枇杷酵素發酵過程生物學特性和主要功效酶活性研究

陳洲琴，張祝蘭*，程 賢，林仙菊，楊煌建，嚴雪浪，朱愛明，連云陽*

[1.福建省微生物研究所/福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室, 福建 福州 350007;2.仙游縣清風生態農莊有限公司, 福建 莆田 351200]

枇杷是福建省莆田市四大名果之一，果實營養豐富，味道鮮美，具有清熱、潤肺等作用，具有較高的營養和食用價值。枇杷成熟期集中在初夏高溫、多濕季節，應季產量大，但保質期短、易腐爛變質，不利于貯藏和長途運輸[1-3]，因此枇杷短時集中上市和滯銷問題備受關注。目前枇杷果實除鮮食外，相關的加工產品主要有枇杷汁、枇杷罐頭、枇杷果醬及枇杷酒等[4-6]。近年來，隨著發酵產品的發展，水果酵素也逐漸走進了人們的生活[7-9]，將枇杷發酵成枇杷酵素產品也是解決枇杷產品銷售困難的一個重要手段。對于水果酵素的研究大多集中在發酵工藝的優化、生物活性的探究及代謝物質的分析等研究[10-16]，目前對于枇杷酵素的報道較少，有對其抗氧化活性功能開展研究[17]，但對于枇杷酵素自然發酵過程中微生物群落、氨基酸等代謝產物和主要功效酶等變化規律的全面評價，以及其發酵過程的監控研究尚未系統開展。

本研究以枇杷為原料，探究發酵時間對枇杷酵素生物學特性及主要功效酶活的影響，為構建枇杷酵素的綜合評價體系以及枇杷的高價值化利用和精深加工提供參考，為促進當地特色水果加工及副產物產業鏈發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枇杷由仙游清風生態農莊有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1試驗儀器 LC-2030高效液相色譜儀：日本島津公司；Allegra X-15R離心機：德國Beckman公司；752紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；L-8900型氨基酸分析儀：日本日立公司；DKZ-2B 型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；S20K酸度計：梅特勒-托利多公司。

1.2.2主要試劑 紅糖(食品級)：廣西馬山南華糖業有限責任公司；YPD培養基和MRS培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；乳酸、乳酸鈉、β-葡聚糖、無水碳酸鈉、乙酸、乙酸鈉、三氯乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉等(均為分析純)：天津凱通化學試劑有限公司；DNS試劑、SOD酶活性試劑盒、脂肪酶活性試劑盒、福林酚溶液、酚酞：生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醇(色譜純)、磷酸(色譜純)、檸檬酸鈉(色譜純)、氫氧化鈉(色譜純)、鹽酸(色譜純)、酪蛋白和L-酪氨酸標準品：默克密理博公司；17種氨基酸標準品：中國食品藥品檢定研究院；沒食子酸、葡萄糖、乳酸標準品：上海源葉生物科技有限公司。

1.3 枇杷酵素的制備無菌水清洗枇杷2～3次，于潔凈處晾干，切片、去除核，按枇杷∶糖∶無菌水為1∶3∶10(質量比)配制，28℃左右自然發酵，發酵時間140 d。定期取樣，將樣品離心后的上清液保存于-80℃超低溫冰箱中待測。

1.4 指標測定

1.4.1有效活菌數的測定 取發酵1、5、20、35、50、65、80、95、110、125和140 d的樣品測定有效活菌數。采用平板菌落計數法，分別用YPD培養基和MRS培養基對發酵液進行選擇培養，測定酵母菌和細菌菌落數。菌落計數方法測定參照GB4789.2-2016《食品微生物菌落總數的測定》。

1.4.2pH值和總酸的測定 取發酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的樣品測定pH值和總酸。使用精密pH計測定酵素樣品的pH值；總酸含量的測定方法參照GB12456-2021《食品中總酸的測定》。

1.4.3有機酸含量的測定 取發酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的樣品測定有機酸含量。測試液以去離子水稀釋10倍后，0.22 μm微孔濾膜過濾后用HPLC測定酵素中的有機酸含量。色譜條件：色譜柱為Kromasil100-5-C18(4.6 mm×250 mm)，流動相為0.1%磷酸溶液-甲醇(97.5%～2.5%)比例的流動相，流速0.6 mL·min-1，柱溫40℃，進樣量20 μL，檢測波長210 nm；結果以乳酸質量濃度g·L-1計。

