利用基因編輯技術創制福香占糯稻新種質

魏林艷，樊佳星，張 敏，王進蘭，謝鴻光，魏毅東，張建福*

(1.福建省農業科學院水稻研究所/水稻國家工程實驗室, 福建 福州 350003;2.福建農林大學農學院, 福建 福州 350002)

糯稻(glutinous rice)作為中國重要的農作物之一，因其米粒含有糯性淀粉而備受青睞。糯稻不僅是許多地區的傳統主食，還可以制作出粽子、酒釀、湯圓等多種傳統小吃。目前，抗瘟糯稻新品種相對匱乏，據2022、2023年福建省初審通過主要農作物品種目錄可知，糯稻新品種的僅2個、且都不抗稻瘟病。因此，需要創制抗瘟糯稻新種質來應對不斷變化的生態環境和生產環境。糯稻一般指胚乳直鏈淀粉含量低于2%的水稻[1]，而顆粒結合淀粉合酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSS)基因Waxy(Wx)是控制直鏈淀粉含量的主效基因[2]。因此，Wx基因的多態性在很大程度上決定了直鏈淀粉含量的多樣性[3]。過去的研究發現存在多種Wx自然等位基因，這些基因控制著水稻直鏈淀粉含量從低于2%到高于25%的范圍[3-5]。其中，Wx基因的缺失突變體Wx導致直鏈淀粉下降到2%以上，是稻米糯性的主要效應基因[6-7]。

CIRPSR/Cas9系統是近年來迅速發展的高效、準確、便捷的基因編輯技術。與轉基因不同，基因編輯技術可以在不引入外源基因的情況下對目標基因進行敲除突變，可用于水稻品種的精確改良。福香占(閩審稻20200011)是福建省農科院水稻研究所于2020年新育成的優質、抗瘟、長粒秈型常規稻品種，具有較好的推廣潛力。本研究的目標是利用基因編輯技術快速創制福香占糯稻材料，為抗瘟病糯稻育種提供新的種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

CRISPR/Cas9敲除載體PHUE411由中國農業大學生物學院陳其軍教授惠贈；農桿菌菌株EHA105由福建省農業科學院水稻國家工程實驗室保存；受體材料秈稻福香占由福建省農業科學院水稻國家工程實驗室提供。所有轉基因材料種植于福建省農業科學院轉基因試驗基地，采用常規種植與水肥管理。

1.2 載體構建

將Wx基因的登錄號LOC_Os06g04200在CRISPR-PLANT(https://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)進行靶點篩選，選擇內含子與外顯子交界處的靶點作為候選位點，設計該靶點的CRISPR/Cas9敲除引物(Wx-sgRNA-F：AATAATGGTCTCAGGCGAGCCTCGAGTGCTGC-CTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC，Wx-sgRNA-R:ATTATTGGTCTCTAAACGCAGGCAGCACTCGAGGCTCGCTTCTTGGTGCC)隨后以sgRNA質粒元件pCBC-MT1T2為模板PCR擴增目的片段，采用KOD-FX高保真酶(東洋紡生物科技有限公司)進行擴增，擴增體系見表1。

表1 PCR擴增體系及流程

隨后將產物進行凝膠電泳檢測并回收，將產物與敲除載體PHUE411通過金門法進行連接后轉化大腸桿菌感受態，所用T4連接酶以及BsaI內切酶購自New England Biolabs(NEB)，連接步驟見表2。獲得最終有正確敲除片段的重組質粒后，利用凍融法轉入農桿菌轉化后用于水稻轉化，農桿菌介導的水稻轉化法參照本實驗室建立體系進行[8]。

表2 金門連接反應體系

1.3 基因編輯載體的遺傳轉化及轉基因植株分子檢測

基因編輯載體的遺傳轉化采用的是農桿菌介導的方法，具體參考文獻[9]。剪取樣品幼嫩葉片，用CTAB法提取DNA。針對Wx基因突變型分析，采用PCR擴增子測序的方法，引物采用Wx基因靶點側翼引物Wx-seq-F：CCTGGTAGGAGATGTTGTGGATG和Wx-seq-R：AGGTTTTTCCATTGCTACAAGCGT，所得產物大小735 bp。PCR擴增反應體系 ：DNA模板50 ng，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，10 mmol·L-1引物各 1 μL ，Nuclease-Free Water 定容至 25 μL。PCR擴增條件：預變性94℃ 5 min，擴增35個循環(94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s)。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳后送測序公司(鉑尚生物技術有限公司)進行測序。測序結果利用SnapGene軟件進行初步比對，雜合體測序雙峰采用DSDecodeM[10]進行解析。

