密斑刺鲀(Diodon hystrix)fshβ和lhβ基因的克隆及表達(dá)分析*

郭煜文 李奕凱 戴明姝 梁雋浩 黃彥霖 李廣麗 陳華譜

密斑刺鲀(Diodon hystrix)fshβ和lhβ基因的克隆及表達(dá)分析*

郭煜文 李奕凱 戴明姝 梁雋浩 黃彥霖 李廣麗 陳華譜①

(廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心 廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實(shí)驗(yàn)室 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東湛江 524088)

密斑刺鲀()是南海名特優(yōu)魚類, 同時(shí)具備食用和中藥保健價(jià)值, 但目前關(guān)于密斑刺鲀生殖生理的研究較少, 影響了該魚繁育理論研究的發(fā)展。眾所周知, 促性腺激素(Gonadotropic hormone, GtH)是生殖調(diào)控的關(guān)鍵激素之一, 在生殖調(diào)控軸中發(fā)揮著承上啟下的作用。利用轉(zhuǎn)錄組分析及分子克隆技術(shù)從密斑刺鲀中克隆并鑒定出和基因的cDNA序列, 通過生物信息學(xué)分析, 發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀cDNA開放閱讀框共363 bp, 編碼120個(gè)氨基酸;cDNA開放閱讀框共420 bp, 編碼139個(gè)氨基酸。通過序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析, 表明密斑刺鲀Fshβ和Lhβ均與鲀科類的魚的親緣關(guān)系較近。利用三級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn)Fshβ的三級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)保守, 而Lhβ的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大。利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)了密斑刺鲀和基因的組織分布情況, 結(jié)果表明密斑刺鲀和在垂體的表達(dá)量最高, 其次是性腺。此外, 進(jìn)一步檢測(cè)了和基因在雌雄性腺發(fā)育過程中的表達(dá)模式, 發(fā)現(xiàn)垂體中基因伴隨性腺的發(fā)育, 表達(dá)量逐漸下降, 而基因的表達(dá)量呈逐漸增加模式。研究結(jié)果將為構(gòu)建密斑刺鲀生殖調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供研究基礎(chǔ)。

密斑刺鲀;;; 分子克隆; 表達(dá)模式

在下丘腦-垂體-性腺(HPG)生殖調(diào)控軸中, 垂體是中間節(jié)點(diǎn), 其分泌的促性腺激素(Gonadotropic hormone, GtH)是介導(dǎo)生殖調(diào)控的重要分子, 并在生殖軸中起到承上啟下的關(guān)鍵作用。促性腺激素, 包括卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, Fsh)和黃體生成素(luteinizing hormone, Lh)。Fsh和Lh均為異二聚體、非共價(jià)結(jié)合的糖蛋白, 由一個(gè)相同的α亞基和一個(gè)激素特異性β亞基組成。每個(gè)亞基都由獨(dú)立的基因編碼(Pierce, 1981; Fiddes, 1984)。在哺乳動(dòng)物中, Fsh和Lh由同一種促性腺激素細(xì)胞產(chǎn)生(Nakane, 1970), 但在硬骨魚類中, Fsh和Lh主要由存在于硬骨魚腦垂體遠(yuǎn)側(cè)部和中間部的不同的細(xì)胞群合成和分泌(Weltzien, 2003; Zhou, 2010), 這表明硬骨魚類的Fsh和Lh具有不同的分泌調(diào)節(jié)機(jī)制和生理調(diào)控功能(Kim, 2005)。

