實時熒光定量PCR檢測肉制品中牛源性成分及其含量

譚 波，楊春萍，劉小玲

(1.廣西大學輕工與食品工程學院, 廣西 南寧 530004; 2.貴州省檢測技術研究應用中心, 貴州 貴陽 550014; 3.貴州省分析測試研究院, 貴州 貴陽 550014)

近年來，隨著全球化經濟的高速發展，人們的物質需求逐漸提升，各種肉類食品的流通和交易也越來越頻繁，這使得一些不法商家為了牟取暴利，以低價肉替代高價肉，導致肉制品摻假事件頻繁發生[1-3]。其中，由于牛肉營養價值高[4-5]，需求量逐年上漲[6]，其摻假問題比較突出。2013年波及歐盟國家“掛牛頭賣馬肉”的“馬肉風波”事件，對歐盟28個成員國的近7300個樣本進行檢測，結果有近4.6%的牛肉產品中檢出馬肉成分，且在被檢出的馬肉中，又有0.5%含有歐盟禁止使用的動物止疼類藥物保泰松[7]。唐穗平等[8]對廣東省牛羊肉及其制品摻雜摻假情況的調查分析發現，牛肉制品摻假率高達20%。這些食品摻假問題嚴重影響著食品安全和消費者權益，然而，目前我國對動物源性成分鑒定的現行標準只能進行定性檢測，無法完成定量分析[9]，且由于檢測靈敏度過高，無法排除生產、貯藏、運輸、銷售等過程中樣品交叉污染或原料帶入造成的污染[10]，很難為市場監管提供有力的技術支撐。因此，建立一種準確、快速的牛源性成分量化檢測的方法意義重大。聚合酶鏈式反應(Polymerase ChainReaction，PCR)是一種基于特異性引物和模板DNA的體外擴增方法[11]，近年來在動植物源性成分檢測方面得到了廣泛的應用[9，12-14]。本研究以牛細胞核單拷貝磷酸二酯酶基因(bosPDE)為靶基因，應用實時熒光定量PCR相對定量方法建立肉制品中牛源性成分及含量的檢測方法，旨在為市場監管及后續相關標準制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉、鴿子肉、鴕鳥肉、豬肉、羊肉、馬肉、驢肉、駱駝肉、梅花鹿肉、兔肉、鱸魚、牛肉、干辣椒、小麥粉購自貴陽市大型農貿市場及網絡購物平臺；廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒(TaKaRa)；6×DNA上樣緩沖液、2×Taqman PCR MasterMix(索萊寶)；100 bp DNA Ladder、TS-GelRed核酸染料、1×TAE速溶顆粒、瓊脂糖(北京擎科)。

1.2 儀器與設備

冷凍離心機(Centrifuge 5481R)，eppendoff；恒溫金屬浴(DKT200-4)，杭州米歐儀器有限公司；迷你離心機(WTL-10K)，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；超微量分光光度計(Deaou-US200)，廣州迪澳生物科技有限公司；小型板式離心機(PlateSmart)，北京鼎昊源科技有限公司；梯度PCR儀(SureCycler 8800)，Agilent Technologies；電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(BIS 910)，北京東勝創新生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(7500)，Applied biosystems。

1.3 試驗方法

1.3.1引物探針設計 采用Laube等[15]研究報道的單拷貝細胞核基因bosPDE引物及探針為本研究的牛特異性引物和探針, 序列為 bosPDE-F:ACTCCTACCCATCATGCAGAT,bosPDE-R:TGTTTTTAAATATTTCAGCTAAGAAAAA, bosPDE-probe: (FAM)-AACATCAGGATTTTTGCTGCATTTGC-(TAMRA); 采用Wang等[16]研究報道的單拷貝細胞核基因LcoR引物及探針為本研究內參的通用性引物及探針, 序列為LcoR-F: CCAGCCAGCCCAATAGCACAA, LcoR-R:GAGGTGAGTCTTGGTCAGCCAT,LcoR-P:(HEX)-TGCYGAAAGCATCTC-(MGB)。 引物及針均交于北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.3.2樣品處理 鮮肉：用無菌剪刀將動物組織表皮去除，剪取適量中間組織于一次性研磨杯中，于試管研磨機8000 r·min-1研磨3～5 min直至組織為勻漿狀。干辣椒：用無菌剪刀將辣椒剪碎至一次性研磨杯中，于試管研磨機8000 r·min-1研磨3～5 min直至組織為粉末狀。

