子宮內(nèi)膜腺體圖像識別技術(shù)與胞飲突檢測在子宮內(nèi)膜容受性評價中的一致性比較

朱閩波，陳良，施政，陳麗萍，胡敏

目前，體外授精-胚胎移植（IVF-ET）已經(jīng)成為治療不孕癥的重要手段。其中胚胎質(zhì)量以及子宮內(nèi)膜容受性是決定IVF-ET 成功與否的關(guān)鍵。近年來，眾多研究提出，胞飲突是一項敏感性非常高的用于評價子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志，豐富并處于成熟期的胞飲突提示子宮內(nèi)膜容受性良好，其功能可能與囊胚定位附著、著床的啟動有關(guān)。胞飲突是由腫脹的微絨毛融合而成，其發(fā)育過程包括發(fā)育中、成熟、退化三個階段，一般認為胞飲突出現(xiàn)于分泌中期（排卵后第6 ～9 天），表達持續(xù)時間不超過48 h，與子宮內(nèi)膜“種植窗”期一致[1]。本研究利用已發(fā)表的專用圖像識別軟件，采集宮腔鏡下子宮內(nèi)膜腺體圖像，進行腺體密度及開口大小的識別。同時在術(shù)中采集子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，通過掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜胞飲突的數(shù)量及形態(tài)。通過以上兩種技術(shù)手段評估子宮內(nèi)膜容受性，并追蹤患者妊娠結(jié)局，評價子宮內(nèi)膜腺體圖像識別技術(shù)及胞飲突檢測對于子宮內(nèi)膜容受性的評估價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020 年1—12 月在寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF-ET治療的不孕癥患者67 例，年齡23 ～34 歲；不孕年限1 ～8 年；其中原發(fā)不孕30 例，繼發(fā)不孕37 例。平時月經(jīng)周期規(guī)律，無子宮及卵巢手術(shù)史，無內(nèi)分泌相關(guān)疾病，無子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病。所有患者均在手術(shù)前1 ～3 個月經(jīng)周期內(nèi)行控制性超促排卵治療，未行胚胎移植術(shù)。宮腔鏡手術(shù)當(dāng)月行排卵監(jiān)測，于排卵后3 ～5 d行宮腔鏡檢查，術(shù)中探查無子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)粘連等異常發(fā)現(xiàn)，并于宮腔鏡手術(shù)后3 個月經(jīng)周期內(nèi)進行胚胎移植。所有患者中確診臨床宮內(nèi)妊娠45 例（妊娠組），即早孕期B 超檢查提示宮內(nèi)妊娠，見孕囊發(fā)育（孕囊三徑線平均值＞10mm），妊娠結(jié)局包含足月分娩、早產(chǎn)、中期引產(chǎn)及早期人工流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)。未宮內(nèi)妊娠22 例（未妊娠組），包括HCG 陰性、生化妊娠（HCG 陽性，B 超未見妊娠，月經(jīng)自然來潮）以及異位妊娠（非宮腔內(nèi)妊娠，不包括宮角妊娠）。

1.2 方法

1.2.1 宮腔鏡手術(shù) 宮腔鏡手術(shù)均由寧波市婦女兒童醫(yī)院北婦一科完成，采用丙泊酚靜脈麻醉+喉罩輔助通氣。手術(shù)時間選擇經(jīng)排卵監(jiān)測證實排卵后第3 ～5 天（種植窗口期前后2 d 內(nèi)）進行。手術(shù)儀器為德國Storze 宮腔檢查鏡，手術(shù)開始前用白平衡卡進行白平衡校正。手術(shù)中置入宮腔鏡探查整個宮腔，明確無宮腔粘連、畸形、宮腔及宮頸管異常占位后，經(jīng)宮腔鏡操作孔置入帶刻度的硬膜外導(dǎo)管，以宮腔底部居中處為宮腔鏡屏幕中心，以帶有刻度的硬膜外導(dǎo)管垂直達到宮腔底部后實測距離鏡頭1cm為基準(zhǔn)，調(diào)整焦距后縮回硬膜外導(dǎo)管，采集子宮內(nèi)膜圖像，圖像分辨率統(tǒng)一為1 920×1 080 像素，圖像采集完成后，經(jīng)宮腔鏡操作孔置入微型抓鉗，抓取圖像采集處子宮內(nèi)膜標(biāo)本。

