高效液相色譜（二極管陣列檢測器）法測定河粉中米酵菌酸含量

◎ 許和強，魯長海，曾 軍

（廣電計量檢測集團股份有限公司，廣東 廣州 510405）

河粉形狀扁寬，是廣東、海南、廣西、福建、湖南等地區一種大眾化的特色傳統食品，是將米洗凈后磨成粉，加水調制成糊狀，上籠蒸制成片狀，冷卻后劃成條狀而成。米酵菌酸是由椰毒假單胞菌酵米面亞種產生的一種可引起食物中毒的毒素[1]。椰毒假單胞菌可利用任何有機物快速生長繁殖，在溫度和濕度適宜的條件下即可產生大量的米酵菌酸。米酵菌酸通過抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉位酶而產生毒性作用，致死率高[2]。2018—2020 年，廣東省共報告發生與河粉類食品相關米酵菌酸中毒事件5 起，報告中毒病例21人，死亡9 人，病死率為42.9%。其中，2018 年報告事件2 起，發病8 人，死亡5 人；2020 年報告事件3 起，發病13 人，死亡4 人，另有1 人放棄治療出院后因家屬拒絕聯系而失訪，預后不明[3]。

經研究發現，米酵菌酸食入后經消化道吸收、經血液散布全身后可損傷人的肝臟、腦、腎及心臟等器官[4]，嚴重可致死亡。美國《食品毒理學》報道，米酵菌酸的人體致死劑量為1～1.5 mg[5]，即一個體重60 kg 的成年人（血液總量約為4200～4800 mL），血液中米酵菌酸的含量達到200～300 μg·L-1即可達到致死劑量。結合GB 5009.189—2016《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》[6]，該標準的適用范圍為銀耳及其制品、發酵米面及其制品，未包含引起本次事件的食品基質（河粉）。基于此，本研究針對現行標準和河粉生產行業的實際情況，建立了河粉中米酵菌酸殘留量的檢測方法，旨在有效降低檢驗檢測設備成本，提升河粉生產企業自檢/送檢意愿，進一步杜絕類似事件發生，進而為河粉行業提供有效把控食品安全的方法和經驗。

1 材料與方法

1.1 設備和試劑

1.1.1 儀器設備

沃特世Waters 2695 高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器；色譜柱：Waters Symmetry C18 250×4.6 mm，5 μm；分析天平：千分之一天平；超聲波振蕩器；恒溫水浴鍋；旋轉蒸發儀；固相萃取裝置；氮吹儀；渦旋振蕩器。

1.1.2 試劑材料

固相萃取柱：陰離子交換柱（60 mg/3 mL）（Waters）；甲醇（CH3OH）：色譜純；氨水（NH3·H2O）；甲酸（CH2O2）；甲醇-氨水溶液：準確吸取80 mL 甲醇于100 mL 容量瓶中，然后加入1.0 mL 氨水，再用一級水定容至100 mL，混勻；甲酸-甲醇溶液（2%）：準確量取2.0 mL甲酸于100 mL 容量瓶中，再用甲醇稀釋，并定容至100 mL；實驗用水為一級水。

1.1.3 標準品

米酵菌酸（C28H38O7，CAS 號：11076-19-0）：純度≥95%，或經國家認證并授予標準物質證書的米酵菌酸標準物質。

標準溶液配制：①米酵菌酸標準儲備液（濃度0.1 mg·mL-1）。準確稱取米酵菌酸標準品1.00 mg（精確至0.01 mg），隨后用甲醇溶解并轉移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容。②米酵菌酸標準工作液。按照濃度分別吸取米酵菌酸標準儲備液，用甲醇稀釋定容至10 mL 容量瓶中，分別配制成米酵菌酸濃度為0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1的系列標準工作溶液，即配即用。

1.2 使用方法

1.2.1 樣品前處理

鮮（濕）試樣經剪碎、勻漿后，稱取樣品5 g 于50 mL 離心管中，加入30 mL 甲醇－氨水溶液。混勻，置于超聲波振蕩器中超聲提取1 h，過濾。合并濾液，取濾液30 mL，將濾液全部轉移到已活化的陰離子固相萃取交換柱中，并依次用5 mL 水和5 mL 甲醇進行淋洗，流出液倒入廢液桶，真空抽干萃取柱，再用6 mL 甲酸-甲醇溶液（2%）進行洗脫。接著，收集洗脫液，將洗脫液置于（40±0.5）℃水浴中用氮氣吹干，然后加入1.0 mL 甲醇，渦旋溶解，混勻，使用有機濾膜（0.45 μ 微孔）過濾后進行高效液相色譜分析，同時做空白對照實驗。

1.2.2 方法條件

流動相條件：甲醇75+水25，用甲酸將pH 調至2.5；設定流速：1.0 mL·min-1；設置柱溫：30 ℃；檢測光譜波長：267 nm；進樣量：20 μL。

標準品譜圖見圖1。

圖1 米酵菌酸的標準溶液圖（濃度0.500 μg·mL-1）

2 結果與分析

用河粉樣品進行定量限：0.15 μg·g-1濃度水平進行預實驗，實驗結果如表1，譜圖見圖2。實驗結果表明，在河粉基質加標中定量限濃度水平基本滿足信噪比要求（≥10），目標物出峰處前后干擾小，較好的滿足定量要求。

表1 預實驗結果表

圖2 樣品加標譜圖

采用平行加標（n=6）進行回收率及精密度實驗，實驗結果見表2。結果顯示，平均加標回收為104%，RSD 為3.7%，說明實驗方法比較準確且精密度較好。

表2 加標回收及精密度實驗結果表

3 結語

綜上所述，本方法使用甲酸-甲醇溶液（2%）萃取洗脫凈化，在該色譜條件下，進行了加標回收測試和實際樣品檢測。結果表明，該方法不僅可以較好地完成河粉中米酵菌酸含量的萃取和測定，方法可靠、精密度良好，而且可以在不需要昂貴檢測設備的情況下，滿足檢測要求，能夠為河粉等米制品生產經營企業，提供較便利的檢測方式。