UFLC法測定不同地區(qū)博落回果實中生物堿的含量

鄭梅霞，蘇海蘭，李熾勤，朱育菁，陳 宏，牛雨晴，朱雁鳴

[福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所(福建省種質(zhì)資源中心), 福建 福州 350013]

博落回為罌粟科博落回屬植物Macleayacordata(Willd)R.Br.，在我國分布廣泛，因產(chǎn)地不同，異名也多，如勃勒回、號筒桿和三錢三等20多種。博落回的主要活性成分為異喹啉類生物堿，包括原阿片堿(protopine，PRO)、別隱品堿(allocryptopine，ALL)、血根堿(sanguinarine，SA)以及白屈菜紅堿(chelerythrine，CHE)等[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，博落回具有抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、殺滅釘螺、殺滅血吸蟲和改善肝功能等活性[2-7]，廣泛應(yīng)用于藥品、生物農(nóng)藥和獸藥中[8]。

生物堿含量作為評價博落回質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。目前，博落回生物堿提取工藝的研究主要集中在果實、葉、根部位。曾建國等[9]采用HPLC法測定了博落回果實中血根堿和白屈菜紅堿的含量；蘇海蘭等[10]采用HPLC法研究了野生與種植博落回各部位生物堿含量；黃敬等[11]采用HPLC法對博落回不同部位原阿片堿、別隱品堿的含量進(jìn)行了測定；李光偉等[12]采用超聲波輔助優(yōu)化了博落回根原阿片堿、別隱品堿提取工藝。研究表明，博落回中主要含有原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿4種生物堿，故本研究將其作為評價博落回果實質(zhì)量的指標(biāo)。但在不同的生長環(huán)境下，博落回生物堿類物質(zhì)的含量也有不同程度的變化。本研究通過測定不同地區(qū)博落回果實中原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿的含量，對不同地區(qū)的博落回果實生物堿含量進(jìn)行差異分析，以期為博落回資源的篩選和選育提供參考，為當(dāng)?shù)剡x育優(yōu)良博落回品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生博落回果實于2019-2021年間采集自15個地區(qū)16份資源材料，來源信息及編號見表1，將博落回果實粉碎過篩(50目)，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 野生博落回果實來源信息

1.2 儀器與試劑

1.2.1試驗儀器 FW135中草藥粉碎機(jī)購自天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；SP214分析天平購自奧豪斯儀器(上海)有限公司；SIL-20A Prominence UFLC快速液相色譜儀LC(UFLC)購自SHIMADZU。

1.2.2主要試劑 乙腈(色譜純)購自默克股份兩合公司；甲醇(色譜純)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸(分析純)購自西隴科學(xué)股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品血根堿(SA)、白屈菜紅堿(CHE)、原阿片堿(PRO)(純度≥98%)購自上海源葉生物有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品別隱品堿(ALL)(純度≥98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1博落回生物堿的提取 采用超聲-甲醇提取法(ultrasonic assisted methanol extraction，UAME)：分別精確稱取博落回果實粉末0.5 g至50 mL具塞比色管中，加入50 mL50%甲醇(含1%鹽酸)，密封后于35℃超聲60 min，超聲功率180 W，取出放冷至室溫，離心，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，獲得檢測樣品，備用。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 (1)原阿片堿和別隱品堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精確稱取0.0017 g原阿片堿、別隱品堿于10 mL容量瓶中，加少量50%甲醇(含1%鹽酸)溶液溶解，用50%甲醇(含1%鹽酸)定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.17 mg·mL-1的原阿片堿和別隱品堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏保存。(2)血根堿和白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精確稱取0.0025 g血根堿、白屈菜紅堿于10 mL容量瓶中，加少量50%甲醇(含1%鹽酸)溶液溶解，用50%甲醇(含1%鹽酸)定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.25 mg·mL-1的血根堿和白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏保存。(3)混合標(biāo)準(zhǔn)品：精密量取200 μL原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合均勻，分別取250、125、80、65 μL，加50%甲醇(含1%鹽酸)250、375、420、455 μL分別稀釋2、4、6、8倍，獲得系列梯度濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液見表2。

表2 系列梯度混合標(biāo)準(zhǔn)品中原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿的濃度