1.4.4總酚含量的測定 總酚含量測定參照GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》。標準曲線繪制：蒸餾水配制0.1 mg·mL-1的沒食子酸標準溶液；精確量取系列沒食子酸標準溶液(0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 mL)，分別加入10%福林-酚試劑1 mL及7.5%的Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，室溫下避光反應1 h后，在765 nm波長下測定OD值，以測定的OD765值為橫坐標，沒食子酸各溶液的濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

取發酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的樣品測總酚含量，測試液以去離子水稀釋10倍后，量取樣品0.25 mL，加入福林酚試劑1 mL及7.5% Na2CO3溶液2 mL，蒸餾水定容至10 mL，搖勻，室溫下避光反應1 h，測定的OD765值，參照標準曲線定量樣品中總多酚含量。

1.4.5氨基酸含量的測定 取發酵35、80和140 d的發酵液測定氨基酸含量。氨基酸含量的測定方法參照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》。

1.4.6主要功效酶活力測定 取發酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的發酵液測定主要功效酶活力。蛋白酶活力測定參照CB/T 28715-2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》；脂肪酶活力測定參照脂肪酶試劑盒的操作說明；β-葡聚糖酶測定參照NY/T 911-2020《飼料添加劑β-葡聚糖酶活力的測定 分光光度法》；SOD酶活力測定參照SOD酶試劑盒的操作說明。

2 結果與分析

2.1 有效活菌數

由表1可知，枇杷酵素的有效活菌數在發酵過程中呈現不斷上升趨勢，在發酵5 d后，有效活菌數快速上升達到109數量級，發酵140 d有效活菌數保持在108數量級上，說明枇杷酵素菌群生長狀態良好，具有穩定的微生物生態環境。

表1 枇杷酵素發酵過程中有效活菌數的變化

2.2 pH值與總酸

由圖1可知，隨著發酵進程，pH值在20 d內由4.8下降至3.5，后期一直穩定于3.5左右；總酸總體呈現出不斷上升的趨勢，總酸在125 d達到最大值12.5 g·L-1，發酵至140 d后總酸含量有所下降。

圖1 枇杷酵素發酵過程中pH、總酸含量的變化Fig.1 Changes of pH and total acid content in the fermentation process of loquat ferments

2.3 有機酸含量

由圖2可知，枇杷酵素的有機酸含量在1～20 d呈快速上升趨勢，有機酸含量增加至6.26 g·L-1，20～140 d有機酸含量趨于穩定。

圖2 枇杷酵素發酵過程中有機酸含量的變化Fig.2 Changes of the organic acid content in the fermentation process of loquat ferments

2.4 總酚含量

總酚測定的標準曲線見圖3。標準曲線方程為y=0.0049x+0.1025，R2=0.9978線性關系良好。枇杷酵素發酵過程中總酚含量呈現先增后降趨勢，在65 d總酚含量達到0.9 mg· mL-1，到65～140 d后呈下降趨勢。

圖3 總酚測定的標準曲線Fig.3 Standard curve for the determination of total phenols

圖4 枇杷酵素發酵過程中總酚變化Fig.4 Changes of total phenols in the fermentation process of loquat ferments

2.5 氨基酸含量

由表2可知，枇杷酵素含有17種氨基酸，其中含量較高的氨基酸分別為天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸。隨著發酵時間增加，各氨基酸含量在不同階段出現波動變化，總氨基酸含量與必需氨基酸含量逐漸提高，說明一定時間的發酵能提高酵素中蛋白質和氨基酸的含量，且提高程度較明顯。

表2 枇杷酵素發酵過程中氨基酸含量的測定結果

2.6 主要功效酶的酶活力

由圖5可知，枇杷酵素自然發酵過程中不同功效酶酶活力出現波動性變化，其中蛋白酶活力在1～35 d呈逐漸上升趨勢，在發酵35 d時其酶活力最高達15.14 U·mL-1，在發酵35 ～65 d呈現緩慢下降趨勢，65～140 d酸性蛋白酶活性趨于穩定；SOD酶活力在1～65 d階段呈上升趨勢，在發酵65 d時其酶活力最高達42.0 U·mL-1，在發酵65～140 d呈現緩慢下降趨勢；β-葡聚糖酶活性在1～20 d呈上升趨勢，在發酵20 d時其酶活力最高達4.52 U·mL-1，在發酵20～140 d β-葡聚糖酶活性趨于穩定；脂肪酶活力在1～5 d呈現較較快的上升趨勢，并在5 d取得最大值0.12 U·mL-1，然而隨著發酵時間延長，發酵液中脂肪酶活性逐漸降低。

