褶皺臂尾輪蟲(Branchionus plicatilis)響應四溴聯苯醚(BDE-47)脅迫的能量代謝變化研究*

何 晴 郭 穎 周仲元 王 悠 周 斌

褶皺臂尾輪蟲()響應四溴聯苯醚(BDE-47)脅迫的能量代謝變化研究*

何 晴1, 2郭 穎1, 2周仲元1, 2王 悠1, 2周 斌1, 2?

(1. 中國海洋大學海洋生命學院 山東青島 266003; 2. 嶗山實驗室 山東青島 266237)

多溴聯苯醚(PBDEs)作為一種典型的持久性有機污染物, 對海洋生物和生態系統的可持續性構成嚴重威脅。以2,2',4,4'-四溴聯苯醚(BDE-47)作為脅迫因子, 以褶皺臂尾輪蟲()作為受試生物, 基于代謝組學技術探討褶皺臂尾輪蟲應對BDE-47脅迫時的能量代謝變化。24 h脅迫實驗的結果表明: 褶皺臂尾輪蟲的濾水率()和攝食率()顯著降低, 抑制了其對能源物質的獲取; 褶皺臂尾輪蟲-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活性均受到抑制, 降低了其對能源物質的消化效率; 褶皺臂尾輪蟲的總腺苷酸含量(TAP)隨著BDE-47脅迫濃度的增加而不斷下降, 其能量狀態發生了不利變化; 褶皺臂尾輪蟲的細胞能量分配(CEA)降低, 是能量儲備(a)減少和能量消耗(c)增加共同作用的結果。代謝組學分析表明褶皺臂尾輪蟲的氨基酸代謝、脂質代謝和糖代謝產生了顯著變化, 發現了與氨基酸代謝、脂質代謝和糖代謝相關的26種差異代謝物和20條代謝通路, 氨基酸、脂肪酸以及果糖水平顯著下調, 溶血磷脂酰膽堿(lysoPC)和磷酸乙醇胺(PE)顯著上調。以上結果表明, BDE-47急性毒性脅迫影響了褶皺臂尾輪蟲對于能源物質的獲取和利用, 對褶皺臂尾輪蟲的能量狀態產生負面影響, 并且使其在能量分配上發生了改變。

褶皺臂尾輪蟲; BDE-47; 能量; 代謝組學

多溴聯苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是典型的持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs), 是一種阻燃效率高、熱穩定性好、用量少、對材料性能影響小且價格便宜的溴化阻燃劑, 被廣泛應用于塑料、紡織品、電子電器等諸多領域(de Wit, 2002)。PBDEs以非共價鍵的形式結合在這些材料中, 因此非常容易釋放到環境中(Rahman, 2001), 已有研究表明, 其在水體環境中分布廣泛且檢出率高(陳美林等, 2022)。PBDEs具有親脂性, 容易在生物體內蓄積, 會隨著食物鏈逐級傳遞, 因此會對生態可持續性和人類健康構成威脅(Wan, 2008; 鄧洪齊等, 2022)。而在PBDEs家族共209種同系物中, 2,2',4,4'-四溴聯苯醚(BDE-47)是最主要的同系物之一, 在海洋環境中豐度高, 毒性強(耿倩倩等, 2022)。

海洋浮游動物在PBDEs的逐級傳遞過程中扮演重要角色, 同時也是影響海洋生態系統物質循環與能量流動的關鍵生物類群(Costa, 2008;Fonnum, 2009)。褶皺臂尾輪蟲()是我國近海海域常見的浮游動物之一, 分布廣泛且對毒性物質敏感, 在2022年發布的《海洋生物水質基準推導技術指南(試行)》中, 它被列為適合開展毒性試驗以推導我國海洋生物水質基準的120種推薦物種之一, 是海洋生態毒理學實驗中理想的受試生物。

生物體的能量是有限的, 而其進行的所有生理活動都需要能量供給, 這就意味著當生物體面對環境壓力時, 其能量在分配上可能發生變化, 進行必要的權衡(Smolders, 2004)。對紫貽貝()進行的研究表明, 環境脅迫會引起紫貽貝的能量分配發生變化, 導致其傾向于將有限的能量分配給更重要的過程而用于生長、繁殖的能量減少, 甚至犧牲掉部分珍珠層(Melzner, 2011; Jiang, 2021); 早在1997年, De Coen等(1997)就基于生理能量學的細胞能量分配(CEA)方法評估了林丹和氯化汞對大型蚤()能量分配的影響, 并表明環境脅迫改變了大型蚤的能量分配。

