一種高產(chǎn)琥珀酸耐鹽酵母菌的篩選及應(yīng)用研究

◎ 滑歡歡，梁 亮，扈圓舒，潘麗娟，黃敏斯，尹何南，吳嘉怡

（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528400）

醬油是以大豆和小麥為主要原料，經(jīng)多種微生物共同作用而形成的具有特殊色、香、味、體的調(diào)味品。風(fēng)味是醬油的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，為了滿足消費(fèi)需要和行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力，提高醬油風(fēng)味是當(dāng)下亟待解決的問題。

在醬油發(fā)酵過程中，因微生物作用產(chǎn)生的醇、醛、酸、酯類物質(zhì)，是醬油風(fēng)味形成的主要物質(zhì)或前體，一般分為揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)2 大類。其中，有機(jī)酸占非揮發(fā)性物質(zhì)中的主要部分，而用于醬油釀造中的酵母菌是產(chǎn)有機(jī)酸的主要微生物。

與醬油風(fēng)味直接相關(guān)的耐鹽酵母菌主要有魯氏接合酵母菌、異變球擬酵母菌等，是醬油發(fā)酵過程中經(jīng)常被利用的微生物。其主要進(jìn)行酒精發(fā)酵，也會(huì)參與醬油發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)酯類、呋喃類、酮類以及琥珀酸的生成，是醬油發(fā)酵過程中的主發(fā)酵酵母菌。有研究表明，高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油樣品中的揮發(fā)物，發(fā)酵主要揮發(fā)物質(zhì)是酸類和醇類，分別占總含量的47%和14%。由此可見，高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油樣品中酸類物質(zhì)的含量與其風(fēng)味息息相關(guān)[1]。

醬油中的有機(jī)酸以乳酸、乙酸為主，醬油的香氣主要來自有機(jī)酸含量的高低，而且有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)高鹽稀態(tài)工藝發(fā)酵醬油中高鹽分帶來的不適口感，在所有風(fēng)味物質(zhì)中，構(gòu)成醬油風(fēng)味的骨架體系為醇類、酯類和酚類，其中，酯類物質(zhì)所占比重最大，而有機(jī)酸是酯類的前體物質(zhì)。

醬油的有機(jī)酸中，風(fēng)味好的醬油一般乳酸含量較高；草酸會(huì)給醬油帶來澀感；甲酸和乙酸有刺激性氣味，會(huì)給醬油帶來不好的味道，在醬油中含量不宜太高；琥珀酸或其鹽類，具有貝類特殊滋味，是唯一一種可以提高醬油鮮味的有機(jī)酸。琥鉑酸鈉熱穩(wěn)定性好，溶解性也較好，可以提高醬油風(fēng)味[2]。其可以單獨(dú)使用，也可以和谷氨酸鈉一起使用，能起醬油增鮮的作用。目前，在醬油發(fā)酵過程中，能產(chǎn)生琥珀酸的微生物只是酵母菌，同時(shí)，酵母菌也會(huì)產(chǎn)生對(duì)醬油風(fēng)味不好的有機(jī)酸，如草酸、甲酸和乙酸。

因此，本文經(jīng)過誘變選育得到一株能夠高產(chǎn)琥珀酸，且不產(chǎn)乙酸和甲酸的耐鹽酵母菌M03，在醬油發(fā)酵階段添加此酵母菌，能夠顯著提高醬油中琥珀酸的含量，從而提高醬油的鮮味和風(fēng)味品質(zhì)[3]。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)主要材料

黃豆、小麥、食鹽、麥芽汁培養(yǎng)基、碳酸鈣、瓊脂粉、葡萄糖等，購(gòu)于市場(chǎng)；滬釀3.042 米曲霉菌種（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司）。

1.2 主要設(shè)備

ARTP 誘變系統(tǒng)、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、耐鹽菌擴(kuò)培系統(tǒng)、種曲機(jī)、發(fā)酵罐等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分離培養(yǎng)基及分離方法

