植物精油納米乳液對魔芋毛肚保鮮研究

◎ 杜丹丹，蘇馨蓮，王兆明,，周 輝,

（1.蒙城綠色食品產業研究院，安徽 蒙城 233500；2.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

魔芋葡甘聚糖（Konjac Glucomannan，KGM）是從魔芋中提取的一種中性多糖，其具有良好的保水性、流變性、增稠性和膠凝性，被廣泛應用于食品、生物醫學、工業、農業等領域[1]。魔芋葡甘聚糖可作為制作仿生食品的原料，如魔芋素毛肚、素蝦仁等。由于魔芋葡甘聚糖具有降低血糖水平、抗肥胖、抗癌、抗膽固醇、提高免疫力和改善便秘等功效，魔芋產品在市場上備受消費者的喜愛[2-3]。然而，魔芋產品貨架期短，需相關人員進一步研究魔芋制品易感腐敗微生物，開發綠色防腐技術，以延長其產品貨架期。

丁香、大蒜、肉桂在食品工業中作為調味劑被廣泛使用，丁香、大蒜、肉桂精油均具有較好的抗菌活性[4]。SUSANA 等[5]發現，在沙拉醬中使用丁香精油納米乳液可以抑制酵母菌的生長繁殖。SAGAR等[6]比較了涂有丁香納米乳液和未涂精油納米乳液的雞爪，觀察到涂有丁香納米乳液的雞爪保質期更長，且納米乳液在較長時間內保持了產品的質量和感官屬性。大蒜精油可抑制腐乳中蠟樣芽孢桿菌的生長，在天然定向防腐劑方面具有很大的潛力[7]。研究表明，肉桂精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌具有較強的抑菌性[8]，使用肉桂精油作為活性劑的納米乳液，對不同微生物表現出了優異的抗菌性能[9-10]。PUNCHARAT 等[9]研究發現，與丁香精油相比，丁香精油納米乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌表現出更好的抗菌活性。

本試驗以玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉和植物精油（肉桂精油、大蒜精油、丁香精油）為基本成分，制備精油納米乳液，并將其應用于魔芋素毛肚保鮮，再通過菌落總數、乳液表征等指標，評價植物精油納米乳液對魔芋素毛肚的保鮮效果，以篩選出抑菌效果最佳的納米乳液，為魔芋制品的綜合利用與開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

魔芋膠（成都晗晨生物科技有限公司）；檸檬酸（浙江一諾生物工程有限公司）；乙酰化雙淀粉己二酸酯（河南萬邦化工科技有限公司）；氫氧化鈣（江西明源高新技術材料有限公司）；玉米蛋白、大豆分離蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；肉桂精油、大蒜精油、丁香精油（仲景食品有限公司）；PCA 培養基、CFC 培養基、不動桿菌培養基、孟加拉紅培養基（青島海博生物技術有限公司）。

1.2 儀器設備

高剪切乳化均質機（上海三申醫療器械有限公司）；全自動旋蒸儀（鄭州長城科工貿有限公司）；離心機（安徽寶萊科技有限公司）；HH 數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；真空包裝機（安盛科技有限公司）。

1.3 樣品制備

1.3.1 魔芋樣品制備

將9 g 淀粉與10.5 g 魔芋粉混勻，再加入300 mL 蒸餾水，在60 ℃下水浴糊化30 min，再加入1% Ca(OH)2溶液50 mL，高速攪打混勻，在90 ℃下水浴蒸煮2 h，使用400 mL 2%檸檬酸溶液脫堿30 min，漂洗之后，加入適量香辛料（食用油、鹽、五香粉和辣椒粉），攪拌均勻，真空包裝備用。

1.3.2 植物精油納米乳液制備

本研究參考HUA 的方法[11]，用玉米醇溶蛋白和75%乙醇配制成20 mg·mL-1的玉米醇溶蛋白溶液，磁性攪拌器攪拌過夜；用酪蛋白酸鈉和純水配制成4 mg·mL-1的酪蛋白酸鈉，磁性攪拌器攪拌過夜。磁性攪拌器攪拌酪蛋白酸鈉的同時，用移液槍將20 mg·mL-1的玉米醇溶蛋白溶液按1∶10 的比例逐滴滴入4 mg·mL-1的酪蛋白酸鈉溶液，繼續磁性攪拌30 min。將混合液倒入旋轉式蒸發器中進行乙醇蒸發，水浴溫度40 ℃，轉速20 r·min-1，蒸發至液體基本上無氣泡。為防止液體倒流現象，乙醇蒸發過程中需要加入一些氣體。蒸發完成后，倒入量筒中，加純水至蒸發前混合液體積，4 ℃冰箱中保存備用。向上述溶液中分別加入1% v/v 肉桂、丁香、大蒜精油，以15 000 r·min-1的速度在均質機中均質3 min（每均勻40 s，停止20 s）。