代謝組學(Metabonomics)是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后, 系統生物學的重要組成部分, 也是目前組學領域研究熱點之一。代謝組通過考察受試生物受擾動或刺激后, 其全部或部分代謝產物的變化來研究該刺激對受試生物代謝途徑的影響, 目前已在水生生物的毒理學研究方面得到廣泛應用。例如, Ren等(2018)應用代謝組學技術研究了短鏈氯化石蠟對斑馬魚()胚胎和幼魚發育以及代謝的影響; Dong等(2022)通過代謝組學技術揭示了櫛孔扇貝()響應熱應激的能量代謝變化, 表明其具有通過調節能量代謝來適應熱應激的潛力。

現有研究表明, 當暴露于PBDEs時, 褶皺臂尾輪蟲的體型發育大小會受到抑制, 內壁結構模糊, 不透明度增加, 輪盤和背甲萎縮, 運動受到抑制(沙婧婧等, 2015), 個體產卵數降低(Sha, 2015), 線粒體發生損傷(Yang, 2021)等。而目前關于PBDEs對褶皺臂尾輪蟲能量代謝的影響還缺乏足夠了解, 因此本研究從能量獲取出發, 探究在BDE-47脅迫條件下褶皺臂尾輪蟲的能量代謝變化, 并基于液相色譜質譜(LC-MS)聯用的非靶向代謝組學方法探究其潛在的作用機制, 為深入闡明BDE-47的海洋生態學效應提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物的培養 實驗所用褶皺臂尾輪蟲由休眠卵孵化而來。將褶皺臂尾輪蟲的休眠卵置于裝有滅菌海水(鹽度30, pH 8.6)的100 mL燒杯中, 于光照培養箱中培養, 溫度(25±1) °C, 光照周期12 h︰12 h,光照強度60 μmol/(m2·s), 孵化期間投喂密度為1× 106cells/mL的餌料小球藻()。培養4 d后, 在體式顯微鏡下挑選出活潑健壯的輪蟲繼續培養2個月待用, 培養條件與孵化條件一致, 整個培養過程無需充氣。

1.1.2 主要試劑及配制 實驗所用海水, 經0.45 μm濾膜過濾, 121 °C, 30 min高壓滅菌冷卻后使用。實驗所用BDE-47為美國AccutSandard公司生產的白色粉末狀固體產品, 純度為100%, 選用二甲亞砜(DMSO)作為助溶劑。實驗所采用的DMSO為Sigma-Aldrich公司生產, GC級, 純度≥99%。BDE-47母液的配制: 將10 mg BDE-47溶于DMSO配制成2 000 mg/L的母液, 室溫下避光保存, 實驗時, 將BDE-47母液用過濾海水稀釋成實驗所需的濃度梯度。

1.2 實驗方法

1.2.1 濾水率()和攝食率()的測定 實驗開始前, 將褶皺臂尾輪蟲置于小球藻密度為1×106cells/mL的燒杯中馴養48 h。在體式顯微鏡下挑選活潑健壯的掛卵輪蟲, 收集幼蟲(齡期<2 h)進行實驗。實驗設置空白對照組(海水對照組)、溶劑對照組(DMSO體積濃度為0.9%)、0.008 mg/L(低濃度)、0.08 mg/L(中濃度)、0.8 mg/L(高濃度)處理組和一個無輪蟲組, 每組設置3個平行。實驗體系為5 mL, 除無輪蟲組外, 每組50只幼蟲, 脅迫時間為24 h, 期間不再投喂小球藻。脅迫完成之后, 將每組中的50只幼蟲重新挑出, 放置于體系為5 mL的海水-小球藻體系中, 并在黑暗環境中震蕩培養, 以避免小球藻沉降和繁殖。所有組別體系中的小球藻數目保持一致, 并在放置之前先進行小球藻的計數以獲得初始小球藻密度。攝食24 h后, 所有樣品用盧戈氏碘液固定, 并在血球計數板上計數小球藻密度, 將無輪蟲組的小球藻密度作為最終餌料密度。根據Frost (1972)公式采用餌料密度差減法計算每組的和:

其中,為濾水率[mL/(ind.?h)];為攝食率[cells/(ind.?h)];為實驗溶液體積;為輪蟲個體數(ind.);0為起始餌料密度(cells/mL);C為無輪蟲組中的最終餌料密度(cells/mL);C為實驗組中的最終餌料密度(cells/mL);為攝食時間。