選出風(fēng)味柔和、無刺激酸味且氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到1.1 g/100 mL 的發(fā)酵罐，送檢總酸、琥珀酸等指標(biāo)，確定目標(biāo)醬醪。

耐鹽酵母菌的分離：麥芽汁培養(yǎng)基（1 L）、食鹽100 g、瓊脂粉20 g、0.3%碳酸鈣，采用平板涂布法進(jìn)行分離。

1.3.2 出發(fā)菌株的分離與篩選

選用一罐發(fā)酵90 d 的生醬油，鮮味十足，風(fēng)味柔和，無刺激酸味，且氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到1.1 g/100 mL；采用添加0.3%碳酸鈣的高鹽麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行涂布分離，挑取透明圈比較小的10 株酵母菌，命名為SY01、SY02、SY03、SY04、SY05、SY06、SY07、SY08、SY09、SY10；取成熟大曲2 kg，分成10 份，分別與600 g、濃度為20 波美的鹽水混合，制成醬醪，將初篩得到的10 株酵母菌，按照6‰比例添加至醬醪初期（制醪時(shí)添加），30 ℃恒溫發(fā)酵120 d，過濾得到生醬油。送檢生醬油琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸態(tài)氮等理化指標(biāo)，挑選表現(xiàn)最好的菌株作為基礎(chǔ)菌株進(jìn)行誘變選育[4]。

1.3.3 出發(fā)菌株的誘變及篩選

以醬醪中分離得到的高產(chǎn)琥珀酸的酵母菌為基礎(chǔ)菌株，采用ARTP 技術(shù)對(duì)初發(fā)菌株進(jìn)行誘變，并以致死率等為指標(biāo)，誘變時(shí)間為變量確定誘變參數(shù)，獲得突變菌株；使用添加0.3%碳酸鈣的高鹽麥芽汁平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。在添加0.3%碳酸鈣的高鹽麥芽汁平板培養(yǎng)基中，挑取與初發(fā)菌株M02 相比具有透明圈小的菌落，進(jìn)行初篩得到10 株正突變株，命名為SY11、SY12、SY13、SY14、SY15、SY16、SY17、SY18、SY19、SY20，再進(jìn)行醬醪發(fā)酵復(fù)篩。

初篩方法：將含有酵母菌的樣品采用添加3‰的高鹽（10%）麥芽汁培養(yǎng)基平板進(jìn)行涂布分離，觀察平板上單菌落的透明圈大小，透明圈越小，說明產(chǎn)總酸越低。復(fù)篩方法：挑取透明圈小的單菌落，于液體高鹽（10%）麥芽汁培養(yǎng)基中，得到培養(yǎng)菌液；將培養(yǎng)菌液按照6‰的比例添加至初期醬醪中，進(jìn)行30 ℃恒溫發(fā)酵120 d，得到原油，按照常規(guī)方法檢測(cè)生醬油中琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸態(tài)氮等理化指標(biāo)。

1.3.4 誘變菌株M03 遺傳穩(wěn)定性的研究

將誘變獲得的酵母菌在液體高鹽（10%）麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代10 次，將第1 代、第5 代和第10 代菌株的培養(yǎng)液，添加至初期醬醪中，30 ℃恒溫發(fā)酵90 d，過濾得到原油，檢測(cè)原油中琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸態(tài)氮等理化指標(biāo)在各代之間穩(wěn)定[5]。

1.3.5 誘變得到的酵母菌M03 在釀造醬油中的應(yīng)用

誘變獲得的目標(biāo)酵母菌按照生產(chǎn)工藝進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，按照6‰的比例添加至初期醬醪中，發(fā)酵180 d，得到原油，對(duì)比發(fā)酵原油中琥珀酸、甲酸、乙酸、總酸等含量，并感官鑒評(píng)原油風(fēng)味[6]。