目前, Fsh和Lh已在歐洲鰻鱺()、日本鰻鱺()、大西洋鮭()和草魚()等多種硬骨魚類中克隆和鑒定, 并開展了分子結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析(Chang, 1988, 1990; Degani, 2003; Kim, 2005; Jeng, 2007; Banerjee, 2008; Zhou, 2010)。Fsh和Lh主要是受到來(lái)源于下丘腦神經(jīng)元的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)的刺激而合成與釋放, 釋放后的Fsh和Lh分別與性腺中對(duì)應(yīng)的受體Fshr和Lhr結(jié)合, 然后促進(jìn)性腺合成性類固醇激素, 進(jìn)而調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育和成熟(Weltzien, 2004; 翟毅等, 2018)。研究表明, Fsh和Lh在性腺發(fā)育調(diào)控過程中具有互補(bǔ)作用, 在生殖周期的不同階段,和在腦垂體中的表達(dá)存在明顯差異。在裸蓋魚()的性腺發(fā)育過程中,和mRNA在垂體中的表達(dá)逐漸增加, 并在成熟期中表達(dá)量最高(Guzmán, 2018); 在美洲條紋狼鱸()雌魚卵巢發(fā)育早期,和表達(dá)量同樣逐步增加, 在卵黃生成后期,的mRNA含量降低到基礎(chǔ)水平, 但GtHα亞基和mRNA始終保持較高的表達(dá)水平(Hassin, 1995); GtH基因的表達(dá)特征是在配子發(fā)生的早期階段表達(dá)量高, 并被認(rèn)為作用于性腺早期的卵子發(fā)育和精子發(fā)生。另一方面,在配子發(fā)生的早期階段表達(dá)量低, 甚至檢測(cè)不到, 但在性腺成熟階段表達(dá)量達(dá)到最高, 并被認(rèn)為主要作用于配子成熟(Kagawa, 1998b)。

密斑刺鲀(Linnaeus, 1758), 俗稱斑點(diǎn)河鲀, 隸屬于鲀形目(Tetraodontiformes), 刺鲀科(Diodontidae), 刺鲀屬(), 主要分布在亞熱帶海域的潟湖和珊瑚礁中。當(dāng)前關(guān)于密斑刺鲀生殖調(diào)控的相關(guān)研究較少, 只是涉及促性腺激素釋放激素和性腺轉(zhuǎn)錄組分析等研究(陳華譜等, 2021; Chen, 2021)。由此, 本研究旨在克隆密斑刺鲀和的cDNA序列并分析其結(jié)構(gòu)特征, 研究密斑刺鲀和的表達(dá)模式, 為后續(xù)探究密斑刺鲀Fsh和Lh在生殖內(nèi)分泌調(diào)控中的生理功能及構(gòu)建完整的密斑刺鲀生殖調(diào)控軸提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用密斑刺鲀()為海南省三亞市近海捕撈, 經(jīng)MS-222麻醉劑(Sigma, 美國(guó))麻醉后解剖, 取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、垂體、腦、卵巢和精巢等組織, 經(jīng)液氮速凍后保存于–80 °C冰箱待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

總RNA提取試劑盒Trizol Reagent和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa, 日本); 載體和感受態(tài)細(xì)胞-T3Cloning Kit、2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye)和PerfectStart?Green qPCR SuperMix (全式金生物, 北京); 膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取(東盛生物, 廣州); 其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 總RNA提取和cDNA的合成

將保存于–80 °C的組織取出破碎勻漿, 使用Trizol Reagent試劑盒提取密斑刺鲀各組織總RNA。RNA完整性使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。取1 μg RNA樣品, 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 fshβ和lhβ基因的cDNA克隆

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 利用同源比對(duì)的方法, 從密斑刺鲀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI: PRJNA674446)中進(jìn)行在線BLAST, 獲取到密斑刺鲀和的基因序列, 并根據(jù)目的基因片段, 設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆和特異性引物(表l)。

表1 密斑刺鲀和基因克隆及組織分布的引物

Tab.1 Primers for cloning and tissue distribution of fshβ and lhβ in D. hystrix

1.4.2 分子克隆 以密斑刺鲀垂體組織的cDNA為模板, 結(jié)合和全長(zhǎng)克隆引物, 按照前期研究的基因克隆方法進(jìn)行密斑刺鲀和基因的克隆(陳華譜等, 2017)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的片段連接到-T3載體上, 轉(zhuǎn)化至1-T1感受態(tài)細(xì)胞, 篩選陽(yáng)性結(jié)果送公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

