一種適用于高通量基因分型的水稻種子切片DNA制備技術

林 旻，楊紹華，林 艷，王 月，胡太蛟，宋亞娜，潘雷博，陳在杰*

(1.福建省農業科學院生物技術研究所/福建省農業遺傳工程重點實驗室,福建 福州 350003; 2.福建農林大學生命科學學院, 福建 福州 350002)

得益于生物信息學、基因組學、表型組學、芯片技術等發展，水稻迎來了智能育種4.0時代。對育種家來說，數字技術的應用可顯著提升作物新品種的選育效率。近年來，基于高通量測序及DNA芯片技術的第三代SNP(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分子標記輔助選擇技術蓬勃發展，包括：基于競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)、TaqMan、半熱不對稱逆向PCR(Semi-Thermal Asymmetric Reverse PCR，STARP)等類型的分子標記檢測技術。其中，STARP標記由于其低成本、高通量、多平臺兼容性好的特點，目前已在水稻[1]、小麥[2]等作物中大量應用，是基因型鑒定的重要手段。分子標記輔助選擇技術的檢測對象是大批量遺傳分離群體，所以高通量、低成本、高質量的DNA提取方法是關鍵，直接影響分子標記篩選效率。

目前，水稻分子檢測的DNA來源多為葉片。常規的DNA提取方法中TPS法[3]可滿足快速、高通量提取水稻葉片中的DNA。大規模群體篩選時，采取水稻葉片需要單株單葉標記，操作煩瑣、容易出錯；受水稻生長階段的限制，獲得分子檢測結果后，再結合表型開展后續篩選，費時費事費地。而“先篩后種”可以大大提高育種規模與基因資源的挖掘利用效率，同時加快育種進程。從水稻種子中提取DNA用于分析，在育苗前完成鑒定，可以有效解決上述問題，但水稻種子中80%的成分都是淀粉，采用TPS法無法快速提出高質量的DNA。因此，急需開發一種適用于高通量基因分型的高質量水稻切片種子DNA提取制備技術。

利用磁珠法[4]中超順磁性納米粒子在一定環境下與核酸結合，通過淀粉酶解與4輪洗滌步驟可以去除水稻種子中大量的淀粉、蛋白質、脂類等物質。鑒于該法以上特點，本研究提出96孔板結合磁珠法，采用自動化核酸提取工作站提取水稻種子切片DNA，通過對比TPS法提取水稻葉片DNA及96孔板結合磁珠法提取切片種子DNA的純度和濃度，進一步采用STARP標記檢測驗證96孔板結合磁珠法提取水稻切片種子DNA的質量，以期獲得一種96孔板結合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程，可為大規模水稻樣品檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自福建省農業遺傳工程重點實驗室收集保存且已完成基因組測序樣品：長粒香、特青、粵農絲苗、水源377、TN05、野豐占、金優1號等119份優質種質資源。

1.2 儀器和試劑

1.2.1樣品前處理與核酸提取設備 自動種子切片機(北京金標記生物科技有限公司 CGMB-20R)、超高通量組織研磨儀(上海凈信實業發展有限公司JXFSTPRP-576)、臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司H2100R)、8道自動移液工作站(蘇州中析儀器有限公司SC9300)、全自動核酸提取儀(杭州奧盛儀器有限公司Auto-Pure 96)、超微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司Nano-500)。

1.2.2高通量基因分型設備 高通量基因分型系統(成都翰辰光翼科技有限責任公司GeneMatrix)由反應板制備儀MatrixArrayer、高通量水浴熱循環儀MatrixCycler與高速熒光掃描儀MatrixScanner三臺設備及HC-master基因分型數據處理軟件組成。

1.2.3主要試劑 TPS緩沖液：10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、2 mL 0.5 mol·L-1EDTA(pH 8.0)、7.45 g KCl，用純水定容至100 mL；裂解液Ⅰ：10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、3 mL 1 mol·L-1NaCl、2 mL 0.5 mol·L-1EDTA、5 g SDS，用純水定容至100 mL；酶處理液：中溫α-淀粉酶水溶液；裂解液Ⅱ：70.92 g異硫氰酸胍、7.5 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、3 g月桂酰基氨酸、6 mL 0.5 mol·L-1EDTA，用純水定容至100 mL；TE緩沖液：0.12114 g Tris、200 μL 1 mmol·L-1EDTA，用純水定容至100 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1TPS法和96孔板結合磁珠法提取水稻DNA步驟