2 試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 出發(fā)菌株的分離與篩選

由表1 結(jié)果可知，經(jīng)分離得到的酵母菌菌株，添加至醬醪初期，得到的原油添加酵母菌SY7 后，原油中琥珀酸含量最高，揮發(fā)性酸甲酸和乙酸明顯降低，總酸也大大降低。從理化指標(biāo)可以看出，菌株SY7 效果最優(yōu)，命名為酵母菌M02，并將此菌株作為出發(fā)菌株，進(jìn)行ARTP 誘變選育。

表1 添加不同酵母菌菌株發(fā)酵原油的理化結(jié)果分析表（檢測(cè)結(jié)果單位：g/100 mL）

2.2 出發(fā)菌株的誘變及篩選

由圖1、表2 可知，本文以基礎(chǔ)菌種M02 為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP 誘變，初篩得到10 株突變菌株，添加至醬醪初期經(jīng)發(fā)酵得到的原油，添加突變菌株SY16后，原油中琥珀酸含量與出發(fā)菌株相比提高45%，未檢出甲酸和乙酸，總酸也大大降低，與出發(fā)菌株相比下降11.7%。從理化指標(biāo)可以看出，菌株SY16 效果最優(yōu)，命名為M03[7-8]。

圖1 誘變后涂布分離平板正反面透明圈的大小圖

表2 添加不同突變菌株發(fā)酵原油的理化結(jié)果分析表（檢測(cè)結(jié)果單位：g/100 mL）

2.3 誘變菌株M03 遺傳穩(wěn)定性的研究

如表3 所示，從發(fā)酵原油的理化及培養(yǎng)液的理化結(jié)果來看，酵母菌M03 遺傳穩(wěn)定性良好。

表3 酵母菌株傳代穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表（檢測(cè)結(jié)果單位：g/100 mL）

2.4 誘變得到的酵母菌M03 在釀造醬油中的應(yīng)用

由表4 結(jié)果顯示，采用酵母菌株M03 發(fā)酵得到的原油，氨基酸態(tài)氮含量略高于出發(fā)菌株，琥珀酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株，乙酸和甲酸產(chǎn)率特別低。由此可見，將酵母菌株M03 應(yīng)用于醬油釀造，可明顯改善醬油的風(fēng)味，提高醬油品質(zhì)，降低醬油釀造成本。

表4 出發(fā)菌株M02 和誘變菌株M03 發(fā)酵原油的理化結(jié)果對(duì)比表（檢測(cè)結(jié)果單位：g/100 mL）

此外，本文還召集20 名有豐富經(jīng)驗(yàn)的鑒評(píng)人員進(jìn)行感官鑒評(píng)，感官鑒評(píng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括鮮味、酸味、香氣、刺激性，分值為0～5 分，評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)越高，該項(xiàng)指標(biāo)越好。綜合評(píng)價(jià)指的是樣品的綜合感官、整體給評(píng)價(jià)員的感官，鑒評(píng)結(jié)果見表5。

表5 添加酵母菌發(fā)酵原油感官鑒評(píng)打分結(jié)果表

由表5 感官結(jié)果可知，酸味和刺激性是相反的，分值越高，原油風(fēng)味越差，酸味突出，有一股刺激性的味道彌散開來。結(jié)果顯示，添加誘變酵母菌M03 后，發(fā)酵原油的觀感鑒評(píng)綜合結(jié)果最優(yōu)。

綜上所述，添加酵母菌M03 發(fā)酵醬油，可以顯著改善醬油口感和風(fēng)味，全面提升醬油質(zhì)量，應(yīng)用前景廣闊。

3 結(jié)論

本文經(jīng)過誘變選育得到一株高產(chǎn)琥珀酸的耐鹽酵母菌M03，且該酵母菌不產(chǎn)乙酸和甲酸等揮發(fā)性有機(jī)酸；采用酵母菌株M03 發(fā)酵得到的原油，氨基酸態(tài)氮含量略高于出發(fā)菌株，琥珀酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株，乙酸和甲酸產(chǎn)率特別低。可見，將酵母菌株M03 應(yīng)用于醬油釀造，可明顯改善醬油的風(fēng)味，提高醬油品質(zhì)，降低醬油釀造成本。