1.3.3 色譜條件

采用InertSustainSwiftTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相為0.1%磷酸乙腈(A)和0.1%磷酸水(B)(28∶72)；流速為：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長為284 nm，室溫進(jìn)樣。供試品重復(fù)測試3次，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，樣品濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，獲得了原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿的回歸方程，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中4種生物堿的含量，以及這4種生物堿的總含量。

1.3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 博落回果實中生物堿測定方法的建立

混合標(biāo)準(zhǔn)品和博落回樣品生物堿檢測的UFLC色譜圖見圖1，可知采用本試驗的測試方法可以同時檢測出原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿4種生物堿。

注：PRO：原阿片堿；ALL：別隱品堿；SA：血根堿；CHE：白屈菜紅堿圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)及博落回樣品(B)UFLC色譜圖Fig.1 UFLC chromatograms of the mixed standard substance (A)and Macleaya cordata sample (B)

2.2 不同地區(qū)博落回果實中總生物堿含量差異比較

不同地區(qū)博落回果實中4種生物堿的總含量見表3，總生物堿含量范圍為(0.0066±0.0008)%～(0.4352±0.0082)%，其中，MC-1的總生物堿含量最高，達(dá)(0.4352±0.0088)%，與其他地區(qū)的樣本具有顯著性差異，MC-3、MC-4次之，分別為(0.3406±0.0076)%和(0.3281±0.0021)%。MC-16最低，僅含有(0.0066±0.0008)%。

表3 不同地區(qū)博落回果實中原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿的含量

2.3 不同地區(qū)博落回果實中4個生物堿含量比較

15個地區(qū)博落回果實的原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿含量范圍分別為(0.0019±0.0004)%～(0.1244±0.0020)%、(0.0015±0.0001)%～(0.1480±0.0053)%、(0.0019±0.0003)%～(0.1187±0.0015)%、(0.0010±0.0007)%～(0.0530±0.0002)%。果實中原阿片堿含量最高的是MC-3(0.1244±0.0020)%，最低是MC-16(0.0019±0.0004)%；別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿含量最高的均是MC-1，分別為(0.1480±0.0053)%、(0.1187±0.0015)%、(0.0530±0.0002)%，最低的均為MC-16，分別為(0.0018±0.0005)%、(0.0019±0.0003)%、(0.0010±0.0007)%。MC-1的4種生物堿含量由高到低的趨勢為別隱品堿>血根堿>原阿片堿>白屈菜紅堿。

綜上所述，福建省三明市明溪縣的MC-1博落回果實中別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿含量及4種生物堿總含量在15個地區(qū)樣本中均最高，具有較好的博落回種質(zhì)資源開發(fā)的潛力，可促進(jìn)博落回優(yōu)良品種的選育。

3 結(jié)論與討論

本研究分析了15個不同地區(qū)的16份博落回資源果實中原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿及這4種生物堿的總含量，其中福建省三明市明溪縣的MC-1博落回果實中的別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿及4種生物堿總含量均最高，分別為(0.1480±0.0053)%、(0.1187±0.0015)%、(0.0530±0.0002)%、(0.4352±0.0088)%，說明福建省三明市明溪縣的地理環(huán)境比較適合博落回資源的生物堿的累積。不同的生態(tài)環(huán)境對博落回生物堿的含量影響很大，鄒惠亮等[13]研究表明安徽績溪的莊年村、梅干嶺、楊村陽山、石岑村和下屋村的博落回果實中血根堿和白屈菜紅堿含量存在差異；王曙光等[14]對寧國、銅陵、宣城、廣德和桐城等不同地區(qū)博落回果實的白屈菜紅堿和血根堿的含量進(jìn)行比較表明廣德地區(qū)的最高，表明博落回栽培時的生態(tài)環(huán)境對博落回資源的開發(fā)利用至關(guān)重要。

福建省三明市明溪縣MC-1可作為種質(zhì)篩選的優(yōu)良資源，其原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿4種生物堿中，含量高低為別隱品堿>血根堿>原阿片堿>白屈菜紅堿，別隱品堿的含量最高；與蘇海蘭等[10]研究表明博落回中別隱品堿、原阿片堿、血根堿和白屈菜紅堿4種生物堿中別隱品堿含量最高的研究結(jié)果一致；而黃敬等[11]和劉秀斌等[15]研究表明博落回果實中原阿片堿含量最高；鐘明等[16]研究表明博落回果莢中血根堿含量最高。說明不同地區(qū)和不同部位的博落回中的生物堿種類與含量變化規(guī)律還有待進(jìn)一步探索。