1.2.2 消化酶活性的測定 實驗設置空白對照組(海水對照組)、溶劑對照組(DMSO體積濃度為0.9%)、0.008 mg/L (低濃度)、0.08 mg/L (中濃度)和0.8 mg/L (高濃度)處理組。實驗體系為50 mL, 脅迫時間24 h。脅迫完成后, 用PBS緩沖液收集至1.5 mL離心管中冰浴勻漿2 min, 600離心10 min, 取上清液即為粗酶液。-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性測定均使用南京建成分析試劑盒。

1.2.3 腺苷酸(TAP)含量的測定 實驗設置同1.2.2。實驗體系250 mL, 脅迫時間24 h。腺苷酸的含量用液相色譜-質譜連用的方法檢測。將褶皺臂尾輪蟲收集到1.5 mL離心管中, 加 0.9 mL一級水, 渦旋混勻, 超聲提取15 min, 3 300離心10 min, 上清液過0.22 μm微孔濾膜后上機檢測。色譜柱為Agilent C18 (2.1 mm× 100 mm, 1.8 μm), 柱溫30 °C, 流速0.3 mL/min, 進樣量為2 μL。總腺苷酸含量(TAP, 單位: μg/g ww, 濕重)的計算方法為(Atkinson, 1968):

TAP =ATP+ADP+AMP, (3)

其中, ATP為三磷酸腺苷, ADP為二磷酸腺苷, AMP為一磷酸腺苷。

1.2.4 能量儲備(a)和能量消耗(c)的測定 (1) 能量儲備的測定: 以糖原、脂肪和蛋白質的含量表示褶皺臂尾輪蟲體內的能量儲備。實驗設置同1.2.2。糖原含量的檢測采用南京建成試劑盒, 蛋白質含量的檢測使用索萊寶試劑盒, 脂肪含量采用重量法測定(Sloan, 2010)。不同的能量儲備組分按照39 500 mJ/mg脂肪、24 000 mJ/mg蛋白質和17 500 mJ/mg糖原轉化成其相應的能量值(Gnaiger, 1983), 總能量儲備(a, 單位: mJ/mg ww)的計算公式為:

a=glycogen+lipid+protein, (4)

其中,glycogen為糖原能量儲備,lipid為脂肪能量儲備,protein為蛋白質能量儲備。

(2) 能量消耗的測定: 實驗設置同1.2.2, 根據Owens等(1975)的方法以線粒體電子傳遞系統(ETS)的活性來表示能量消耗(c), 根據Gneiger(1983)的方法將得到的耗氧量轉換為能量值(480 kJ/mol O2)。(3) 細胞能量分配(CEA)的計算公式為(Verslycke, 2004):

CEA=a/c. (5)

1.2.5 代謝組檢測 (1) 樣品收集: 實驗設置空白對照組(海水對照組)和0.8 mg/L(高濃度)BDE-47處理組, 每組6個平行。實驗體系150 mL, 脅迫時間24 h。脅迫完成后收集至2 mL細胞凍存管中,-80 °C中保存待測。(2) 前處理: 向樣本中加入兩個小鋼珠, 加入1 mL純水; 在-40 °C冰箱中放置2 min預冷, 放入研磨機中研磨(60 Hz, 2 min); 冰水浴超聲提取30 min,-40 °C靜置2 h后13 000離心10 min, 取800 μL上清過SPE小柱, 收集3 mL甲醇洗脫液; 用氮吹儀吹干后, 加入300 μL甲醇-水(體積比為4︰1, 含L-2-氯苯丙氨酸, 4 μg/mL)復溶, 渦旋1 min, 冰水浴超聲10 min, 于-40 °C靜置30 min后15 000離心10 min, 用注射器吸取150 μL的上清液, 使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后, 轉移到LC進樣小瓶,-80 °C下保存, 直到進行LC-MS分析。(3) 液相色譜-質譜條件: 本次實驗的分析儀器為ACQUITY UPLC I-Class plus超高效液相串聯QE plus高分辨質譜儀組成的液質聯用系統, 色譜柱: ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流動相A為超純水(含0.1%的甲酸), B為乙腈。柱溫45 °C, 進樣體積5 μL。質譜用電噴霧離子源, 樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。