TPS法。(1)15 mg葉片研磨成粉，加入TPS提取液300 μL；(2)70℃水浴45 min，其間每隔10 min上下顛倒搖勻1次；(3)放置室溫后4000 r·min-1離心15 min，取上清至新的深孔板；(4)加入無水乙醇(上清∶無水乙醇=1∶2.5)，-20℃冰箱冰凍30 min以上；(5)4000 r·min-1離心15 min，棄上清，加入75%乙醇300 μL，振蕩懸浮液，4000 r·min-1離心15 min，棄上清，待干燥后加入100 μL TE緩沖液，即獲得DNA溶液。

96孔板結合磁珠法。(1)將水稻種子脫殼得到糙米，使用自動種子切片機或手工將糙米對等切分成兩半，不帶胚的切片放入96深孔板供DNA提取使用，含胚切片放入96孔育苗盤留作發芽成苗；(2)將含有不帶胚切片研磨成勻漿后的96深孔板(B1)置于8道自動移液工作站，向每個樣本加入120 μL裂解液Ⅰ，溫控振蕩儀65℃、800 r·min-1裂解15 min；(3)使用8道自動移液工作站向B1中加入10 μL酶處理液，70℃消化15 min；(4)將B1使用4000 r·min-1轉速離心15 min后，使用全自動移液工作站吸取上清到新的96孔提取板(B2)，將B2使用全自動移液工作站加入180 μL裂解液Ⅱ后，置于溫控振蕩儀65℃、800 r·min-1裂解15 min；(5)使用8道自動移液工作站向B2依次加入480 μL異丙醇、40 μL磁珠、200 μL TE緩沖液，獲得DNA混合液；(6)放入全自動核酸提取儀，配置程序，按如下板位放置96深孔板進行DNA提取，板位1：磁棒套；板位2：DNA混合液；板位3：每孔400 μL異丙醇；板位4：每孔400 μL80%乙醇；板位5：每孔400 μL異丙醇；板位6：每孔400 μL80%乙醇；板位8：每孔200 μLTE緩沖液，板位8獲得的就是純化后的樣品DNA溶液。

1.3.2提取水稻葉片和切片種子DNA質量和濃度測定 隨機選取32個不同品種水稻，分別用TPS法提取水稻苗期葉片DNA及96孔板結合磁珠法提取水稻切片種子DNA。每個品種的兩種方法各提取3個重復。核酸的濃度和純度通過ODA260、ODA280和ODA230值分析[5]，ODA260/A230的比值用于評價DNA多糖、鹽離子等雜質的污染程度；ODA260/A280的比值用于評價蛋白質、RNA等雜質的污染程度。理想狀態ODA260/A230的比值應大于2.00，ODA260/A280的比值低于1.60表明含有蛋白質等雜質污染，高于2.00表明含有RNA等雜質污染。

吸取1～2 μLDNA原液，使用超微量分光光度計分別測定TPS法、96孔板結合磁珠法提取的DNA樣品濃度和純度(在230、260和280 nm波長處的吸光值)，每個方法隨機抽取檢測8個品種(長粒香、特青、粵農絲苗、水源377、TN05、野豐占、金優1號和農香32)并使用0.5% DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品核酸的完整度和質量(100 V、20 min)。

1.3.3STARP標記檢測驗證 利用STARP技術對兩個水稻優異基因進行分子標記檢測，以驗證96孔板結合磁珠法提取水稻切片種子DNA的質量。本研究針對粒型基因GS3[6]、米質基因Wx[7]分別進行基因分型。PCR擴增體系參考Long等[1]，根據引物接頭的不同，擴增產物中長粒型等位基因gs3為HEX信號，而短粒型等位基因GS3為FAM信號；高直鏈淀粉等位基因Wxa為FAM信號，低直鏈淀粉等位基因Wxb為HEX信號，STARP反應體系見表1所示。由高通量基因分型系統的Matrix Arrayer自動化構建獲得384孔的PCR擴增板，之后放入水浴熱循環儀Matrix Cycler中進行擴增。

表1 PCR反應體系

水浴PCR反應程序為，94℃ 3 min變性；第一階段循環為94℃ 20 s，56℃退火延伸2 min，每個循環降低1℃，共6個循環，第2個階段循環為94℃ 20 s，62℃退火延伸90 s，42個循環；最后62℃延伸2 min。在高速熒光掃描儀Matrix Scanner上讀取熒光信號值，通過HC-master基因分型軟件自動分析基因型。

2 結果與分析

2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

由圖1可知，經DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，96孔板結合磁珠法提取的DNA條帶可以清晰、明亮的目的條帶，而TPS法提取的DNA大多降解呈現彌散帶。

注：a)為96孔板結合磁珠法提取水稻切片種子DNA；b)為TPS法提取水稻葉片DNA；1～8分別代表長粒香、特青、粵農絲苗、水源377、TN05、野豐占、金優1號和農香32。圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis

