絲狀真菌分生孢子及其核型相關基因的研究進展

吳 君，陸嬌嬌，鄭珊珊，王思琦，施碧紅，2*

(1.福建師范大學生命科學學院, 福建 福州 350117; 2.福建師范大學工業微生物與發酵技術國家聯合工程研究中心, 福建 福州 350117)

絲狀真菌種類繁多，包括曲霉、木霉、毛霉和青霉等，它們與人類活動息息相關，一些被廣泛用于工業生產發酵食品、工業酶和次級代謝產物，如青霉素、灰黃霉素生產者產黃青霉Penicilliumchrysogenum[1]、灰黃青霉Penicilliumgriseofulvum[2]；各種酶制劑、有機酸等的生產菌米曲霉Aspergillusoryzae[3]、黑曲霉Aspergillusniger[4]等。同時還有不少種類是重要的植物病原菌，少數可侵染動物或人類，引起真菌感染。由于絲狀真菌基因組中含有大量與生物降解、初級和次級代謝、轉錄調控和細胞信號轉導有關的基因，且具有強大的合成和分泌大量蛋白質的能力，因此是生產異源蛋白的理想宿主[5]。

曲霉屬和青霉屬是已報道的產生外代謝產物最豐富的兩類絲狀真菌，曲霉屬的每個物種平均產生外代謝物5.77種，青霉為3.77種，且該數據仍有可能被低估[6]。因此曲霉和青霉中的一些物種是作為細胞工廠或工業微生物育種的重要材料。曲霉和青霉菌的營養體具有發達的菌絲，有隔膜和分枝。其生活史以無性繁殖為主，產生具有獨特形態結構的分生孢子梗和大量的無性孢子-分生孢子。其有性孢子為子囊孢子，但在曲霉和青霉這兩個重要的屬中，有些種很少產生或從不產生子囊果，而以分生孢子進行繁殖。然而分生孢子核型具有多樣性，少數為單核、多數為多核孢子。盡管真菌多核性的生物學優勢是眾所周知的，多核的分生孢子不僅具有較高的發芽效率外，還有較強的生存能力和對紫外線輻射、凍融處理的抗性[7]，因此可以有效提高絲狀真菌在壓力環境條件下的生存效率。多核特性對真菌進化亦至關重要，通過異核體導致不同遺傳性的核融合而產生新的基因型，使得真菌種群不斷進化得以適應復雜的環境。但是，多核特性亦會削弱遺傳操作產生的表型效應，如異核轉化子導致蛋白表達水平的下降等。開展真菌分生孢子核型研究對解析絲狀真菌細胞生理生化、遺傳變異機制以及對真菌遺傳育種和病原真菌防治都具有重要意義，因此本文就曲霉等絲狀真菌分生孢子的發育及其核型變化調控相關基因的功能進行歸納，為更好地開展相關物種的遺傳操作提供理論基礎。

1 絲狀真菌分生孢子發育過程的基因調控

分生孢子是絕大多數曲霉、青霉屬絲狀真菌的無性生殖細胞。分生孢子產生于由菌絲分化而形成的分生孢子梗上，分生孢子梗始于菌絲的厚壁足細胞生出并向空中伸長，產生氣生莖。莖停止延伸后開始膨脹，形成囊泡，在囊泡膨脹階段，囊泡內進行大量核分裂復制，接著出芽產生瓶梗，囊泡內細胞核遷移到瓶梗，瓶梗繼續進行出芽生殖，通過重復不對稱分裂產生分生孢子鏈，并且在出芽點與孢子連接處形成隔膜[8]。當囊泡膨脹和分生孢子伸長時，細胞核會同時經歷幾次有絲分裂，并逐步從菌絲體遷移到孢子中。總之，在分生孢子形成過程中，菌絲中的細胞核經過一系列核分裂、核遷移到形成隔膜，最后形成菌絲分支。分生孢子的形成過程受到多種基因調控(表1)。