1.3 數據分析

數據表示為平均值±標準差(= 3)。使用SPSS 24.0對所得的實驗數據進行統計分析, 首先通過Shapiro- Wilk檢驗和Levene檢驗對數據進行正態分布和方差齊性檢驗, 然后采用單因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD來比較組間差異, 將<0.05作為差異顯著的標準。用Origin 2021軟件作圖。

2 結果

2.1 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲攝食的影響

BDE-47脅迫對褶皺臂尾輪蟲濾水率()和攝食率()產生了影響(圖1)。

對濾水率的研究結果表明(圖1a), BDE-47處理組褶皺臂尾輪蟲的濾水率呈現出下降的趨勢, 與空白對照組相比, 除低濃度處理組濾水率無顯著性差異外(>0.05), 中濃度處理組和高濃度處理組濾水率都顯著性降低(<0.05), 高濃度處理組中, 褶皺臂尾輪蟲的濾水率下降至空白對照組的47.12%。

對攝食率的研究結果表明(圖1b), 與濾水率相比, 攝食率受到的影響相對較小, 與空白對照組相比, 只有在高濃度處理組中, 褶皺臂尾輪蟲的攝食率才出現顯著性降低(<0.05), 為空白對照組的59.80%。

2.2 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲消化的影響

BDE-47脅迫對褶皺臂尾輪蟲三種主要消化酶(-淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶)的活性均產生了影響(圖2)。

對于-淀粉酶而言(圖2a), 與空白對照組相比, 在不同濃度的BDE-47脅迫下, 褶皺臂尾輪蟲的-淀粉酶活性均顯著降低(<0.05); 低、中、高濃度處理組之間-淀粉酶活性無顯著差異(>0.05), 其中, 中濃度處理組-淀粉酶活性為空白對照組的82.37%。

對于胰蛋白酶而言(圖2b), 在不同濃度的BDE-47脅迫下, 褶皺臂尾輪蟲的胰蛋白酶活性水平均顯著降低(<0.05), 但與-淀粉酶的變化不同的是, 高濃度處理組胰蛋白酶活性顯著低于低、中濃度處理組, 為空白對照組的76.45%。

圖1 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲濾水率、攝食率的影響

注: a. 濾水率; b. 攝食率。DMSO為溶劑對照組, 不同字母表示各組具有顯著性差異(<0.05), 以下同

圖2 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲消化酶活性的影響

注: a.-淀粉酶; b. 胰蛋白酶; c. 脂肪酶

對于脂肪酶而言(圖2c), 與空白對照組相比, 低、中濃度處理組脂肪酶活性無顯著性差異()>0.05); 在高濃度處理組中, 脂肪酶活性顯著性降低(<0.05), 為空白對照組的77.24%。

2.3 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲總腺苷酸含量的影響

褶皺臂尾輪蟲的總腺苷酸含量(TAP)受到BDE-47脅迫的顯著影響(圖3)。低濃度組的褶皺臂尾輪蟲腺苷酸含量沒有出現顯著性變化(>0.05), 中、高濃度處理組的腺苷酸含量出現顯著性降低(<0.05), 尤其是高濃度處理組, TAP含量與空白對照組相比降低了18.6%。

2.4 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲能量分配的影響

褶皺臂尾輪蟲在BDE-47的脅迫下, 各能量組分及總能量儲備的變化如表1所示。與空白對照組相比, 在不同濃度的BDE-47脅迫下, 糖原和脂質含量均發生顯著下降(<0.05)。不同的是, 糖原含量在BDE-47濃度為0.08 mg/L時出現最低值, 為空白對照組的69.73%, 脂質含量出現大幅下降, 最低值出現在高濃度組, 僅為空白對照組的38%。與糖原和脂質的變化趨勢不同, 蛋白質含量在BDE-47脅迫下顯著增加(<0.05), 并且在BDE-47濃度為0.8 mg/L時出現最大值。對于總的能量儲備, 隨著BDE-47濃度的不斷升高, 褶皺臂尾輪蟲的能量儲備不斷下降, 當BDE-47濃度為0.8 mg/L時出現最低值。

圖3 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲總腺苷酸含量(TAP)的影響

表1 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲glycogen,lipid,protein,a,c和CEA的影響(單位: mJ/mg ww)

Tab.1 Effects of BDE-47 on the Eglycogen, Elipid, Eprotein, Ea, Ec和CEA of B. plicatilis (unit: mJ/mg ww)