1.2.2 子宮內(nèi)膜腺體圖像識別 使用計算機圖像識別軟件[EM-eye識別系統(tǒng)2.0（內(nèi)測版）]對采集的子宮內(nèi)膜圖像（裁為正方形后為1080×1080 像素）進行子宮內(nèi)膜腺體識別、計數(shù)及開口大小計算。子宮內(nèi)膜腺體開口大小計算方法為圖像識別所有腺體后，計算所有腺體所占據(jù)像素點（picture point，PP）后求取平均值。

1.2.3 子宮內(nèi)膜胞飲突檢測 手術(shù)中所取得子宮內(nèi)膜標(biāo)本經(jīng)0.9%氯化鈉注射液漂洗3 次，投入至少10倍于標(biāo)本體積的2.5%戊二醛固定液（pH 值7.2 ～7.4），于4 ℃保存待制片。制成電鏡標(biāo)本后即采用掃描電子顯微鏡觀察胞飲突數(shù)量、形態(tài)及覆蓋面積。其中，胞飲突形態(tài)主要依據(jù)其發(fā)育狀態(tài)的分級情況進行判定，分為4 級，分別為發(fā)育前（封三彩圖2）、發(fā)育中（封三彩圖3）、發(fā)育完全（封三彩圖4）、退化中（封三彩圖5）。覆蓋面積即胞飲突占子宮內(nèi)膜表面面積的百分比，每份樣本隨機選取8 個區(qū)域，放大3000倍進行胞飲突計數(shù)，計算每份樣本放大3000 倍下單張圖片胞飲突平均數(shù)量，并依據(jù)胞飲突覆蓋面積進行分級，完全未覆蓋（0%）計0 分，少量覆蓋（≤20%）計1 分，中等覆蓋（21%～50%）計2 分，大量覆蓋（＞50%）計3 分，最后根據(jù)妊娠結(jié)局對胞飲突分級進行比較。

圖2 胞飲突發(fā)育之前，體積較小，表面微絨毛可見

圖4 胞飲突發(fā)育完全，表面光滑，絨毛幾乎消失

圖5 退化中的胞飲突，表面再次出現(xiàn)皺褶及微絨毛，體積變大

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 妊娠組與未妊娠組平均年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、胚胎移植當(dāng)日子宮內(nèi)膜厚度、胚胎移植數(shù)量及不孕情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)、胞飲突數(shù)量及發(fā)育狀態(tài)分級比較 妊娠組子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)、子宮內(nèi)膜腺體開口大小均高于未妊娠組（均P ＜0.05），妊娠組單張圖片胞飲突平均計數(shù)高于未妊娠組（P ＜0.05），兩組發(fā)育狀態(tài)分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見表2。

表2 兩組子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)、胞飲突數(shù)量及發(fā)育狀態(tài)分級比較

2.3 胞飲突計數(shù)與子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)、腺體開口大小的相關(guān)性 胞飲突計數(shù)與子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)、腺體開口大小均呈正相關(guān)（r=0.468、0.456，均P ＜0.05）。