用DNAstar 7.1軟件預(yù)測(cè)密斑刺鲀和的開放閱讀框并翻譯為氨基酸序列, 進(jìn)行同源性比對(duì)。運(yùn)用在線網(wǎng)站SignalP 6.0 (https://services.healthtech. dtu.dk/service.php?SignalP)預(yù)測(cè)信號(hào)肽。運(yùn)用在線網(wǎng)站SoftBerry (http://www.softberry.com/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)。運(yùn)用Mega 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。運(yùn)用在線網(wǎng)站Swiss-model (https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析。

1.6 fshβ和lhβ基因的組織表達(dá)模式

將密斑刺鲀心臟、肝臟、脾臟、腎臟、垂體、腦、卵巢和精巢等組織的cDNA作為模板, 參照PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒說(shuō)明書準(zhǔn)備反應(yīng)體系, 利用Roche LightCycler 480 (Roche, 瑞士)檢測(cè)和在各組織中的表達(dá), 內(nèi)參為基因。qPCR反應(yīng)體系為10 μL︰5 μL qPCR SuperMix, 0.4 μL上游引物, 0.4 μL下游引物, 1 μL cDNA模板, 3.2 μL無(wú)酶水。反應(yīng)程序?yàn)? 首先95 °C預(yù)變性1 min; 95 °C變性5 s, 57 °C退火10 s, 72 °C延伸20 s, 84 °C收集熒光10 s, 共40個(gè)循環(huán); 溶解曲線: 95 °C 1 min, 52 °C 1 min, 95 °C延伸。每個(gè)樣品3次重復(fù), 用=2–??Ct方法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量, 并使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 性腺發(fā)育過程中fshβ和lhβ基因在垂體中的表達(dá)模式

將密斑刺鲀麻醉后取其性腺及垂體組織, 依照Chen等(2020)石蠟切片方法對(duì)性腺進(jìn)行切片觀察和組織學(xué)分析, 鑒定其發(fā)育時(shí)期后將對(duì)應(yīng)的垂體組織進(jìn)行歸類。將垂體組織的cDNA作為模板, 實(shí)時(shí)熒光定量的方法與上述1.6相同, 每個(gè)樣品5次重復(fù), 檢測(cè)不同性腺發(fā)育時(shí)期的垂體組織中和基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 密斑刺鲀fshβ和lhβ基因cDNA克隆及序列分析

通過對(duì)克隆獲得的序列進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀cDNA開放閱讀框共363 bp, 編碼120個(gè)氨基酸, 分子量(MW)為13.17 kDa, 理論等電點(diǎn)(pI)為6.01。其中1～18位氨基酸為信號(hào)肽, 19～120位氨基酸為成熟肽, 成熟肽部分包含了12個(gè)保守的半胱氨酸殘基, 19～117位氨基酸為功能結(jié)構(gòu)保守區(qū)糖蛋白激素β鏈同系物(glycoprotein hormone beta chain homologues,GHB)。此外, 在Fshβ氨基酸序列中含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(圖1)。

圖1 密斑刺鲀fshβ基因開放閱讀框序列及其推測(cè)的氨基酸序列

密斑刺鲀cDNA開放閱讀框共420 bp, 編碼139個(gè)氨基酸, 分子量為15.67 kDa, 理論等電點(diǎn)為5.61。其中1～19位氨基酸為信號(hào)肽, 20～139位氨基酸為成熟肽, 成熟肽部分包含了12個(gè)保守的半胱氨酸殘基, 21～126位氨基酸為功能結(jié)構(gòu)保守區(qū)GHB。此外, 在Lhβ氨基酸序列中含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(圖2)。