表1 常見的控制分生孢子形成的基因

表2 常見的控制核分裂及核遷移的基因

分生孢子發育通常受brlA、abaA、wetA、stuA和medA等基因的協同調控[6，18]，它們的表達產物直接促進分生孢子梗的形成(表1)。分生孢子發育的關鍵步驟是激活編碼C2H2鋅指轉錄因子的基因brlA，該基因還誘導無性發育所需的其他基因abaA和wetA的表達。abaA是分生孢子瓶梗正常形成所必需的，abaA突變體導致珠狀孢子的生成，abaA過表達導致菌絲生長終止和細胞空泡化。wetA是分生孢子特異性基因的(轉錄)調控因子，由brlA和abaA順序表達激活，wetA突變體無法積累分生孢子特異性基因的mRNA。brlA、abaA和wetA這三個基因被定義為一個中央調控通路，通過brlA、abaA和wetA基因的順次激活決定分生孢子形成和成熟的特異性基因表達[9]。stuA和medA是調控分生孢子有序分化和空間組織所必需的，這兩個基因中的任一突變都會導致空間紊亂的分生孢子梗。

2 絲狀真菌分生孢子核型變化過程的基因調控

絲狀真菌具有多種生殖方式，一些絲狀真菌在其生活史中不發生有性生殖過程，其細胞核在有絲分裂過程中會經歷準性重組事件，造成異核體、同核體、重組單倍體或二倍體的存在，故其菌絲和分生孢子中可以保持單核或多核狀態。大多數絲狀真菌的分生孢子具有核異質性，如Aspergillusflavus、Aspergillusoryzae、Neurosporacrass、Peniclliumchrysogenum及Microsporumgypseum等，且在其整個生命周期中具有單核、多核或兩者共存狀態[19]。多核特性使絲狀真菌適應更廣泛環境，但同時也增加了對其進行遺傳分析及菌種改良的難度，如隱性突變體的獲得等。真菌細胞核動力學是多核形成的重要基礎，也是維持分生孢子正常發育的關鍵，涉及微管、肌動蛋白、動力蛋白、驅動蛋白和調節因子組成的調控網絡。有關分生孢子核型變化過程基因調控的機制研究在不斷進行中。

2.1 核分裂過程的基因調控

絲狀真菌分生孢子形態與生長和核分裂密切相關。分生孢子發育與細胞有絲分裂周期相偶聯，在絲狀真菌形成的分生孢子中還含有一些停滯在有絲分裂G1期的單核孢子，這些孢子經歷新一輪萌發，頂端開始極化生長，同時細胞核再次進入有絲分裂周期。核分裂在A.nidulans由兩種不同的蛋白激酶的活性控制，分別是nimXcdc2編碼的周期蛋白依賴性激酶p34nimX和nimA編碼的NIMA蛋白激酶。p34nimX的激活需要與細胞周期蛋白NIMEcyclinB相結合，其活性在核分裂時顯著提高[20]。NIMA促進有絲分裂，同時抑制孢子極性生長，但是在最佳生長條件時孢子進行極化生長的前提是核完成第一輪有絲分裂[21]。Morris[22]發現細胞周期缺陷突變體在43.5℃限制性溫度下，其細胞核雖然不能完成第一次有絲分裂，但孢子依舊能進行極化生長。因此，蛋白激酶和環境生長信號共同組成復雜的調控網絡，協調孢子極化形態發生與核分裂周期和細胞生長的作用。

絲狀真菌通過形成隔膜完成胞質分裂，其中心孔是細胞核等細胞器和細胞質流動的通道[23]。隔膜的形成也依賴于核分裂，且需要將肌動蛋白聚集到隔膜形成的部位。在一個腔室中所有核開始有絲分裂后約10分鐘會出現隔膜，隨著菌絲的生長，繼續形成新的隔膜和菌絲細胞[24]。在A.nidulans野生株中，胞質分離發生在核分裂三輪之后，該過程由Sep家族基因參與協調[25]。sep突變體有兩種類型，其中sepB、sepE、sepI或sepJ突變株能夠在37℃限制溫度下完成三到四輪核分裂，但由于無法形成隔膜所以停止生長。sepA、sepD、sepG和sepH突變株在限制溫度下形成隔膜原基，但在隔膜組裝后期被阻斷。