3 討論

在IVF-ET治療的多個階段中，隨著促排卵治療方案的持續(xù)改進以及人工授精技術(shù)的逐步成熟，卵子的受精率已經(jīng)達到了70%以上，優(yōu)質(zhì)胚胎率也逐步提升，同時隨著囊胚序貫培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟，已經(jīng)能夠?qū)⑴咛ピ隗w外延伸培養(yǎng)到囊胚階段[2]。但是胚胎移植后的妊娠率卻始終無法得到明顯提升，臨床累計妊娠率均為55%～65%。其中獲胚率與妊娠率之間的差別體現(xiàn)了子宮內(nèi)膜容受性以及胚胎移植后卵巢反應(yīng)性在妊娠結(jié)局中所起到的重要作用，而其中子宮內(nèi)膜容受性更是最主要的原因[3]。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜允許胚胎黏附、侵入并誘導(dǎo)內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生一系列變化，最終使胚胎得以植入的一種能力，這一時期稱為“種植窗”[4]。目前，超聲檢查仍是臨床應(yīng)用最普遍的子宮內(nèi)膜容受性評價方法[5]。此外還有子宮內(nèi)膜蛋白組學(xué)[6]、子宮內(nèi)膜脂質(zhì)介質(zhì)[7]等多種方式，但均存在一定局限性。

胞飲突作為目前較為公認的子宮內(nèi)膜容受性檢測的標(biāo)志物，在本研究中得到了證實。本研究結(jié)果顯示妊娠組胞飲突計數(shù)及發(fā)育狀態(tài)分級得分均高于未妊娠組（均P＜0.05），這提示如果根據(jù)胞飲突檢測的結(jié)果制定胚胎移植時間，可獲得更高的臨床妊娠率。但受限于高分辨率掃描電鏡的設(shè)備普及率較低，檢測成本較高，時效性較差的緣故，使胞飲突檢測作為子宮內(nèi)膜容受性評價的一種有效方法而無法廣泛應(yīng)用。

Sakumoto 等[8]于1992 年即報道了通過宮腔鏡檢查分泌中期子宮內(nèi)膜形態(tài)，并根據(jù)子宮內(nèi)膜表面腺體開口大小及血管分布情況，將子宮內(nèi)膜分為分為“good”和“poor”組，發(fā)現(xiàn)“good”組在IVF-ET時妊娠率高于“poor”組。但受限于宮腔鏡設(shè)備的清晰度及計算機圖像處理技術(shù)，僅依賴于手術(shù)醫(yī)師的經(jīng)驗進行子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)評估，存在較大的主觀性。

目前高清宮腔鏡手術(shù)設(shè)備的廣泛使用，子宮內(nèi)膜圖像的分辨率已經(jīng)達到10m 級別，結(jié)合日益發(fā)展的計算機軟硬件技術(shù)，對子宮內(nèi)膜圖像進行計算機軟件識別成為可能。2018 年，本課題組制作了一個針對性的子宮內(nèi)膜腺體識別軟件[EM-eye 識別系統(tǒng)1.0（內(nèi)測版）]，驗證了利用圖像識別技術(shù)獲得子宮內(nèi)膜腺體密度以評價子宮內(nèi)膜容受性的可行性[9]。

本研究再次受到課題組支持，對原有的子宮內(nèi)膜腺體識別軟件進行進一步升級、迭代，增加了子宮內(nèi)膜腺體開口大小的識別。同時本研究利用掃描電鏡對宮腔鏡術(shù)中獲取的子宮內(nèi)膜組織進行胞飲突檢測及分級，驗證了胞飲突檢測在子宮內(nèi)膜容受性的有效性[8]。本研究結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)及子宮內(nèi)膜腺體開口大小與胞飲突檢測結(jié)果存在相關(guān)性。。因此，利用圖像識別技術(shù)對子宮內(nèi)膜容受性進行評價具有較高的可行性。同時，圖像識別技術(shù)具有實時性、經(jīng)濟性的特點，具有較好的推廣價值。

本研究也存在有一定局限性，子宮內(nèi)膜腺體圖像的采集視角目前依舊借助于帶有刻度的導(dǎo)管進行定位，仍缺少可投入使用的用于宮腔內(nèi)精確計量的刻度工具。目前，激光測量工具正在逐步實現(xiàn)微型化，遠期如能借助激光測距原理實現(xiàn)在宮腔內(nèi)的精確測量，必將有助于圖像識別準(zhǔn)確度的進一步提升。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 朱閩波：實驗操作、論文撰寫；施政、陳麗萍、胡敏：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析；陳良：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持