喃妥因、復方新諾明、阿莫西林克拉維酸鉀或頭孢克洛類藥物口服。但是長期使用抗生素會導致神經源性膀胱患兒胃腸道和泌尿道菌群失調，耐藥菌或條件致病菌所致尿路感染的比例上升。尿路感染常見的病原菌有大腸桿菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等，尿路致病性大腸桿菌（UPEC）是75%-95%的非復雜膀胱炎和腎盂腎炎最常見的致病菌，UPEC利用它們菌毛附著在尿路上皮細胞受體上，導致細菌增殖，其中三種UPEC菌毛類型與大多數感染有關，包括1型菌毛、P型菌毛和F9型菌毛[5]。一項隨機、雙盲、安慰劑對照試驗[6]表明，與安慰劑相比，食用蔓越莓后的人尿液具有很強的抑制P型和1型UPEC黏附尿道上皮細胞的能力。有研究[7]顯示，通過收集攝入蔓越莓提取物后的人尿液，發現白色念珠菌菌株的黏附和生物膜形成顯著減少。

臨床藥師在參與臨床工作中發現有一些患兒服用蔓越莓產品預防尿路感染且認同療效，因此，作者回顧性分析40名反復發生尿路感染的NB兒童口服蔓越莓產品預防尿路感染的效果，以患兒是否有尿渾、尿痛等尿感癥狀，尿常規檢查中以尿白細胞計數、尿白細胞酯酶、尿亞硝酸鹽等指標為依據判斷是否發生尿路感染。尿白細胞計數、細胞酯酶（U-LE）、尿亞硝酸鹽（U-NIT）指標對尿路感染的診斷具有重要的價值，U-LE試驗的敏感性約為94%，特異性約為74%[8]。結果表明，蔓越莓產品預防兒童尿路感染具有一定的療效，可考慮作為抗菌藥物的天然替代品，但是市場上蔓越莓產品品種較多，成分不一，使用劑量和頻次沒有統一標準。因此，臨床藥師查閱國內外文獻中研究蔓越莓預防尿路感染的作用機制和臨床研究得知，有效成分主要是蔓越莓中的PAC。本試驗建立了蔓越莓產品中PAC的含量測定方法，并用該方法測定10名健康兒童服用適合兒童口服的蔓越莓粉后在不同時間點尿液中PAC的濃度，建議需要長期預防尿路感染的患兒口服蔓越莓粉可以每日一次，每次一包。后期將繼續在行泌尿疾病手術后需要長期插導尿管或內置引流管的患兒中觀察蔓越莓粉的臨床療效。