2.2 核遷移過程的基因調控

絲狀真菌多核分生孢子的形成與核遷移有關。核遷移通常發生在營養菌絲生長過程中，多核的產生不是由新形成的分生孢子繼續有絲分裂形成的，而是通過細胞核向子代遷移形成[26]。核遷移方式的多樣性導致核型的多樣，這主要與微管組織中心(MTOC)驅動的微管(MT)蛋白系統相關，包括細胞質微管(CMT)、紡錘體微管(SPB)和星狀微管，細胞核的位置取決于MT的位置。微管在有絲分裂時在細胞核內形成紡錘體，在間期形成胞質軌道[27]，可直接對細胞核施加拉力和推力或通過與MTOC的連接參與核定位。在多核絲狀真菌中，CMT細胞骨架具有控制同一細胞內多個細胞核遷移和分布的能力。此外，核遷移還可以依賴其他細胞器沿MT運動，這些細胞器不是從頭合成的，而是在細胞分裂時傳給子細胞，必須在胞質分離前被精確定位。在S.cerevisiae中，核定位通過源自紡錘體的細胞質微管進行。由于紡錘體在核膜內組裝，細胞核在有絲分裂前必須精確地定位在母芽頸部，以便為母細胞和芽提供遺傳物質，然后核內SPB的伸長使得核從母細胞移動到子細胞[28-29]。肌動蛋白在核遷移過程中與微管協同作用，主要通過兩種機制在核定位中起作用：肌動球蛋白收縮，或肌動蛋白偶聯跨膜肌動蛋白逆行流動。胞質動力蛋白和驅動蛋白是MT的主要馬達，可以直接連接MT的核膜或控制MT張力，其功能需要動力蛋白激活蛋白的輔助[30]。Maruyama，J[31]等克隆并鑒定了米曲霉細胞質動力蛋白重鏈編碼基因(dhcA)，證實了胞質動力蛋白還在維持米曲霉分生孢子核數目方面起作用。除此之外，my01、act1、c1n、ypt1、spaI、tcp1、dyn1、jnm1、nup1等基因的功能也是調控細胞核運動所必需的。這些基因對應的蛋白質與微管相互作用，有些參與微管的穩定[32]。由此可得，控制細胞核的位置普遍通過主動遷移機制和細胞核正確錨定機制來實現，這對于真菌細胞生長和發育至關重要。

絲狀真菌的菌絲通過頂端極化生長形成相互聯系的細胞網絡，菌絲體中的多個細胞核會彼此保持適當的距離，這需要胞質動力蛋白和動力蛋白復合物以及其他幾種蛋白質共同作用，涉及五個相關基因，分別是nudA、nudC、nudE、nudF和nudG[27]。nud突變體的細胞核在42℃限制溫度下不能從萌發孢子體移到分生孢子梗中，導致細胞核分布異常，多數聚集在菌絲隔膜附近[33]。nudA編碼細胞質動力蛋白的重鏈，nudC參與核遷移和頂端極性生長，但nudC突變不影響微管結構的完整，也不參與核分裂，它與微管蛋白、肌動蛋白和驅動蛋白之一相互作用或是調節其活性[34]。A.nidulans的nudE編碼產物NUDE是N.crassa的核分布蛋白RO11的同源物，在細胞質動力蛋白通路中起作用。nudF[35]基因編碼一個包含β-轉導蛋白重復序列的保守蛋白，因其與異源三聚體G蛋白亞基序列相似，表明該蛋白與細胞內信號轉導有關[26]。另外還在S.cerevisiae和哺乳動物中分別發現了NUDE的同源物PAC1和LIS1參與胞質動力蛋白功能，并且哺乳動物的NUDC同源物也與LIS1蛋白相互作用[36]。這表明nud家族基因共同組成胞質動力蛋白調節通路，并且調節機制是保守的。