1.4 突變體植株田間農藝性狀調查

田間材料按照《國家水稻品種試驗觀察記載項目、方法標準》進行株高、分蘗數、株高、千粒重等農藝性狀調查進行考查，每個株系重復5～8個單株，獲得數據通過Graphpad進行統計分析。

1.5 突變體株系稻米淀粉含量測定

總淀粉含量按國標 GB5006-1985《谷物籽粒粗淀粉測定法》所述方法進行，直鏈淀粉含量測定依據國標GB7648-87《水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測定法》所述方法進行，所有樣品測定3個重復，數據采用Graphpad進行統計分析。

1.6 突變體株系稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定選擇福建省上杭縣稻瘟病高壓病圃中進行，每個品種按小區播種，設置3個重復，四周設置感病誘發行。在苗期觀察并記錄苗瘟發病情況，將存活植株移栽到大病圃種植至成熟，其間觀察葉瘟和穗瘟的發生情況。苗瘟、葉瘟和穗頸瘟分級按國際水稻所0～9級標準進行判定。

2 結果與分析

2.1 基因編輯載體的構建與轉化

通過靶點在線評估以及突變類型分析，選取Wx編碼區第5外顯子上游邊界區域作為CRISPR靶點(圖1A)，設計通過金門連接法將Wx的基因編輯靶點串聯重組至CRISPR/Cas9載體PHUE411上(圖1B)。通過農桿菌的水稻轉化法將Wx基因編輯載體轉入受體福香占，共獲得T0代獨立克隆12個(圖2)。

注：A為Wx基因結構圖，白色部分為非翻譯區，綠色部分為編碼區，折線部分為內含子區，紅色三角形標注為本研究設計的Wx靶點。B為Wx敲除載體結構圖，LB/RB為T-DNA的左/右臂，OsU3p/TaU3p為U3啟動子區，藍色區域為含有Wx靶點的sgRNA序列，U3t為終止子區，Cas9/HygR分別表示Cas9蛋白/潮霉素抗性蛋白表達盒圖1 Wx基因基因編輯載體的構建Fig.1 Construction of Wx Genome Editing Vector

注：M1～12為12個獨立轉化克隆圖2 Wx基因編輯T0代材料Fig.2 T0 Generation Materials of Wx Genome Editin

2.2 利用基因編輯獲得Wx基因突變植株

提取T0植株DNA進行靶點突變分析，結果表明12個克隆均檢測到編輯事件(圖3)，其中雙等位突變10株，單等位突變2株。詳細的堿基變異見(表3)，由于所選靶點位于外顯子和內含子交界處，根據突變類型不同，可能會形成Wx基因內含子滯留或者編碼區移碼兩種類型。通過突變類型分析，結合田間農藝性狀觀察，確定了2個克隆M1和M9為后續研究材料。M1和M9在外顯子區分別插入和刪除了一個堿基“G”，屬于移碼突變，會形成無功能(Loss-of-function)的蛋白變體，可作為糯稻候選材料進行種植。

注：參考序列為福香占Wx基因靶點周邊序列，藍色標識為靶點PAM序列，紅色標識為靶點區域，小寫字符為內含子序列，大寫字符為外顯子序列，三角形標注Cas9蛋白的切點(PAM序列上游-3/-4之間)；M1～3為3個獨立轉化克隆測序峰圖，紅色箭頭標注出現突變的峰圖起始位點圖3 Wx基因編輯材料突變檢測Fig.3 Mutation Detection of Wx Genome Editing Materials

表3 T0代植株突變基因型

2.3 Wx基因編輯植株的表型鑒定

由于T0代植株為雙等位突變，為了獲得純合突變體植株，對T0代收獲的種子進行了突變型分析，M1和M9移碼突變體都篩選到純合的無功能突變型種子(圖4)。將這些種子擴繁提純后獲得兩個株系G-1(M1子代)和G-2(M9子代)，對突變體株系進行農藝性狀考查和糙米外觀品質檢測，結果表明突變體株的抽穗期、株高、穗長與福香占相似，而產量性狀略有不同，其中G-1和G-2千粒重略有下降，G-1差異達到顯著水平，但兩個株系的總體產量與對照相比，無顯著差異(表4)。此外，通過外觀品質可以看出福香占透明度較高，兩個基因編輯的株系的透明度較差，呈糊化狀態。可初步判斷兩個株系均為糯稻材料(圖5)。

