CXCR4-3’-UTR 雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及與microRNA-494 的靶向作用

林海霞，舒丹樺

腎臟纖維化被認(rèn)為是導(dǎo)致慢性腎臟疾病和終末期腎功能衰竭的常見途徑。CXCR4 在慢性腎臟疾病，如特發(fā)性膜性腎病、糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等疾病進(jìn)展中起著重要的作用，它主要存在于腎小管細(xì)胞尤其是近端腎小管細(xì)胞中[1-3]。CXCR4 在介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷和腎臟纖維化中起著重要的作用，其可通過JAK/STAT/GSK3 信號通路激活-catenin，促進(jìn)腎臟纖維化；因此，靶向抑制CXCR4表達(dá)，以及抑制多條下游信號通路，可延緩慢性腎病腎纖維化的進(jìn)展[4]。miRNA 屬于一類內(nèi)源性小的非編碼RNA，長度通常為19 ～22 個核苷酸，通過翻譯抑制mRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[5]。它們是腎臟形態(tài)發(fā)生變化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miRNA表達(dá)的失調(diào)參與多種腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制，miRNA控制腎臟祖細(xì)胞的存活和凋亡之間的平衡[6]，除外腎臟發(fā)育過程中的需求外，miRNA還參與調(diào)節(jié)成熟腎單位的許多生物過程[7]。前期研究[8]使用莖環(huán)實時熒光定量PCR（RT- qPCR）檢測到大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F）在轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF- 1）3 ng/ml 刺激下microRNA-494（miR-494）表達(dá)升高，并且膠原蛋白I（Col I）、纖維連接蛋白（FN）mRNA 表達(dá)顯著升高，表明miR-494 可能參與調(diào)控并促進(jìn)TGF- 1 誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)分泌。本研究運用Pathway 和Gene Ontology（GO）預(yù)測miR-494 的靶基因，為臨床防治腎間質(zhì)纖維化提供新的靶點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自美國Gibico公司，DMEM/F12 培養(yǎng)基購自美國Gibico公司，脂質(zhì)體2000 購自美國Invitrogen 公司，蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司，DuaL-Glo Luciferase Assay System 熒光檢測試劑盒購自美國Promega 公司，熒光素酶報告基因pMIR 購自美國Abcam 公司，熒光素酶報告基因pRLSV40 購自美國Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析運用 Pathway 和GO 預(yù)測miR-494 的靶基因，并預(yù)測CXCR4 mRNA 3’-UTR與miR-494 的結(jié)合位點，應(yīng)用Prime Primer 5.0 軟件設(shè)計CXCR4 基因引物。

1.2.2 野生型目的基因（wt）合成 PCR 擴(kuò)增體系：GoTaq Mix 20l，模板DNA 4l，CXCR4-wt-3’-UTR-F 1.2l，CXCR4-wt-3’-UTR-R 1.2l，滅菌雙蒸水13.6l，總體積40l。95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性1 min，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增35 個循環(huán)，72 ℃最后延伸5 min，擴(kuò)增片段長度為280 bp。取5l PCR 產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中，在100 V 電壓下電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。使用PCR純化試劑盒對剩余PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.3 突變型目的基因（mut）合成 依據(jù)預(yù)測的結(jié)合位點堿基序列，隨機(jī)改變其中5 個堿基片段，合成兩段長42 ～46 bp 的互補(bǔ)DNA 單鏈CXCR4-mut-3’-UTR-F、CXCR4-mut-3’-UTR-R（表1），分別用DEPC水配置成100mol/L的工作液，反應(yīng)體系：5×退火 Buffer 10l，CXCR4-mut-3’-UTR-F 8l，CXCR4-mut-3’-UTR-R 8l，滅菌雙蒸水24l，總體積50l。95 ℃條件下5 min，冷卻1 h。產(chǎn)物為5’端帶有Spe I 酶切位點、3’端帶有Pme I 酶切位點的雙鏈DNA片段，長度為46bp。并用PCR純化試劑盒純化。