2.2 密斑刺鲀Fshβ和Lhβ其他功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過SoftBerry網(wǎng)站預(yù)測(cè)Fshβ和Lhβ其他功能位點(diǎn)。Fshβ功能位點(diǎn)包括: N-豆蔻酰化位點(diǎn)、異戊烯基團(tuán)結(jié)合位點(diǎn)及微體C-末端靶向信號(hào)(表2); Lhβ功能位點(diǎn)包括: 蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻酰化位點(diǎn)、原核膜脂質(zhì)附著位點(diǎn)、異戊烯基團(tuán)結(jié)合位點(diǎn)及糖蛋白激素β鏈特征1、糖蛋白激素β鏈特征2 (表3)。

2.3 密斑刺鲀Fshβ和Lhβ的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析

2.3.1 Fshβ的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析 將密斑刺鲀與紅鰭東方鲀()、菊黃東方鲀()和尼羅河鱸魚()等9種脊椎動(dòng)物Fshβ的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)及同源性分析。結(jié)果顯示, 密斑刺鲀Fshβ的氨基酸序列與同為鲀形目的菊黃東方鲀的同源性最高, 為67.5%; 與哺乳類動(dòng)物小鼠()和智人()的同源性較低, 分別是28.3%和28.7% (圖3) (表4)。

圖2 密斑刺鲀lhβ基因開放閱讀框序列及其推測(cè)的氨基酸序列

表2 密斑刺鲀Fshβ氨基酸序列中的功能位點(diǎn)

Tab.2 Functional sites in Fshβ amino acid sequence of D. hystrix

表3 密斑刺鲀Lhβ氨基酸序列中的功能位點(diǎn)

Tab.3 Functional sites in Lhβ amino acid sequence of D. hystrix

2.3.2 Lhβ的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析 對(duì)密斑刺鲀與斑馬魚、高體鰤()和紅鰭東方鲀等9種脊椎動(dòng)物L(fēng)hβ的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)及同源性分析。結(jié)果顯示, 魚類Lhβ的氨基酸序列的C-末端區(qū)域十分保守, 但N-末端區(qū)域與其他硬骨魚類和哺乳動(dòng)物差異較大(圖4)。密斑刺鲀與同為鲀形目的菊黃東方鲀的同源性最高, 為70.2%; 與哺乳類動(dòng)物小鼠和智人的同源性較低, 分別是44.5%和40.6% (表5)。

2.4 密斑刺鲀Fshβ和Lhβ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

運(yùn)用鄰位相連算法(Neighbor-Joining)構(gòu)建密斑刺鲀與其他脊椎動(dòng)物Fshβ和Lhβ的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 以確定密斑刺鲀Fshβ和Lhβ的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明, 脊椎動(dòng)物Fshβ聚類為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支, 而Lhβ則聚類為另一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支。其中密斑刺鲀Fshβ和Lhβ與紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀等鲀型目魚類的親緣關(guān)系較近(圖5)。

2.5 密斑刺鲀Fshβ和Lhβ蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用Swiss-model網(wǎng)站預(yù)測(cè)密斑刺鲀和其他脊椎動(dòng)物Fshβ和Lhβ成熟肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示, 密斑刺鲀Fshβ成熟肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)與人和紅鰭東方鲀的Fshβ高度相似。而密斑刺鲀Lhβ成熟肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)與紅鰭東方鲀的Lhβ結(jié)構(gòu)相似, 但與人的Lhβ結(jié)構(gòu)差異較大(圖6)。

2.6 密斑刺鲀fshβ和lhβ基因的組織表達(dá)

通過實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)密斑刺鲀不同組織中和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明, 密斑刺鲀和在各組織中都有分布, 在雄魚和雌魚垂體中的表達(dá)量最高, 在性腺中的表達(dá)量次之, 而在心臟、脾臟和腎臟中表達(dá)量較低(圖7)。

圖3 密斑刺鲀與其他物種Fshβ氨基酸序列的多重比對(duì)

