枇杷中產乙醇酵母的分離鑒定與生物學特性研究

◎ 佀勝利，吳超群，申 娜，彭明引

（凱里學院大健康學院，貴州 凱里 556011）

關鍵字：產乙醇酵母；分離鑒定；生物學特性；枇杷果實

枇杷是亞熱帶特色水果，果肉酸甜多汁，含有大量的碳水化合物、維生素及多種礦物質[1]。由于出果期短，枇杷鮮果難以長期保存[2]。枇杷酒是以枇杷為原料，采用酵母菌發酵而成的一種低度飲料酒[3-4]。其中，酵母的種類對枇杷酒的口感、香氣和質量都會產生一定的影響[5]。因此，本研究從枇杷果實中分離篩選乙醇產量高的酵母菌，并進行生物學特性研究，旨在為選育用于枇杷酒釀造的專用酵母提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

枇杷產地為貴州省凱里市。

YPD 培養基：酵母膏10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1，115 ℃滅菌30 min；制備固體培養基再加入20 g·L-1瓊脂。紅四氮唑（TTC）上層培養基：葡萄糖5 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。TTC 配成濃度為0.05 g·mL-1的母液，過濾除菌后避光低溫保存。使用時，待溶解的葡萄糖瓊脂培養基溫度降至40～50 ℃時，向培養基中加入1%TTC 母液，混合均勻后制成TTC 上層培養基。

1.2 儀器與設備

立式高壓蒸汽滅菌器（LDZF-75L，上海申安）；潔凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州安泰）；霉菌培養箱（MJ-150-I，上海一恒）；液相色譜（LC20，島津）。

1.3 方法

1.3.1 產乙醇酵母的分離與純化

將新鮮采集的枇杷果實帶回實驗室后，用純凈水沖洗果實表面，破碎后稱取5 g，加入裝有45 mL 無菌水的三角瓶中，28 ℃下150 r·min-1振蕩培養24 h，得到天然酵母菌懸液。將菌懸液依次稀釋至10-7，取稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液200 μL 均勻涂布于YPD 平板上，28 ℃靜置培養24 h。挑選與酵母菌菌落形態相似的單菌落，以平板劃線的方式接種在新的YPD 平板上，純化后編號菌株，并保存備用。

1.3.2 產乙醇酵母的篩選

（1）初篩。在YPD 平板上培養菌株1～2 d，待長出明顯的菌落，將融化并配制好的TTC 上層培養基緩慢傾倒其上，避光培養3 h，選取菌落顏色為深紅色的菌株進行后續試驗。

（2）復篩。將初篩得到的菌株制作菌懸液，按5%接種量接種到裝有杜氏小管的YPD 液體培養基中，28 ℃靜置發酵48 h，每隔4 h 加以觀察，并記錄杜氏小管的充氣情況。發酵結束后，取一定體積的發酵液，用液相色譜測定發酵液中殘留葡萄糖濃度和發酵產生的乙醇濃度。

1.3.3 產乙醇酵母的分子生物學鑒定

將復篩得到的酵母菌株送往上海生物工程公司進行26S rDNA D1/D2 區域序列純化擴增和測序，將得到的測序結果與GenBank 數據庫中已知序列進行同源比對，找出與其相似性較高的菌株及代表菌株，構建系統發育樹圖譜，確定菌株的分類地位。

1.3.4 產乙醇酵母的生物學特性試驗

（1）種子培養液的制備。將復篩得到的菌株接種在YPD 液體培養基中，28 ℃下150 r·min-1振蕩培養24 h，將菌液的酵母細胞數調整到105·mL-1，制得種子培養液。

（2）溫度對酵母菌株發酵產乙醇的影響。按照5%的接種量，將種子培養基分別接種至含有杜氏小管的YPD 液體培養基中，在23、28、33、38 ℃溫度下靜置培養48 h，每隔4 h 觀察杜氏小管的充氣情況。每個溫度下接種3 個平行。

（3）初始pH 對酵母菌株發酵產乙醇的影響。按照5%的接種量，將種子培養基分別接種至初始pH 為4.0、6.0、8.0、10.0 的含有杜氏小管的YPD 液體培養基中，在各菌株的最適生長溫度下靜置培養48 h，每隔4 h 觀察杜氏小管的充氣情況。每個pH 下接種3 個平行。