表1 雙熒光素酶報告基因載體引物序列

1.2.4 目的片段的克隆 純化的DNA 目的片段（CXCR4-wt/mut）與pMCm-T 連接。連接體系：pMCm-T載體1l，目的基因純化產(chǎn)物4l，10×Ligation Buffer 1l，50% PEG 1l，滅菌雙蒸水2l，T4 DNA Ligase 1l，總反應(yīng)體系10l。16 ℃連接2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5（轉(zhuǎn)化流程：取200l DH5 感受態(tài)細(xì)胞冰上靜置至融化后加入上述連接載體并輕彈混勻→冰上靜置30min→42℃水浴90s→再次冰上靜置5 min→加入500l 不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min、搖菌1 h）后，取50l 菌液接種于表面涂布含有20l 100 mmol/L IPTG 和100l 20 mg/ml X-gal 的Amp+LB 平板（37 ℃預(yù)熱1 h），倒置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱過夜，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。次日，挑取數(shù)個藍(lán)色的單克隆菌落置于3 ml LB 培養(yǎng)基中37 ℃250 r/min搖菌過夜，并按質(zhì)粒小抽試劑盒說明書提取質(zhì)粒，按順序?qū)Ω鱾€質(zhì)粒進(jìn)行編號。

1.2.6 CXCR4 基因3’UTR端熒光素酶報告基因的構(gòu)建及鑒定 分別對pMCm-T-CXCR4-wt/mut 載體和pMIR載體進(jìn)行雙酶切，酶切體系為pMIR/pMCm-T-CXCR4-wt/mut 4l，SpeI 限制性內(nèi)切酶0.5l，PmeI 限制性內(nèi)切酶0.5l，10×Buffer 2l，滅菌蒸餾水13l，總反應(yīng)體系20l。在37 ℃水浴中進(jìn)行酶切3 h。完成后于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離酶切產(chǎn)物，在紫外燈下切下含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，AXYGEN膠回收試劑盒回收目的片段。T4 DNA連接酶連接經(jīng)雙酶切后的pMIR 載體和CXCR4 3’UTR-wt/mut 片段，連接體系：CXCR4 3’UTR-wt/mut 片段10l，pMIR 載體2l，T4 DNA 連接酶1l，10×Buffer 2l，滅菌蒸餾水5l，置PCR 儀中16 ℃連接16 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 ，接種于Amp+LB培養(yǎng)板。挑取數(shù)個菌落進(jìn)行菌落小搖、質(zhì)粒抽提、雙酶切鑒定，酶切鑒定陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序過程由上海桑尼生物科技有限公司完成，組載體命名為pMIR-CXCR4-wt/mut。

1.2.7 雙熒光素酶活性檢測 將NRK49F細(xì)胞均勻種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（5 萬細(xì)胞/孔），用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至30%～40%，分別用脂質(zhì)體2 000 瞬時轉(zhuǎn)染NRK49F 細(xì)胞。共分4 組：pMIR-CXCR4-3’-UTRwt +miR-494 mimics 組、pMIR-CXCR4-3’-UTR-wt+陰性對照組（NC）組、pMIR-CXCR4-3’-UTR-mut +miR-494 mimics 組、miR-494 組+NC 組。重組載體、pRLSV40 內(nèi)參質(zhì)粒、miR-494 mimics 及NC 共轉(zhuǎn)染NRK-49F 細(xì)胞48 h 后，分別檢測海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶活性，并求出相對熒光素酶活性值。用Promega 公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System 試劑盒進(jìn)行雙熒光素酶報告基因檢測。從恒溫培養(yǎng)箱中取出已轉(zhuǎn)染的NRK-49F 細(xì)胞板，留75l原培養(yǎng)基（其余培養(yǎng)基棄去），平衡至室溫。向每孔加入75l Dual-Glo?Luciferase Reagent，混勻，孵育10 min，讓細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至不透光96 孔板，然后在全波長掃描式多功能讀數(shù)儀中檢測螢火蟲熒光。每孔中加入75l Dual-Glo?Stop&Glo Reagent，混勻，孵育10 min，測量海腎熒光。以兩側(cè)檢測結(jié)果的比值代表各孔樣本的相對熒光強(qiáng)度，實驗重復(fù)3 次。各實驗組以陰性對照組為1，獲得mimics 組的相對熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨立樣本 檢驗，多組比較采用單因素方差分析。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-494 靶基因的預(yù)測結(jié)果 找到 12 個miR-494 相關(guān)的靶基因，并成功預(yù)測CXCR4 mRNA 3’-UTR 端與miR-494 的結(jié)合位點，見圖1。應(yīng)用Prime Primer 5.0 軟件設(shè)計構(gòu)建含Spe I 酶切位點（ACTAGT）及Pme I 酶切位點（GTTTAAAC）的CXCR4基因引物，見表1。