注: 以上各物種的NCBI登錄號(hào):(紅鰭東方鲀) XP_011608222.1,(菊黃東方鲀) TWW67736.1,(尼羅河鱸魚) AKE14361.1,(鉛點(diǎn)東方鲀) BAJ12081.1,(條石鯛) AIZ66846.1,(烏鱧) KAF3686704.1,(小鼠) AAA92804.1,(智人) ABM88373.1,(斑馬魚) AAR84282.1

表4 密斑刺鲀Fshβ與其他物種的同源性

Tab.4 Homology of Fshβ between D. hystrix and other species

2.7 性腺發(fā)育過程中fshβ和lhβ基因在垂體中的表達(dá)模式

按照先前的研究(陳華譜等, 2021), 將密斑刺鲀的雌雄性腺分為早、中和晚期共3個(gè)時(shí)期。通過檢測(cè)在雌雄性腺發(fā)育的不同時(shí)期, 垂體中和的表達(dá)模式, 發(fā)現(xiàn)基因在卵巢和精巢發(fā)育成熟過程中的表達(dá)量均逐漸下降, 而基因在卵巢和精巢發(fā)育成熟過程中的表達(dá)量逐漸增加(圖8)。

3 討論

本研究成功克隆了密斑刺鲀和基因cDNA序列, 并推導(dǎo)出其氨基酸序列。結(jié)果顯示, 密斑刺鲀Fshβ和Lhβ的氨基酸序列中, 都含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和12個(gè)半胱氨酸殘基, 具有Fshβ和Lhβ典型的組成結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為, N-糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸殘基對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)合特異性受體、形成異二聚體結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)折疊等方面十分關(guān)鍵(Gharib, 1990)。當(dāng)Fshβ和Lhβ的序列中N-糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸殘基發(fā)生突變時(shí), 將不能穩(wěn)定地與GtHα結(jié)合并導(dǎo)致其異二聚體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定(Swanson, 2003; Kim, 2005)。研究發(fā)現(xiàn), 在魚類中Fshβ氨基酸序列中N-糖基化位點(diǎn)的數(shù)量有差異。密斑刺鲀Fshβ只含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn), 與齊口裂腹魚() (曹洪濤, 2010)和美洲條紋狼鱸(Hassin, 1995)等結(jié)果一致, 而在漠斑牙鲆() (柳學(xué)周等, 2014)和大菱鲆() (高云紅, 2020)中, Fshβ含有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。第二個(gè)糖基化位點(diǎn)兼具與受體結(jié)合以及增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的功能(Flack, 1994)。根據(jù)同源性分析的結(jié)果, 密斑刺鲀Fshβ和Lhβ亞基與同為鲀形目魚類的同源性最高, 與在其他魚類中的研究相類似(Kato, 1993; Quérat, 2000; Ando, 2004)。此外, 通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析, 發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀Fshβ和Lhβ分別與其他物種的Fshβ和Lhβ聚為一支, 且均與同為鲀形目的物種親緣關(guān)系最近, 與哺乳類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 符合其傳統(tǒng)的分類地位與進(jìn)化關(guān)系(黃小琪等, 2020)。但有意思的是, 通過Fshβ和Lhβ亞基的氨基酸序列三級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn)從魚類到哺乳類其Fshβ亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似, 而Lhβ亞基的差異較大, 這可能與氨基酸序列差異相關(guān)。Lhβ氨基酸序列C-末端區(qū)域保守性較高, 但N-末端區(qū)域與其他硬骨魚類和哺乳動(dòng)物存在較大差異, 猜測(cè)是在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了部分氨基酸缺失(黃小琪等, 2020)。

圖4 密斑刺鲀與其他物種Lhβ氨基酸序列的多重比對(duì)

注: 以上各物種的NCBI登錄號(hào):(斑馬魚) AAV31153.1,(高體鰤) XP_022603873.1,(紅鰭東方鲀) XP_011601356.1,(黃鱔) XP_020462355.1,(菊黃東方鲀) TWW78441.1,(狼鰻) XP_031694696.1,(尼羅羅非魚) XP_025753499.1,(小鼠) EDL22853.1,(智人) KAI4043840.1