核遷移是菌絲頂端發生極化生長的基礎，由多種蛋白共同調控。其中一種核定位蛋白APS(包括APSA和APSB)定位于菌絲的細胞質膜[37]，Suelmann[38]在A.nidulans構建stu-GFP融合系統，利用熒光顯微鏡和延時成像追蹤細胞核遷移，觀察到多核菌絲細胞的一個腔室中，整體上所有核都向菌絲頂端遷移，但每個核的遷移速率不同。這表明存在控制同一細胞質內各個核運動的調節因子，其通過與微管、馬達蛋白連接或觸發馬達蛋白活性來調控核運動，該調節因子即Aps。在Aps缺失株中，分生孢子在初生孢子梗形成之前發育正常。在形成初生孢子梗的過程中，細胞核無法從囊泡遷移到瓶梗，并且不能激活發育特異基因。但細胞核偶爾也會進入初生孢子梗，這些孢子梗就會繼續形成產孢瓶梗細胞，從而完成生命周期。這表明細胞核進入初生孢子梗是一個發育節點，確保菌絲的形成。發育缺陷型Aps突變體細胞核未能進入初生孢子梗，發育停止在瓶梗起始階段。除發育停滯外，許多分生孢子特異性基因在ApsA突變體中沒有活性，這表明ApsA基因產物可能直接激活它們，或者ApsA是指導這些基因轉錄的調控因子。在釀酒酵母中發現了ApsA蛋白的同源物NUM1p，該蛋白在細胞周期的G2階段定位于酵母母細胞的皮層，并與星狀微管相互作用[39]。

在A.nidulans中除了產生單核分生孢子外，在相同的環境條件下還以恒定的比例產生雙核和三核分生孢子，該性狀由bncA單基因控制[40]。它在異核體中非自主表達且受溫度影響，參與細胞核從囊泡向初生孢子梗的遷移過程[41-42]?？梢奲ncA基因與Aps基因調控方式相反。在Aps突變體中，細胞核移動到囊泡后不能繼續向初生孢子梗移動，因此發育在瓶梗階段停滯。而在bncA基因存在下，兩個核可以向初生孢子梗移動，這表明雙核分生孢子的產生可能是由于兩個核結合到初生孢子梗中形成的。在bncA突變體中細胞核進入初生孢子梗就會形成隔膜，因此不會形成1個以上的核。本實驗室也通過蛋白質組學等技術在A.oryzae中發現了兩個與分生孢子核型相關的候選基因，有關此兩基因的功能驗證尚在進行中。

3 展望

絲狀真菌種類繁多、分布廣泛，在基因組、蛋白質組、轉錄組等各種組學基礎上對其功能基因的深入發掘，促進我們了解無性孢子形態結構差異和繁殖方式等各種復雜行為形成的機理，為更好地利用絲狀真菌提供理論指導。絲狀真菌作為細胞工廠，廣泛用于生產各種抗生素、有機酸、酶和維生素等，新技術諸如CRISPR等在絲狀真菌基因組中的應用可改善其多核特性帶來的不良效應，加快絲狀真菌遺傳改良效率[47-48]，構建高效遺傳操作體系，更好地為人類服務。同時，CRISPR技術在絲狀真菌中的應用仍需進一步完善，如其適用性、可擴展性和靶向效率方面仍有待改進。

在利用絲狀真菌為人類創造財富的同時，也不應忽視一些絲狀真菌物種對動植物的潛在威脅。如A.fumigatus，A.flavus和Talaromycesmarneffei等已經被世界衛生組織列為重要的病原微生物[49-50]。了解分生孢子繁殖方式的機制有助于制定出有效的病害診斷措施和特異性抗真菌藥物。CRISPR-Cas9的應用成功鑒別T.marneffei致病性的關鍵基因[51]，從遺傳水平闡明致病真菌的發病機制，并為分子抗真菌治療提供靶點。未來，在深入挖掘絲狀真菌各類組學信息和充分利用分子生物學技術基礎上，改善真菌疾病的檢測、預防和治療方法，并為開發利用絲狀真菌資源發揮積極作用。