1.3.5 發酵液中葡萄糖和乙醇濃度測定方法

采用液相色譜法分析發酵液中的物質濃度，色譜柱為Shedox Sugar SH1011，流動相為5 mmol·L-1的硫酸溶液，洗脫方式為等梯度洗脫，流動相流速為0.8 mL·min-1，進樣量為10 μL，柱溫為60 ℃，檢測器為示差折光檢測器。

2 結果與討論

2.1 產乙醇酵母的分離純化與篩選

經過富集培養和稀釋涂布，從枇杷果實中分離純化得到類似酵母菌的菌株30 株，編號為LY1-LY30。對30 株酵母菌進行TTC 顯色反應，LY3、LY5、LY13、LY15、LY18 共5 株酵母菌株呈紅色，其余無明顯變化。將這5 株菌株進行靜置發酵，定期觀察杜氏小管產氣情況，結果如表1 所示。由表1 可知，LY3、LY5、LY15 起酵較快；16 h 內，杜氏小管充滿氣體，LY13 和LY18 產氣較慢。

表1 天然酵母菌株發酵杜氏小管滿氣所需時間表

靜置發酵48 h 后，測定發酵液中的乙醇和葡萄糖濃度，結果如圖1 所示，LY3、LY5、LY15 的乙醇濃度較高且均超過5 g·L-1。同時，以上菌株發酵液中殘留葡萄糖較少，均低于0.01 g·L-1。因此，結合發酵產氣情況，將LY3、LY5 和LY15 共3 個菌株作后續研究。

圖1 酵母菌發酵液中葡萄糖濃度（A）和乙醇濃度圖（B）

2.2 產乙醇酵母的分子生物學鑒定

對產乙醇酵母的26S rDNA D1/D2 區序列在Gene Bank 數據庫中進行同源比對，LY3 與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）的相似度較高，在99.66%～100%之間；LY5 和LY15 與罕見有孢漢遜酵母（H.occidentalis）的相似度較高，在99.31%～100%之間。對3 株酵母菌株與有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中代表種的模式菌株進行序列比對和系統發育樹構建，如圖2 所示。LY3 與葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）關系較近，可以認為是同一個種；LY5、LY15 與罕見有孢漢遜酵母（H.occidentalis）關系較近，可以認為是同一個種。

圖2 產乙醇酵母菌株的26S rDNA 系統發育樹圖

2.3 產乙醇酵母的生物學特性

2.3.1 不同溫度下酵母發酵產乙醇情況

觀察酵母發酵過程中杜氏小管的充氣情況，以研究溫度對酵母發酵產乙醇的影響，結果如圖3 所示。其中，3 株菌株杜氏小管充滿最快的發酵溫度都是28 ℃；LY3在33 ℃和38 ℃下杜氏小管沒有充氣，LY5 和LY15 在38 ℃時杜氏小管沒有充氣，說明相應溫度下沒有CO2和乙醇的生成，LY5 和LY15 產乙醇性能對溫度的耐受性更強；LY5 在33 ℃時，杜氏小管充滿氣體的時間比23 ℃時早8 h，說明LY5 在33 ℃的條件下，發酵乙醇的速度更快，即對溫度脅迫的耐受性最強。

圖3 溫度對酵母菌株LY3（A）、LY5（B）、LY15（C）發酵產氣的影響圖

2.3.2 不同初始pH 條件下酵母發酵產乙醇情況

觀察不同pH 下各產乙醇酵母發酵過程中杜氏小管的充氣情況，研究初始pH對酵母發酵產乙醇的影響，結果如圖4 所示。LY3 在初始pH 6.0 時產氣速度最快，LY5 和LY15 在初始pH 4.0 時最快，說明pH 條件對酵母菌發酵產乙醇的影響具有菌株個體差異性。隨著堿性條件的增強，4 個菌株發酵產乙醇速度都呈現一定的延滯；初始pH 為10.0 時，LY3 的產氣延滯期最短，說明LY3 對pH 的耐受性較好。

圖4 初始pH 對酵母菌株LY3（A）、LY5（B）、LY15（C）發酵產氣的影響圖

3 結語

本研究從枇杷果實中分離得到30 株菌落形態類似酵母菌的菌株，通過TTC 顯色反應初篩和液體發酵產物測定結合產氣能力評價復篩，得到3 株發酵產乙醇能力較強的酵母菌株。經分子生物學鑒定，LY3 為葡萄汁有孢漢遜酵母，LY5、LY15 為罕見有孢漢遜酵母；溫度對各菌株發酵產乙醇性能的影響表明，LY5對溫度的耐受性較好；初始pH 對各菌株發酵產乙醇性能的影響表明，LY3 對初始pH 的耐受性較好。