表5 密斑刺鲀Lhβ與其他物種的同源性

Tab.5 Homology of Lhβ between D. hystrix and other species

根據(jù)組織分布的檢測(cè)結(jié)果,和基因在密斑刺鲀各組織中的表達(dá)具有顯著的差異, 但雌雄個(gè)體之間的組織分布情況高度相似, 均在垂體中表達(dá)量最高, 其次是性腺。垂體組織是密斑刺鲀分泌促性腺激素最關(guān)鍵的組織, 而多組織表達(dá)的特性, 也預(yù)示著和基因可能還參與了魚體內(nèi)其他的生理過程, 與斑馬魚(So, 2005)、絲鰭毛足鱸() (Jackson, 1999)和金頭鯛() (Meiri, 2004)中的研究結(jié)果相吻合。此外, 在早期的部分魚類研究中發(fā)現(xiàn)促性腺激素僅在垂體中特異性表達(dá), 不具有廣泛分布的特性(Tyler, 1991; Kagawa, 1998a; 牛艷東等, 2008), 可能是由于不同物種間的差異, 或不同的發(fā)育狀態(tài), 亦或是受限于早期檢測(cè)技術(shù)的較低靈敏度而產(chǎn)生的差異結(jié)果。眾所周知, 促性腺激素的受體在不同組織中均有廣泛的分布, 而促性腺激素作為分泌性蛋白, 可伴隨血液循環(huán)系統(tǒng)作用到不同組織, 由此, 關(guān)于和的其他生理功能仍有待發(fā)掘。

密斑刺鲀垂體中和基因在性腺發(fā)育不同時(shí)期中具有不同的表達(dá)模式。在卵巢和精巢發(fā)育早期,在垂體組織中具有較高的表達(dá)量, 隨著性腺的進(jìn)一步成熟,的表達(dá)量逐漸降低, 表明Fsh是密斑刺鲀性腺發(fā)育早期起主導(dǎo)作用的促性腺激素類型, 主要調(diào)控性腺早期的發(fā)育。而在雌雄性腺發(fā)育早期, 密斑刺鲀基因在垂體組織中的表達(dá)量較低, 但隨著性腺發(fā)育而逐漸升高, 表明Lh參與調(diào)控性腺發(fā)育成熟后期。密斑刺鲀和基因在性腺發(fā)育過程的表達(dá)模式與大刺鰍() (黃小琪等, 2020)和條石鯛(陳圣毅等, 2014)等研究結(jié)果相一致, 也和傳統(tǒng)的認(rèn)知相同, Fsh作用于性腺發(fā)育的早期, Lh主要作用于性腺發(fā)育的后期。但在魚類中, 關(guān)于和基因在性腺發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)同樣存在著多樣性。在漠斑牙鲆的研究中發(fā)現(xiàn), 垂體中在卵巢發(fā)育的早期的表達(dá)量較低, 到卵巢成熟時(shí),的表達(dá)量顯著升高(柳學(xué)周等, 2014)。在草魚(Zhou, 2010)的研究中, 發(fā)現(xiàn)和在草魚性腺發(fā)育過程中具有相同的表達(dá)模式, 二者共同調(diào)控草魚性腺的發(fā)育和成熟。這表明魚類Fsh和Lh在發(fā)揮生殖調(diào)控功能中存在著明顯的種間差異和生理功能差異。

圖5 Fshβ和Lhβ系統(tǒng)進(jìn)化樹

注: 系統(tǒng)進(jìn)化樹中結(jié)點(diǎn)處數(shù)值代表1000次評(píng)估的自舉檢驗(yàn)置信度; 三角形表示本研究對(duì)象

圖6 密斑刺鲀和其他脊椎動(dòng)物Fshβ、Lhβ成熟肽的三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)