注:glycogen: 糖原能量儲備;lipid: 脂肪能量儲備;protein: 蛋白質能量儲備;a: 能量儲備;c: 能量消耗; CEA: 細胞能量分配; DMSO: 二甲亞砜

褶皺臂尾輪蟲的能量消耗在低濃度的BDE-47條件下沒有發生顯著性變化(>0.05), 在中、高濃度組則表現出顯著升高(<0.05), 并在0.8 mg/L時達到最大值, 與空白對照組相比, 增加了22.96%。

褶皺臂尾輪蟲的細胞能量分配在不同濃度的BDE-47脅迫下呈現出顯著降低(<0.05)。與空白對照組相比, 低、中、高濃度處理組的細胞能量分配值分別下降了22.87%、37.55%和48.08%。

2.5 BDE-47脅迫下褶皺臂尾輪蟲的代謝組學分析

2.5.1 主成分分析 本研究共檢測到5 456個有注釋的代謝物, 其中包括正離子模式下檢測到的2 829個和負離子模式下檢測到的2 627個。對這些代謝物進行主成分分析可見(圖4), 空白對照組與BDE-47處理組明顯分離, 表明在BDE-47處理下褶皺臂尾輪蟲的代謝物發生明顯變化。

圖4 主成分分析圖

注: C為空白對照組; T為BDE-47處理組

2.5.2 差異代謝物分析 利用檢驗和變異倍數分析比較兩組之間的代謝產物, 以VIP(變量權重值)>1且-value<0.05為條件篩選差異表達代謝物并進行富集分析, log2(FC)>0(FC為差異倍數)為上調, log2(FC)<0為下調。本實驗重點關注了與糖代謝、氨基酸代謝和脂質代謝相關的差異代謝物, 將其進行統計如圖5和圖6所示。與糖代謝相關的差異代謝物有3種, 包括上調的果糖, 下調的-D-葡萄糖醛酸苷和UDP-D-半乳糖醛酸酯;與氨基酸代謝相關的差異代謝物有8種, 包括L-異亮氨酸、L-精氨酸和L-色氨酸等, 均呈現下調; 與脂質代謝相關的差異代謝物有15種, 包括上調的8種, 如溶血磷脂酰膽堿LysoPC (18:0/0:0)、LysoPC (16:0/0:0)和LysoPC (17:0/0:0)等, 下調的7種, 如十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸和-亞麻酸等。

2.5.3 代謝途徑分析 對差異代謝物進行KEGG富集分析, 如圖7所示是差異代謝物富集氣泡圖, 分析發現, 在Top-20代謝通路中有5條與脂質代謝有關的通路: 不飽和脂肪酸的生物合成、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、乙醚類脂代謝和鞘磷脂代謝; 有5條與氨基酸代謝有關的通路: 甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝和色氨酸代謝。除此之外, 在其余富集的代謝通路中, 還有與糖代謝有關的兩條通路: 氨基糖和核苷酸糖代謝以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化。

圖5 與糖代謝、氨基酸代謝、脂質代謝相關的差異代謝物匯總統計

圖6 與糖代謝、氨基酸代謝、脂質代謝相關的差異代謝物熱圖

注: C1～C6為空白對照組的6個平行樣品; T1～T6為BDE-47處理組的6個平行樣品; 圖例中紅色表示上調, 藍色表示下調, 顏色越深表示上下調幅度越大

3 討論

當外界環境發生變化時, 生物體的生長發育、運動和生殖等一系列生理過程和行為都會受到影響。而實際上, 生物體的所有生理活動都需要一定的能量成本(Jiang, 2021), 生物體生命過程中的所有生理和生化過程都嚴格依賴于它們的能量代謝, 生理表現與能量變化之間存在著密切聯系。