1.4 腐敗菌鑒定和分離

參考江楊陽[12]的方法略作修改。將5 g 樣品混合在45 g 無菌生理鹽水中，均質，將1 mL 樣品液加入裝有9 mL 無菌生理鹽水試管中，適量稀釋。取3 種相鄰濃度梯度（10-4、10-5、10-6）的樣品液各0.1 mL涂敷在PCA（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）培養基、孟加拉紅培養基（全部真菌）、CFC 培養基（假單胞菌）和不動桿菌培養基（不動桿菌）等平板上封口膜密封培后，放到適宜溫度的恒溫培養箱中培養1～2 d，通過各培養基上菌落生長情況及菌落總數，判斷導致樣品腐敗的主要微生物及優勢菌種。

1.5 抑菌效果

將10 g 樣品分別添加適量3 種乳液拌勻真空分裝后，以不加精油乳液的樣品作為對照組，將4 組樣品分別在25 ℃與4 ℃下貯藏，25 ℃下貯藏的樣品在2、4、6、8、10、12 d 進行分析，4 ℃下貯藏的樣品在3、6、9、12、15、18 d 進行分析。將不同時間的樣品接種于優勢腐敗菌的選擇性培養基上進行菌落總數檢定，根據菌落生長情況，篩選出對優勢腐敗菌抑菌效果最好的精油乳液。

1.6 抑菌活性

（1）最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的測定采用二倍稀釋法[13]。以96孔無菌培養板為基礎，在每個孔板中加入100 μL 相應菌株的液體培養基，第1 行加入100 μL 無菌水作為陰性對照，第12 行加入100 μL 菌培養液作為陽性對照；抑菌劑倍比稀釋方法：在第2 行加入 3 種植物精油納米乳液100 μL，吹吸3 次后，吸取100 μL 加入下一行中（初始精油納米乳液濃度為50 mg·mL-1）。直到11 排，11 排吹吸混勻，取100 μL 棄用。最后，于2～12 行各加入菌懸液100 μL，在36 ℃下培養36～48 h。

（2）最小抑菌濃度的判斷。如果菌液是透明的，則該濃度下精油納米乳液顯示出抑菌作用；如果菌液渾濁，有沉淀物或絮狀懸浮物，或在液面以下或孔壁上形成一層菌膜，則該濃度下精油納米乳液無抑菌作用。在此基礎上，分別測定每種抑菌劑在培養板上對單株細菌的MIC 值。

1.7 乳液濃度優化

對篩選出的乳液設置0.2%、0.4%、0.6%、0.8% v/v和1.0% v/v 的精油濃度梯度，以原樣品為對照組進行抑菌活性檢定，篩選出合適的精油濃度。

1.8 植物精油納米乳液表征

（1）粒徑、PDI、Zeta電位測定。為了避免多次散射，用蒸餾水將乳液稀釋100 倍。利用Zeta 電勢分析儀測量溶液的顆粒大小、多分散度分布指數（Polydiseperse Index，PDI）、Zeta 電位。每個樣品重復3 次取平均值。

（2）貯藏穩定性。取50 mL 各濃度梯度乳液于密封樣品瓶中，在4 ℃和25 ℃下分別放置0、4、8、12、16 d，在每個測定點處測定粒徑和Zeta 電位。

1.9 數據與分析

結果采用平均值表示，用Origin 2021 對數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 3 種植物精油納米乳液的抑菌效果

《蒟蒻（魔芋）素食品》（Q/LHJS0001S—2019）規定，魔芋制品中菌落總數不應高于5 l g CFU·g-1。由圖1 可知，室溫組（25 ℃）各微生物的對數生長期主要在0～4 d，冷藏環境（4 ℃）下微生物對數生長期主要在0～9 d，在對數生長期，大腸桿菌與金黃色葡萄球菌都在迅速增長。在之后的貯藏期內，菌落總數趨于穩定，如室溫組的金黃色葡萄球菌甚至出現菌落數回落的現象，說明第12 d，樣品內的營養物質減少或有害廢物積累到一定程度后使腐敗菌不再生長，金黃色葡萄球菌的生長已經達到了峰值室溫下對照組樣品在第4 d 便已超過閾值，為5.5 l g CFU·g-1，肉桂、丁香、大蒜納米精油乳液分別將魔芋制品中菌落總數超標的期限延長至12、10、8 d，說明3 種精油納米乳液對樣品的微生物生長均具有抑制效果，且肉桂精油的抑菌能力明顯高于其他2 種精油，因此選用肉桂精油進行濃度優化實驗。由4 ℃冷藏組的菌落生長情況可以看出，低溫對腐敗菌的生長有抑制效果，與植物精油納米乳液對樣品腐敗菌的抑制具有協同作用。