注: a. 人Fshβ成熟肽; b. 密斑刺鲀Fshβ成熟肽; c. 紅鰭東方鲀Fshβ成熟肽; d. 人Lhβ成熟肽; e. 密斑刺鲀Lhβ成熟肽; f. 紅鰭東方鲀Lhβ成熟肽

圖7 密斑刺鲀fshβ和lhβ基因在不同組織中的表達(dá)

注: a.; b.。數(shù)據(jù)以平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)方差表示(=3), 統(tǒng)計(jì)差異表示為*<0.05

4 結(jié)論

本研究克隆鑒定了密斑刺鲀和基因的cDNA序列, 并進(jìn)行了序列及結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn)Fshβ和Lhβ都含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和12個(gè)半胱氨酸殘基, 在硬骨魚中Fshβ和Lhβ都與同為鲀形目的物種親緣關(guān)系較近。同時(shí), 發(fā)現(xiàn)了和在所有組織中均有表達(dá), 在垂體中的表達(dá)量最高, 這預(yù)示著除了參與性腺發(fā)育調(diào)控外,和基因在密斑刺鲀中可能參與更多樣化的調(diào)控過程。此外, 密斑刺鲀垂體中和基因在性腺發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式提示, Fsh主要在性腺發(fā)育早期起主導(dǎo)作用, 而性腺發(fā)育晚期則主要由Lh發(fā)揮功能。本研究為密斑刺鲀生殖調(diào)控機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

圖8 密斑刺鲀不同性腺發(fā)育時(shí)期fshβ和lhβ基因在垂體中的表達(dá)

注: 垂體中(a)和(b)在不同卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá); 垂體中(c)和(d)在不同精巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)方差表示(=5); 上標(biāo)不同的字母表示組間的顯著性差異(<0.05)

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OFANDGENE IN

GUO Yu-Wen, LI Yi-Kai, DAI Ming-Shu, LIANG Jun-Hao, HUANG Yan-Lin, LI Guang-Li, CHEN Hua-Pu

(Guangdong Research Center on Reproductive Control and Breeding Technology of Indigenous Valuable Fish Species, Guangdong Provincial Engineering Laboratory for Mariculture Organism Breeding, Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

is a well-known economic fish in the South China Sea with high edible and medicinal value. However, studies on the reproduction of.are few, which hinder the development of its artificial breeding. Gonadotropic hormone (GtH) is one of the key hormones for reproductive regulation, and plays a connecting role in the reproductive regulation axis. We cloned the cDNA sequences ofandgenes from.by molecular cloning techniques. Through bioinformatics analysis, we found that the open reading frame (ORF) ofcDNA contains 363 bp, encoding 120 amino acids, while the ORF ofcDNA contains 420 bp, encoding 139 amino acids. Sequence alignment and phylogenetic tree analyses showed that both Fshβ and Lhβ ofare similar to those of fishes of the family Tetraodontidae. According to the tertiary structure analysis, we found that the tertiary structure of Fshβ is highly conservative, while the tertiary structure of Lhβ is moderately conservative. The tissue distribution ofandgenes in.was detected by qRT-PCR. Results show that the expression of bothandwas the highest in the pituitary, followed by the gonads. In addition, we detected the expression patterns ofandgenes during the development of male and female gonads, and found that the expression ofgene in the pituitary gradually decreased with the development of gonads, while the expression ofgene gradually increased. This study provided a theoretic basis for constructing the reproductive regulatory network of.

;;; molecular cloning; expression pattern

* 海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃, ZDYF2018225號(hào); 湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目, 2022A01214號(hào); 陽(yáng)江市科技計(jì)劃項(xiàng)目, 2022011號(hào), SDZX2023027號(hào)。郭煜文, 碩士研究生, E-mail: gdougyw@163.com

陳華譜, 博士, 教授, E-mail: chenhp@gdou.edu.cn

2023-04-28,

2023-08-04

S965.3

10.11693/hyhz20230400098