3.1 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲攝食的影響

攝食是影響浮游動物能量獲取和分配的重要行為(Yan, 2017)。褶皺臂尾輪蟲作為典型的濾食性浮游動物, 可以通過其濾水率和攝食率的變化研究攝食行為。本研究結果顯示, BDE-47能夠顯著抑制褶皺臂尾輪蟲的濾水率和攝食率, 并且具有濃度依賴效應。類似的結果在其他研究中也有報道, 如徐風風等(2013)的研究表明, 高濃度的BDE-47暴露會抑制日本虎斑猛水蚤()的攝食; Zhao等(2019)關于兩種PBDEs對大型蚤的研究表明, BDE-47和BDE-99脅迫24 h均會對大型蚤的攝食產生抑制, 且二者具有協同作用。究其原因, 可能是褶皺臂尾輪蟲需要依靠游泳和頭冠纖毛的轉動將食物攝入口中, 即輪蟲的攝食與運動能力密切相關。而已有的研究表明, BDE-47脅迫一方面會引起線粒體損傷并抑制ATP酶活性, 導致能量短缺從而抑制纖毛運動; 另一方面會抑制AChE活性, 擾亂神經傳遞, 導致褶皺臂尾輪蟲產生運動障礙(沙婧婧等, 2015; Liu, 2018; Yang, 2021)。這一實驗結果表明BDE-47可能首先通過抑制輪蟲的攝食影響其能量狀態。

圖7 TOP-20氣泡圖

3.2 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲消化的影響

動物體攝取食物之后將進行消化和同化, 這是將攝取的食物轉化為供有機體進行生命活動的能量的重要環節, 而消化酶在整個過程中發揮著關鍵作用。在本研究中, BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均產生不同程度的抑制作用, 但對于-淀粉酶的抑制作用最顯著, 這可能與褶皺臂尾輪蟲的食性有關(郭恩棉等, 2009)。該結果與Zhao等(2019)的研究結果相似, 即BDE-47和BDE-99會對大型蚤的消化酶產生抑制效果。

對上述結果提出了以下幾種可能: (1) BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的攝食產生了抑制, 因此褶皺臂尾輪蟲的消化腺受到食物蠕動的機械刺激減弱(郭恩棉等, 2009), 從而引起消化酶的活力降低; (2) 褶皺臂尾輪蟲的消化腺結構發生損傷。已有研究表明, 貽貝在接觸有機污染物和金屬離子時, 貽貝組織會受到嚴重的損傷, 尤其是消化組織可能會出現萎縮或壞死(Cajaraville, 1990; Jiang, 2021); (3) 消化功能需要神經系統的參與和調節, PBDEs作為一種具有神經毒性的物質(李晉等, 2009), 可能通過影響神經系統影響到褶皺臂尾輪蟲的消化功能; (4) PBDEs可能通過影響消化酶基因的表達, 從而對消化酶水平產生影響(Zhao, 2019)。

3.3 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲腺苷酸含量的影響

不論是攝食量的減少還是消化酶活性的降低, 都將影響生物體對于能源物質的獲取, 進而可能引起生物體能量狀態的改變。

一般來說, 盡管ATP、ADP和AMP的比例會隨著磷酸化的水平出現一定的波動, 但總腺苷酸含量(TAP)總體上是穩定的, 其含量不僅反映細胞產生高能磷酸化合物的能力, 而且反映了細胞的能量儲備狀態(Guo, 2021)。在本研究中, 與對照組相比, 低濃度處理組的褶皺臂尾輪蟲TAP含量沒有發生顯著變化(>0.05), 但在中、高濃度組, 褶皺臂尾輪蟲的TAP含量顯著性降低(<0.05), 這一現象在Jiang等(2021)對紫貽貝響應BDE-47的研究和Guo等(2021)對紫貽貝響應海水酸化的研究中也有報道, 這意味著ATP合成的潛在儲備量減少, BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的能量狀態產生了負面影響。

3.4 BDE-47對褶皺臂尾輪蟲能量分配的影響

目前, 基于細胞能量分配(CEA)方法探討環境脅迫對褶皺臂尾輪蟲影響的研究尚未見報道, 本研究首次基于該方法對BDE-47脅迫下褶皺臂尾輪蟲的能量分配進行了研究。結果顯示, 作為生物體三大主要供能物質的糖原、脂質和蛋白質均受到BDE-47脅迫的影響, BDE-47脅迫加劇了褶皺臂尾輪蟲對糖原和脂質的消耗, 而增加了蛋白質的合成, 這表明褶皺臂尾輪蟲可能需要合成更多的蛋白質用以抵御BDE-47暴露帶來的不利影響, 例如熱休克蛋白(Grosell, 2009)。而對于總的能量儲備而言, 隨著BDE-47濃度的升高, 褶皺臂尾輪蟲的能量儲備逐漸降低。正如前面所述, 攝食量的減少以及消化能力的降低是引起這一結果的原因之一, 另外, 能量儲備的降低也可能是消耗增加的結果。本研究結果顯示, BDE-47脅迫增加了褶皺臂尾輪蟲的能量消耗, 這可能是其抵御BDE-47脅迫以維持自身生存的需要。相似的研究結果在貽貝和大型蚤的研究中也有報道, 例如, 厚殼貽貝()暴露于海洋微塑料和酸化條件中14 d, 均會導致其能量儲備降低和能量消耗增加(Shang, 2021, 2023); 大型蚤暴露于林丹中也會引起其能量儲備下降和能量消耗增加(De Coen, 1997)。