1.3.3樣品DNA提取 取50 mg樣品與1.5 mL離心管，根據DNA提取試劑盒說明書，使用MiniBEST通用基因組DNA提取試劑盒提取辣椒及小麥粉DNA，使用動物基因組DNA提取試劑盒(通用型)提取動物DNA。最終用60 μL Tris-EDTA(TE)緩沖液將提取的樣品DNA 洗脫，使用超微量分光光度計測定DNA純度及濃度。DNA的OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0，可用于DNA擴增，于-20 ℃保存備用。

1.3.4反應條件優化 退火溫度優化：用TE緩沖液將牛肉DNA濃度稀釋至50 ng·μL-1作為上樣模板，參照1.1×T3 Super PCR Mix 說明書推薦的PCR反應體系及程序，使用梯度PCR儀同時對多個退火溫度點的DNA模板進行擴增。反應體系為：1.1×T3 Super PCR Mix 21 μL，10 μmol·L-1上游引物1 μL，10 μmol·L-1下游引物1 μL，模板DNA2 μL；bosPDE反應程序為：98℃，2 min，[98℃，10 s，(46.3℃、47.8℃、50.9℃、52.3℃、53.7℃、54.9℃、58.0℃、60.0℃)72℃，1 min]35個循環，72℃，2 min，4℃保存；LcoR反應程序為：98℃，2 min，[98℃，10 s，(53.2℃、54.6℃、56.0℃、57.2℃、59.6℃、61.9℃、63.2℃、65℃)72℃，1 min]35個循環，72℃，2 min，4℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物，確認PCR反應退火溫度。

熒光PCR引物、探針濃度優化：確認PCR反應退火溫度后，將引物、探針濃度稀釋至10 μmol·L-1后按表1反應體系分別進行PCR試驗，優化PCR引物、探針濃度。

表1 引物探針濃度優化反應體系

1.3.5引物特異性驗證 分別以雞肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉、鴿子肉、鴕鳥肉、豬肉、羊肉、馬肉、驢肉、駱駝肉、梅花鹿肉、兔肉、鱸魚、牛肉、干辣椒、小麥粉DNA為模板，用bosPDE引物及探針按照1.3.4優化后的反應條件進行實時熒光PCR擴增，驗證bosPDE引物及探針的特異性。

1.3.6內參引物通用性驗證 分別以雞肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉、鴿子肉、鴕鳥肉、豬肉、羊肉、馬肉、驢肉、駱駝肉、梅花鹿肉、兔肉、牛肉DNA為模板，濃度均稀釋至50 ng·μL-1，用LcoR引物及探針按照1.3.4優化后的反應條件進行實時熒光PCR擴增，驗證內參引物及探針的通用性。

1.3.7靈敏度試驗 將牛肉DNA濃度稀釋至100 ng·μL-1，然后按10倍系列梯度稀釋，即濃度分別為100、10、1、0.1、 0.01、0.001 ng·μL-1，用超純水作為空白對照進行PCR試驗。

1.3.8牛源性定量標準曲線建立 精確稱取勻漿后牛肉和豬肉，按質量比混合，制備牛肉含量分為1 %、10%、20%、40%、60%、80%、100%的混合樣品作為標準品，提取DNA，將濃度均稀釋至50 ng·μL-1，進行實時熒光PCR 反應。以LcoR作為內參基因，以牛肉含量為1%的樣品為對照，以超純水為空白對照，樣品和對照設置2個平行反應體系，分別進行目的基因和內參基因擴增，用Ct平均值，采用相對定量法△Ct值與2△△Ct值線性模型分別建立標準曲線。

1.3.9模擬混合樣品驗證 以牛肉：豬肉質量百分比為35%、50%、65%、90%模擬混合樣提取DNA，將濃度均稀釋至50 ng·μL-1，進行實時熒光PCR 反應。按1.3.4優化后的方法進行擴增，將Ct 平均值帶入所建立的標準曲線中計算牛肉成分含量，驗證方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 反應條件優化