圖1 microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測CXCR4 mRNA與miR-494 的結(jié)合位點

2.2 測序結(jié)果 經(jīng)過基因序列比對后發(fā)現(xiàn)，野生型和突變型CXCR4 3’-UTR 的基因序列與原序列并未發(fā)生改變，說明CXCR4 3’-UTR 雙熒光素酶報告載體構(gòu)建成功，見圖2 ～3。

圖2 熒光素酶報告載體pT-CXCR4-wt 部分測序圖

圖3 熒光素酶報告載體pT-CXCR4-mut 部分測序圖

2.3 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果 與野生型質(zhì)粒（pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR）+miR-NC 組相比，野生型質(zhì)粒（pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR）+miR-494 mimics 組熒光素酶的相對表達(dá)量降低了約52%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=9.638＜0.05）；突變型質(zhì)粒（pMIRCXCR4-mut-3’-UTR）+ miR-NC 組與突變型質(zhì)粒（pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR）+ miR-494 mimics 組的熒光素酶的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=0.104，＜0.05），見表2。

表2 CXCR4 螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性比值

3 討論

腎臟纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)、肌成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的過度和持續(xù)積累，導(dǎo)致腎功能的進(jìn)行性喪失[9]。許多趨化因子可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，其中CXCL12/CXCR4 在各種細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，參與成纖維細(xì)胞的激活、增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[10-12]，CXCL12/CXCR4 的生物軸在多種器官纖維化中起著重要作用，因此，它們是非常具有前途的抗纖維化治療靶點[13]。在單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中，腎小管細(xì)胞中的CXCR4 基因和蛋白水平顯著上調(diào)，導(dǎo)致血小板衍生生長因子- 、TGF-1 mRNA 表達(dá)增加，提示TGF-1 的增加與腎臟纖維化有關(guān)，而抑制CXCR4 的表達(dá)可減輕腎纖維化[14]。Tang 等[15]也證明了CXCL12/CXCR4 可通過Wnt途徑，使得-SMA表達(dá)增加，e-鈣黏蛋白表達(dá)減少，從而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），而促進(jìn)腎纖維化。

miR-494 模擬物可抑制乳腺癌細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)水平，通過抑制Wnt/ -catenin途徑，抑制細(xì)胞增殖和侵襲；而miR-494 抑制物則增強(qiáng)CXCR4蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖和浸潤，CXCL12/CXCR4是預(yù)防乳腺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的潛在治療靶點[16]。miR-494-3p 的過度表達(dá)還可能通過調(diào)控CXCR4 mRNA，從而在前列腺癌中發(fā)揮作用[17-18]。

本研究通過生物信息學(xué)的相關(guān)方法和有關(guān)靶點的預(yù)測軟件，成功篩選出了miR-494的靶基因CXCR4及結(jié)合位點，并且成功構(gòu)建CXCR4 3’-UTR 的雙熒光素酶報告基因載體，并驗證miR-494 和CXCR4 之間存在靶向關(guān)系。另外在雙熒光素酶報告基因的實驗中發(fā)現(xiàn)miR-494 可以降低野生型CXCR4-3’-UTR的雙熒光素酶活性，但是對于突變型CXCR4-3’-UTR的雙熒光素酶活性則沒有抑制作用。本研究確定了miR-494 同CXCR4 基因的靶向調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步研究其在腎間質(zhì)纖維化機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 林海霞：實驗設(shè)計、研究實施、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析/解釋、撰寫文章；舒丹樺：研究實施、數(shù)據(jù)采集