環境變化會擾亂機體對于能量的分配(唐佳等, 2022), 細胞能量分配可以綜合反映生物體在環境脅迫條件下的能量狀況, 能量分配的下降通常意味著可用于生長和繁殖的能量減少(Verslycke, 2004)。本研究結果顯示, BDE-47脅迫降低了褶皺臂尾輪蟲的細胞能量分配, 這是能量儲備減少和能量消耗增加共同導致的結果, 提示BDE-47會對褶皺臂尾輪蟲的生長和繁殖產生不利影響。與本研究結果類似, De Coen等(2003)研究了CdCl2、五氯酚酸鈉和直鏈烷基苯磺酸等六種毒性物質對大型水蚤細胞能量分配的影響, 結果表明, 環境脅迫會對大型蚤的糖原、脂質和蛋白質含量產生影響, 細胞能量分配降低, 并表明這是能量儲備降低和能量消耗增加同時作用的結果。在Muyssen等(2001)對大型蚤耐鋅性的研究中, 更是提出了細胞能量分配的降低, 尤其是脂肪含量的降低可能是大型水蚤在生存和繁殖之間的一種權衡, 而這終將反映在生物體的種群動態中。

3.5 基于代謝組學探討褶皺臂尾輪蟲應對BDE-47脅迫的能量響應機制

為進一步探究BDE-47暴露對褶皺臂尾輪蟲能量代謝的影響, 在生理實驗的基礎上, 本研究應用代謝組學技術對差異最顯著的高濃度BDE-47處理組和空白對照組進行了非靶向代謝組學的研究。研究結果表明, BDE-47脅迫影響了褶皺臂尾輪蟲的能量代謝, 尤其是氨基酸代謝和脂質代謝。

氨基酸參與生物體的滲透調節、能量代謝和蛋白質合成, 在生物體的代謝中起著重要作用(Gu, 2021)。不少研究表明, 當暴露于各種外源性污染物時, 海洋生物體內的氨基酸水平以及氨基酸代謝相關通路會發生變化, 受到嚴重影響。例如, 鄰苯二甲酸酯(PAE)暴露使得厚殼貽貝的多條氨基酸代謝途徑受到影響(精氨酸生物合成、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等), 多種氨基酸出現不同程度的上下調, 表明PAE暴露后貽貝中的蛋白質合成被阻斷, 并且氨基酸的顯著變化也表明了PAE暴露干擾了貽貝的滲透調節機制(Gu, 2021)。大型蚤暴露于兩種有機磷酸鹽和雙酚A中均會造成氨基酸含量發生變化, 這可能與大型蚤中能量動力學的改變有關(Nagato, 2016)。本研究結果顯示, BDE-47暴露影響了褶皺臂尾輪蟲中與氨基酸代謝相關的途徑, 下調了氨基酸及其衍生物的水平。氨基酸含量的下調可能是氨基酸充當供能物質進行分解供能, 也可能是作為蛋白質的基本組成單位進行蛋白質的合成, 結合本實驗前面的實驗結果, 氨基酸含量的下調可能更傾向于用以合成蛋白質而非分解供能, 以抵抗BDE-47的脅迫維持正常生存。這種氨基酸的變化模式在其他研究中也有報道, 例如, 將大型蚤暴露于鎘中發現其氨基酸發生下調, 并且作者強調氨基酸水平降低的一個潛在機制是攝食吸收減少(Poynton, 2011), 這在本研究中也有所體現。