圖1 添加3 種精油納米乳液的樣品菌株濃度分析圖

2.2 精油納米乳液抑菌效果分析

根據各個培養基的菌落生長情況，發現孟加拉紅培養基、CFC 培養基、不動桿菌培養基的各梯度菌落生長情況幾乎為0，而PCA 培養基的菌落生長情況良好。根據菌落的顏色與形態判斷導致樣品腐敗的主要微生物為金黃色葡萄球菌，另有極少量腸桿菌存在。MIC 測定結果驗證了3 種精油納米乳液對樣品平板計數分離出來的2 種單菌株的抑菌能力大小，并具體顯示了其產生抑菌效果的濃度范圍。由表1 可知，肉桂精油納米乳液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌較敏感，丁香精油納米乳液對大腸桿菌較為敏感，大蒜精油納米乳液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌敏感度較低。金黃色葡萄球菌的總體抑菌效果為肉桂精油>丁香精油>大蒜精油；大腸桿菌的總體抑菌效果為丁香精油=肉桂精油>大蒜精油，說明肉桂精油納米乳液的抑菌效果較好。因此，選擇肉桂精油納米乳液進行表征和優化。

表1 3 種精油對2 種細菌的最小抑菌濃度表

2.3 肉桂精油納米乳液濃度優化實驗

設置肉桂精油體積濃度梯度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。由圖2 可知，在室溫條件下，肉桂精油納米乳液的抑菌能力與精油濃度成正相關，且濃度為0.8%與1.0%時的菌落生長情況相近，說明在0.8%的肉桂精油濃度下納米乳液的抑菌能力已接近飽和。

圖2 不同濃度肉桂精油納米乳液的抑菌能力圖

2.4 植物精油納米乳液表征

粒度、PDI、Zeta 電位是評價乳狀液系統均勻度和穩定性的重要指標[14]。當PDI＜0.3，Zeta 電位≥30 mV 或≤-30 mV 時，該體系的穩定性良好[11]。由圖3 可知，肉桂精油納米乳液Zeta 電位的絕對值均＞30 mV；肉桂精油納米乳液的粒徑隨著肉桂精油體積濃度的增大而增大；肉桂精油體積濃度為0.2%、0.4%、0.6%和0.8%時，PDI＜0.3，表明這4 個濃度梯度的肉桂精油納米乳液體系較為穩定。

圖3 各濃度梯度肉桂精油納米乳液的Zeta 電位、粒徑與PDI 圖

肉桂精油納米乳液在室溫（25 ℃）和冷藏（4 ℃）條件下貯藏過程中的平均粒徑以及Zeta 電位變化見圖4、圖5。2 種貯藏條件下肉桂精油的體積濃度為0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的乳液在貯藏過程中粒徑變化較小；肉桂精油體積濃度為0.4%、0.6%、0.8%乳液的Zeta電位的絕對值在貯藏期高于30 mV。一般認為，Zeta 電位絕對值在25 mV 以上的乳液體系，具有足夠的電斥力以避免乳液顆粒聚集[15-16]。同時，Zeta 電位值為負，表明液滴帶有負電荷，在貯藏過程中可以提供靜電斥力抑制乳液發生絮凝的現象。因此，添加肉桂精油0.4%、0.6%、0.8%的納米乳液貯藏穩定性較好。

圖4 肉桂精油納米乳液貯藏過程中平均粒徑變化圖

圖5 肉桂精油納米乳液貯藏過程中Zeta 電位變化圖

3 結論

本研究通過比較分析3 種植物精油納米乳液對魔芋素毛肚的抑菌能力，篩選出最適精油。結果顯示，①魔芋素毛肚的致腐微生物主要為金黃色葡萄球菌，同時存在少量大腸桿菌，換言之，金黃色葡萄球菌為魔芋制品中的優勢腐敗菌。②經過平板涂布計數與MIC 測定實驗證明，肉桂精油對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的組合具有最好的抑菌效果。③對肉桂精油濃度梯度進行優化實驗，通過抑菌能力實驗、粒徑、Zeta 電位、PDI 和貯藏穩定性等方法發現，0.8%體積濃度的肉桂精油納米乳液的綜合性能最強，抑菌效果最好。因此，本研究結果可以為魔芋制品的綠色保鮮研究提供參考。