2.2 核酸提取結果與分析

由表2可知，96孔板結合磁珠法提取DNA濃度為46～102 ng·μL-1，TPS法提取核酸濃度為49～81 ng·μL-1，二者沒有明顯的差別。但TPS法提取的葉片DNA溶液ODA260/A230在1.22～1.62，ODA260/A280在1.63～1.88，96孔板結合磁珠法提取的水稻切片種子DNA溶液ODA260/A230在1.60～1.90，ODA260/A280在1.73～1.90，每一組樣品的均值均高于TPS法提取的葉片DNA溶液，說明TPS雖然快速簡便但存在多糖等雜質，純度低。以上結果表明96孔板結合磁珠法提取水稻種子切片DNA的質量明顯優于TPS法提取水稻葉片DNA的質量。

表2 不同提取方法的DNA濃度、質量

2.3 STARP標記檢測驗證結果

由圖2a可知，GS3基因分型結果顯示95份樣品分為3種基因型，其中短粒型10份，長粒型66份，雜合型19份；由圖2b可知，Wx基因分型結果顯示94份樣品分為2個不同類群(圖2b)，其中低直鏈淀粉型79份，高直鏈淀粉型15份。由表3可見，兩種優異功能基因分型結果和各品種已知測序基因型完全一致，表明使用本方法提取水稻切片種子DNA可適用于GS3、Wx的STARP標記基因分型。

注：a)為GS3基因分型，長粒型等位基因為HEX信號(黃)，短粒型等位基因為FAM信號(紅)，雜合型為綠；b)為Wx基因分型，低直鏈淀粉等位基因為HEX信號(黃)，高直鏈淀粉等位基因為FAM信號(紅)圖2 水稻種質資源GS3、Wx基因STARP標記分析Fig.2 STARP marker analysis of GS3 and Wx genes in rice germplasm resources

表3 水稻種質資源GS3、Wx基因型鑒定結果

2.4 96孔板結合磁珠法提取DNA的高通量基因分型流程

應用自動種子切片機，8 h可完成4000粒水稻種子切片與自動分裝；配合超高通量組織研磨儀、8道自動移液工作站及全自動核酸提取儀，采用96孔板結合磁珠法DNA提取方法，可實現高通量水稻切片種子樣本核酸的自動化提取；結合高通量基因分型設備可實現每日數萬個基因分型數據點的檢測通量。高通量分型操作流程如圖3所示。

圖3 高通量基因分型流程示意圖Fig.3 Schematic diagram of the high-throughput genotyping

3 討論與結論

本研究兩種方法提取的DNA溶液ODA260/A280的范圍都在1.60～2.00，均可用于后續分子檢測試驗，但從DNA瓊脂糖凝膠電泳的結果看，膠孔存在微弱條帶說明都有存在少量蛋白質污染，出于成本與時間考慮，兩種方法都沒有添加去除蛋白質的試驗步驟，而磁珠納米粒子在吸附DNA同時有部分蛋白質也會裹挾在納米粒子表面，但是不會對STARP標記結果產生影響。

目前水稻分子標記快速檢測主要使用TPS法提取水稻葉片核酸，該方法雖然簡單、快速，但是提取的核酸純度較低，存在蛋白質及多糖的污染，完整性差、保存時間短，不利于多批次多位點的檢測。本研究利用水稻切片種子作為DNA抽提材料，相比于從葉片提取DNA的方法，不受育苗場地與苗期的時間限制，可提高基因分型的靈活性與效率。本研究采用高通量種子切片機，基于96孔板提取水稻切片種子核酸，操作簡單，省時高效，一人一天可以提取4000份以上的樣品。

分子標記輔助育種技術使育種家可以根據地域、飲食偏好有針對性的選育聚合不同優異功能單倍型的水稻新品種。例如粒型不僅是外觀品質性狀，也是影響米質的關鍵基因，對提高水稻產量和品質至關重要[8]。粒型的改變甚至可以提高水稻產量和外觀品質，培育出高產、優質的水稻品種。Liu等[9]通過聚合GS3、LGY3與直立密穗基因DEP1這3個基因的特定單倍型，提高水稻籽粒的長度、改善水稻籽粒的長寬比，達到同時改良水稻產量性狀與品質性狀的目的，在顯著提升稻米品質的基礎上還可使其產量增加7%以上。水稻直鏈淀粉是評價水稻蒸煮食味品質的重要指標之一，針對不同的用途其對直鏈淀粉的高低需求也不同。本研究96孔板結合磁珠法提取的核酸用STARP標記分型進行驗證，對控制粒型基因GS3、直鏈淀粉含量基因Wx進行鑒定，其結果與各品種重測序基因型一致，說明本法提取出的核酸純度高、可用于育種群體的高通量基因分型，也為大規模水稻樣品檢測提供技術支持。