注：參考序列為福香占Wx基因靶點周邊序列，G-1和G-2純合突變體序列(上)和測序峰圖(下)。圖4 Wx純合缺失突變體基因型鑒定Fig 4 Genotype Identification of Wx Homozygous Deletion Mutants

注：FXZ為親本福香占，G-1和G-2為2個缺失突變株系，標尺為1 cm。圖5 Wx缺失突變體糙米外觀形態Fig.5 Appearance of Wx knockout Mutant Brown Rice

表4 突變體株系農藝性狀調查

2.4 Wx基因編輯植株的直鏈淀粉含量測定

為了進一步驗證突變體植株的糯稻表型，測定了福香占和突變系G-1和G-2的稻米直鏈淀粉和總淀粉含量。由表5可知，親本福香占的直鏈淀粉含量為16.3%，2個純合株系的直鏈淀粉含量分別為1.64% 和1.81%，符合糯米國家標準的2%范圍內。綜上所述，本試驗通過基因編輯技術成功獲得福香占糯稻新材料。

表5 突變體株系淀粉含量測定

表6 福香占糯稻家系稻瘟病抗性鑒定

2.5 福香占糯稻材料的稻瘟病抗性鑒定

從G-1和G-2株系中各選了5個綜合性狀好的單株進行擴繁。福建稻瘟病高致病菌種對10個家系材料進行稻瘟病接種鑒定。結果表明，10個株系均有稻瘟病抗性，其苗瘟和葉瘟均為 0～1級，株系G1-1/3/5、G2-1/2穗頸瘟 0～1 級，綜合抗性評價為抗稻瘟病，株系G1-2/4、G2-3/4/5穗頸瘟3級，綜合抗性評價為中抗稻瘟病(表 6)。以上結果表明，利用基因編輯改良福香占的糯性，能基本保持其稻瘟病抗性。

3 討論與結論

隨著近年來功能基因組學和基因編輯技術的迅猛發展，基因編輯已經廣泛應用于作物性狀改良和種質創制，在品質、株型、抗性等多個方面取得了顯著進展[11-15]。基因編輯作為一種不引入外源片段的靶向改良方法，具有后代遺傳穩定和多性狀快速改良的優勢[16]。在本研究中，我們選取了優質抗瘟常規稻福香占進行基因編輯，通過田間的選擇，突變株系在株高、穗數、生育期等農藝性狀方面沒有顯著差異。同時，這些突變體還保持了對稻瘟病的抗性特性，適合用于改良現有的潛力品種，避免了煩瑣的回交導入選育過程。

根據本研究的結果，Wx基因的敲除對性狀產生的負面效應并不顯著。然而，突變體中的千粒重大約降低了1.4%。這可能是由于Wx基因參與胚乳淀粉合成途徑的重要性，其突變會引起籽粒灌漿的生理和分子變化。此前的研究也觀察到敲除Wx基因后千粒重略微下降的現象[7]。然而，其他類似的Wx基因編輯研究中，大部分材料的千粒重沒有發生下降，甚至有些突變體略微升高[6，17-19]，這可能是由于不同遺傳背景產生的效應差異。此外，福香占的突變系穗粒數略有升高，因此總體產量并沒有顯著變化。然而，要實現福香占糯稻種質的真正育種應用，還需要進行一系列的工作：除獲得基因編輯的安全證書外，還需要對其環境適應性、抗逆性和其他生產特性進行全面評估，以更全面地評估Wx基因敲除的影響。

值得注意的是，隨著基因編輯技術的進一步發展，已經開發出更先進的工具，可以精確地降低或激活特定基因的表達，從而創制出目標性狀梯度突變的材料。以Wx基因為例，通過對啟動子和5′UTR區的定點突變，可以產生直鏈淀粉梯度變化的種質，如高直鏈淀粉的米粉稻和松軟口感的軟米品種等，極大地擴展了基因編輯在育種上的應用[20-22]。這些編輯位點同樣可以進行編輯，創制出更豐富多樣的福香占抗瘟衍生系，以滿足不同市場需求。在未來的研究中，我們將繼續探索基因編輯技術在水稻種質創新中的應用，推動水稻生物育種的創新發展。