另外, 甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝和鞘磷脂代謝等也是BDE-47脅迫觸發的代謝通路, 表明BDE-47暴露對褶皺臂尾輪蟲的脂質代謝產生了明顯的影響。就富集在脂質代謝相關通路上的差異代謝物而言, 有6種溶血磷脂酰膽堿(lysoPC)和1種磷酸乙醇胺(PE)呈現上調, 這種變化在斑馬魚的研究中也有報道, 即微塑料(Zhao, 2021)和短鏈氯化石蠟(Ren, 2018)的暴露使得斑馬魚的脂質過氧化相關代謝物升高, 其中包括lysoPC和PE。而研究表明, lysoPC的積累與氧化應激和炎癥損傷有關(Shao, 2018;Nanayakkara, 2019), 并且可以觸發線粒體活性氧(mtROS)的產生(Li, 2016)。因此通過代謝組lysoPC和PE的上調推測BDE-47會導致褶皺臂尾輪發生脂質過氧化, 導致氧化損傷, 事實上本課題組前期已經證實了這一結論(沙婧婧, 2015), 而對于lysoPC觸發的線粒體活性氧的產生則可能是本實驗中腺苷酸含量失衡的原因。脂肪酸是重要的能量來源, 在脂質組成中起著關鍵作用(Xicoy, 2019)。在本研究中, 除了觀察到lysoPC和PE的上調之外, 還存在一些下調的脂肪酸, 例如十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、-亞麻酸以及花生四烯酸, 考慮到這些物質都是水生生物的必需氨基酸(Glencross, 2009), 需要從外界攝食獲取, 因此代謝組中檢測到的此類脂肪酸下調既可能是因為褶皺臂尾輪蟲暴露于BDE-47后消耗了脂肪酸以提供自身所需能量, 也可能是由于攝食量的減少以及消化能力的降低所導致的, 而脂肪酸類的下調尤其是花生四烯酸的下調表明BDE-47暴露會對褶皺臂尾輪蟲的繁殖產生不利影響(Wang, 2018; Cho, 2022)。

相較于脂質代謝和氨基酸代謝, BDE-47暴露對褶皺臂尾輪蟲的糖代謝產生的影響較小, 其中僅有果糖含量發生下調, 這將有利于為褶皺臂尾輪蟲應對BDE-47脅迫提供能量。

4 結論

BDE-47脅迫能夠抑制褶皺臂尾輪蟲的攝食和消化, 從源頭上減少了對于能源物質的獲取; 引起腺苷酸庫失衡, 對褶皺臂尾輪蟲的能量狀態產生負面影響; 導致能量儲備的減少以及能量消耗的增加, 二者共同引起了細胞能量分配降低。

BDE-47脅迫能夠調控褶皺臂尾輪蟲的氨基酸代謝、脂質代謝和糖代謝相關通路, 下調氨基酸、脂肪酸以及果糖水平, 上調lysoPC和PE。

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the changes of energy metabolism of ROTIFERin response to BDE-47 stress

HE Qing1,2, GUO Ying1,2, ZHOU Zhong-Yuan1,2, WANG You1,2, ZHOU Bin1,2

(1. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Laoshan Laboratory, Qingdao 266237, China)

As typical persistent organic pollutants, polybrominated biphenyl ethers (PBDEs) pose a serious threat to the sustainability of marine life and ecosystems. Using Tetra-BDE (BDE-47) as the stress factor and rotiferas the test organism, the energy-related changes ofin response to BDE-47 stress were studied in metabonomics. The results of BDE-47 stress for 24 hours showed that: the filtering rate and the feeding rate ofdecreased significantly, which inhibited its acquisition of energy materials. The activities of-amylase, lipase, and trypsin ofwere all inhibited, which reduced its digestion efficiency of energy substances. The total adenylate content (TAP) ofdecreased with the increase of BDE-47 concentration, and its energy state changed unfavorably. The decrease of cellular energy distribution ofis the result of the decrease of energy reserve and the increase of energy consumption. Metabonomic analysis showed that there were significant changes in amino acid metabolism, lipid metabolism, and glucose metabolism of.. Twenty-six differential metabolites and 20 metabolic pathways related to amino acid metabolism, lipid metabolism, and glucose metabolism were identified. Amino acid, fatty acid and fructose levels were down-regulated, and lysophosphatidylcholine and phosphoethanolamine were up-regulated. Therefore, the acute toxic stress of BDE-47 affected the acquisition and utilization of energy substances, had a negative effect on the energy state of, and changed its energy distribution.

; BDE-47; energy; metabonomics

* 嶗山實驗室科技創新項目, LSKJ202203700號; 中央高校基本科研業務費專項資金項目, 202061016號; 青年科學基金項目, 42106139號。何 晴, 碩士研究生, E-mail: 15065956848@163.com

周 斌, 博士生導師, 教授, E-mail: zhoubin@ouc.edu.cn

2023-03-08,

2023-04-14

Q955

10.11693/hyhz20230300055