圖5 枇杷酵素發酵過中主要功效酶的變化Fig.5 Changes of the main efficacy enzymes in the fermentation process of loquat ferments

3 結論與討論

本研究對枇杷酵素發酵過程中生物學特性指標(有效活菌數、pH值、總酸、總酚、氨基酸)及功效酶活性(SOD、蛋白酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶)進行動態分析。結果發現，隨著發酵進程，發酵液中有效活菌數保持在108數量級上，有效維持穩定的微生物生態環境，這對發酵過程中代謝產物的變化有著重要影響作用。發酵液的 pH 值先降低后維持穩定在3.5，而總酸含量不斷增加至6.26 g·L-1后趨于穩定，發酵前期總酸含量的快速上升是由于自然發酵過程乳酸菌大量繁殖、代謝活躍，利用發酵液的糖作為碳源發酵產生乙酸、乳酸等有機酸，致使發酵液總酸含量增加、pH值降低[18]。而發酵后期體系中有機酸種類及含量的增加，可抑制部分有害菌生長，pH 值和總酸含量變化均趨于平緩，推測是因為發酵后期營養物質基本被消耗殆盡，微生物代謝緩慢，僅將有機酸等替代碳源維持生命活動，故總酸含量降低[16]。總酚含量在0～65 d呈現上升趨勢，到65～140 d后出緩慢下降趨勢。主要發揮抗氧化性能的物質是多酚類，大分子物質可以在微生物的發酵作用下，轉變成小分子酚類。枇杷酵素含有17種氨基酸，含量較高的氨基酸主要是天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸。隨著發酵時間增加，各氨基酸含量在不同階段出現化，總氨基酸含量與必需氨基酸含量逐漸提高，說明一定時間的發酵能提高酵素中蛋白質和氨基酸的含量，且提高程度較明顯。氨基酸是人體不可或缺的重要物質之一，不僅可以為身體提供能量還可以提高免疫力，具有很高的生物活性[19]。枇杷酵素中不同功效酶的活性變化規律不同，酸性蛋白酶活力在1～35 d呈逐漸上升趨勢，在發酵35 d時其最高酶活力至15.14 U·mL-1，在發酵35 ～65 d呈現緩慢下降趨勢，65～140 d酸性蛋白酶活性趨于穩定。SOD酶活力在1～65 d階段呈上升趨勢，在發酵65 d時其酶活力最高達42.0 U·mL-1，在發酵65～140 d呈現緩慢下降趨勢。脂肪酶在1～5 d呈現較較快的上升趨勢，發酵5 d達到最大值為0.12 U·mL-1，隨著發酵時間延長發酵液中脂肪酶活性逐漸降低。脂肪酶活力較低，這可能與枇杷中脂肪含量較少有關，該結果與報道的水果酵素等一致[20]，由于酵素初期微生物迅速增長，使得體系pH下降至3.5，整體呈酸性，而脂肪酶的最適pH 在中性或堿性范圍內，也可能是發酵過程中其活性較低的原因之一。β-葡聚糖酶活性在1～20 d呈上升趨勢，在發酵20 d時其酶活力最高達4.52 U·mL-1，在發酵20 ～140 d β-葡聚糖酶活性趨于穩定。

枇杷酵素含有多種的功效酶，其中β-葡聚糖酶是一類重要的水解酶，具有抑菌作用且對對植物抗病防御體系中起著重要作用[21-24]。枇杷酵素中含有豐富的β-葡聚糖酶，使用酵素代替部分農藥為解決使用化學農藥殘留的問題提供一個新思路。酵素在建立綠色生態農業，提高農產品質量，以及農業可持續發展中有著廣闊的應用前景，進一步研究酵素中β-葡聚糖酶的功效作用以及開發種類更多、酶活力更高、穩定性和適用性更好的酵素酶具有重要意義。