2.1.1退火溫度優化bosPDE及LcoR各退火溫度點下的PCR擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。bosPDE退火溫度在53.7℃以后擴增產物電泳條帶清晰度開始降低，且在60.0℃時無擴增條帶；LcoR退火溫度在61.9℃后擴增產物電泳條帶單一且清晰；為防止非特異擴增及引物二聚體出現，本試驗選擇51℃和63℃分別作為bosPDE及LcoR的PCR反應程序退火溫度點。

注：A為bosPDE各退火溫度點下的PCR擴增產物凝膠電泳結果，1～8分別對應退火溫度46.3℃、47.8℃、50.9℃、52.3℃、53.7℃、54.9℃、58.0℃、60.0℃的電泳結果；B為LcoR各退火溫度點下的PCR擴增產物凝膠電泳結果，9～16分別對應退火溫度53.2℃、54.6℃、56.0℃、57.2℃、59.6℃、61.9℃、63.2℃、65℃的電泳結果；M為100 bp DNA Ladder圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 2 % agarose gel electrophoresis diagram

2.1.2熒光PCR引物、探針濃度優化bosPDE及LcoR引物、探針濃度優化實時熒光定量PCR擴增見圖2，Ct值見表2。由表2可見，bosPDE及LcoR探針取用量為0.5 μL時的Ct值均高于探針取用量為1 μL時的Ct值，即兩個靶基因探針取用量在0.5 μL時的擴增效果比1 μL時的低。且bosPDE引物取用量在0.5、1 μL時，探針取用量為0.5 μL時Ct值的離散程度比1 μL時的高；LcoR引物取用量0.5、1、1.5、2 μL時，探針取用量為0.5 μL時Ct值的離散程度比1 μL時的高。為了試驗高效快捷，方便計算，本試驗選擇引物、探針用量均為1 μL時的濃度為優化后的最適引物、探針濃度。

注：A、B分別為不同濃度bosPDE、LcoR引物、探針實時熒光定量PCR擴增曲線圖2 實時熒光定量PCR擴增曲線Fig.2 Amplification curve of the real-time fluorescence quantitative PCR

表2 不同濃度bosPDE及LcoR引物、探針實時熒光定量PCR擴增Ct值

表3 LcoR引物對14種畜禽肉DNA擴增Ct值

2.2 引物特異性驗證

目的基因bosPDE引物特異性試驗結果見圖3，bosPDE引物僅對牛肉DNA進行擴增，對雞肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉、鴿子肉、鴕鳥肉、豬肉、羊肉、馬肉、驢肉、駱駝肉、梅花鹿肉、兔肉、鱸魚、牛肉、干辣椒、小麥粉DNA均無擴增效果，由此可見，bosPDE引物特異性高，符合試驗要求。

圖3 bosPDE引物對17種動植物DNA擴增曲線Fig.3 DNA amplification curves of 17 kinds of animals &plants by bosPDE primers

2.3 內參引物通用性驗證

內參基因LcoR引物對雞肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉、鴿子肉、鴕鳥肉、豬肉、羊肉、馬肉、驢肉、駱駝肉、梅花鹿肉、兔肉、牛肉14種常見畜禽肉DNA擴增Ct值見表4。除超純水外，14種常見畜禽肉均有典型擴增曲線，因此，LcoR可以作為內參基因使用。

表4 不同牛肉含量的標準品Ct值結果

2.4 靈敏度試驗

為檢測bosPDE引物靈敏度，將牛肉DNA稀釋至不同濃度后進行檢測，結果見圖4。當牛肉DNA濃度為0.01 ng·μL-1仍可明顯看到PCR擴增曲線。因此，本方法檢測靈敏度可達0.01 ng·μL-1。

圖4 bosPDE引物對不同濃度牛肉DNA的擴增曲線Fig.4 Amplification curves of beef DNA with different concentrations by bosPDE primers

2.5 牛源性定量標準曲線建立

不同牛肉含量的標準品用bosPDE及LcoR引物、探針經熒光定量PCR擴增反應后Ct值見表4。以△Ct值(△Ct= CtbosPDE- CtLcoR)為縱坐標，以標準品牛肉含量百分比的對數值為橫坐標建立標準曲線見圖5。以2△△Ct值(△△Ct=△Ct對照-△Ct,△Ct對照=CtbosPDE,1%牛肉樣品- CtLcoR,1%牛肉樣品)為縱坐標，以標準品牛肉含量百分比為橫坐標建立標準曲線見圖6。標準曲線回歸公示分別為y=-3.0965x+8.4797，R2=0.998；y=0.7122x+3.0504，R2=0.9887。R2均大于0.980，符合實時熒光定量PCR國際化標準-MIQE 指南要求[17]，均具有良好的線性關系。

圖5 △Ct值與牛肉含量對數值建立的標準曲線Fig.5 Standard curve established by △Ct value and the logarithmic value of beef content

圖6 2△△Ct值與牛肉含量建立的標準曲線Fig.6 Standard curve established by 2△△Ct value and beef content

2.6 模擬混合樣品驗證

將牛肉質量百分比為35%、50%、65%、90%模擬混合樣品，經熒光定量PCR擴增后平均Ct值分別代入基于△Ct值與2△△Ct值建立的標準曲線計算牛肉成分含量，并計算回收率，以驗證定量檢測結果的準確性，結果見表5、表6。基于△Ct值建立的標準曲線檢測的模擬混合牛肉含量的回收率在94.30%～102.52%，基于2△△Ct值建立的標準曲線檢測的回收率在98.55%～106.30%。基于△Ct值計算的試驗結果總體偏低，基于2△△Ct值計算的實驗結果總體偏高，取兩者平均值后結果見表7，回收率在96.42%～104.42%，由圖7可知，其回收率最接近100%，即準確度最高。試驗表明，取△Ct值與2△△Ct值模型計算結果后的平均值，得出的牛肉成分含量與實際牛肉成分含量準確度得到提高，可為后期相關檢測方法及標準的建立提供參考。

注：A為基于2△△Ct值線性模型結果回收率，B為基于△Ct值線性模型結果回收率，C為A和B結果平均值回收率圖7 3種方法結果的回收率比較分析Fig.7 Comparative analysis of the recovery rates of the three methods and results

表5 △Ct值模擬混合肉樣檢測結果

表6 2△△Ct值模擬混合肉樣檢測結果

表7 △Ct值與2△△Ct值線性模型均值處理后的混合肉樣檢測結果

3 討論與結論

隨著肉類摻假案例的暴露，肉類摻假檢測技術也隨之成了食品安全問題研究的熱點，主要研究方法有傳統的形態學方法、基于光譜的檢測方法、基于蛋白的檢測方法和基于核酸的檢測方法[2]。其中，基于核酸的實時熒光定量PCR技術靈敏度高、特異性強，在實現肉制品中動物源性成分的定量檢測研究中得到廣泛應用[18-19]。目前已報道的實時熒光定量PCR技術量化分析方法主要為基于線粒體DNA[17，20-21]和細胞核單拷貝DNA[22-23]兩種。然而，由于同一物種在相同組織的不同時期或不同組織間的線粒體DNA拷貝數差異顯著[24-25]，不適用于定量分析。核DNA 的拷貝數因其在不同品種動物組織中具有良好的穩定性[26]，近年來成為物種源性成分定量檢測研究的熱點。雖然，目前已報道的動物源性成分定量檢測方法層出不窮，但尚無可推廣的國家標準方法發布。本研究以牛細胞核單拷貝磷酸二酯酶基因(bosPDE)特異的細胞核單拷貝基因為研究對象，通過實時熒光相對定量法△Ct值與2△△Ct值分別建立標準曲線，取兩者的平均值，建立了肉制品中牛源性成分及含量的檢測方法。研究結果表明，該方法特異性強、靈敏度高，準確度也均比△Ct值或2△△Ct值曲線所得結果的準確度高。本研究建立的方法可準確識別出肉制品中是否含有牛肉成分，并可用于牛肉摻入豬肉或污染豬肉后牛肉含量的量化檢測，可為肉制品市場監管及相關標準制定提供有力的科學依據。