三種有機(jī)紫外吸收劑對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)鰓組織抗氧化能力和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響*

張韋煒 董飛龍 荊 晨 劉尚書 胡豐曉

三種有機(jī)紫外吸收劑對菲律賓蛤仔()鰓組織抗氧化能力和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響*

張韋煒1, 2董飛龍1, 2荊 晨1, 2劉尚書1, 2胡豐曉1, 2①

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)海洋學(xué)院 福建福州 350002; 2. 福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建福州 350002)

二苯甲酮-3 (BP-3)、4-甲基芐亞基樟腦(4-MBC)和4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯(EHMC)是三種常用的有機(jī)紫外吸收劑, 在水環(huán)境中被頻繁檢出, 對水生生態(tài)系統(tǒng)安全構(gòu)成潛在威脅。為探究三種有機(jī)紫外吸收劑對菲律賓蛤仔()鰓組織抗氧化響應(yīng)和相關(guān)細(xì)胞凋亡基因的影響, 將蛤仔分別暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的三種紫外吸收劑溶液中, 檢測鰓組織抗氧化酶活性和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平, 并通過第二代整合生物標(biāo)志物響應(yīng)法(IBRv2)對三種紫外吸收劑的生物毒性進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示, 三種紫外吸收劑短期暴露會(huì)誘導(dǎo)抗氧化響應(yīng)提高抗氧化能力, 而長期高濃度暴露會(huì)導(dǎo)致抗氧化能力的降低。BP-3、4-MBC和EHMC可能通過啟動(dòng)線粒體途徑和介導(dǎo)的死亡受體途徑誘導(dǎo)菲律賓蛤仔鰓組織產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。通過IBRv2分析發(fā)現(xiàn), 在環(huán)境常見濃度1 μg/L的暴露水平下, 短期(1 d, 7 d)暴露時(shí), BP-3對菲律賓蛤仔鰓組織表現(xiàn)出的綜合毒性效應(yīng)最強(qiáng), 而隨著暴露時(shí)間的延長(28 d), 三種紫外吸收劑表現(xiàn)出的綜合毒性效應(yīng)相近。研究結(jié)果為水環(huán)境中有機(jī)紫外吸收劑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了參考數(shù)據(jù)。

有機(jī)紫外吸收劑; 菲律賓蛤仔; 鰓; 氧化脅迫; 細(xì)胞凋亡; 整合生物標(biāo)志物響應(yīng)法

紫外吸收劑(UV filters)可以反射或吸收紫外輻射, 被廣泛應(yīng)用于防曬霜、乳液、肥皂、口紅、牙膏、香水等個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品(personal care products, PCPs)以及建筑材料、涂料、粘合劑、玻璃和鞋子等(Carve, 2021)。這些化合物可分為兩類: 無機(jī)紫外吸收劑和有機(jī)紫外吸收劑(Langford, 2015)。有機(jī)紫外吸收劑主要通過吸收紫外來發(fā)揮作用, 其中二苯甲酮-3 (Benzophenone-3, BP-3)、4-甲基芐亞基樟腦(4-methyl- benzylidene camphor, 4-MBC)和4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯(2-ethyl-hexyl-4-trimethoxycinnamate, EHMC)用途廣泛且使用量巨大(Ruszkiewicz, 2017)。有機(jī)紫外吸收劑通過兩種主要途徑進(jìn)入水生環(huán)境: 游泳等娛樂活動(dòng)的直接輸入和廢水處理廠的間接輸入。大多數(shù)有機(jī)紫外吸收劑是高度親脂性的, 因此可以在生物體和人體中富集。

近年來, 有機(jī)紫外吸收劑污染在廢水、湖泊、河流和海水以及沉積物中被頻繁檢出。例如, 有研究發(fā)現(xiàn)EHMC在處理過的廢水中的濃度在0.01～0.1 mg/L之間, 在未經(jīng)處理的城市廢水中高達(dá)19 mg/L (Balmer, 2005)。BP-3和4-MBC在澳大利亞廢水中的含量分別高達(dá)1 340和691 ng/L (O’Malley, 2020)。BP-3和EHMC在中國巢湖中的檢測濃度分別達(dá)到68.4和32.2 ng/L (Tang, 2018)。在日本河流地表水中BP-3含量為16～41 ng/L之間(Kameda, 2011), 4-MBC和EHMC在維多利亞州菲利普灣河口地表水中的含量分別高達(dá)642和640 ng/L (Allinson, 2018)。4-MBC和EHMC在香港近岸海水中為98.67和55.7 ng/L (Tsui, 2015), 在臺(tái)灣萬里通和南海附近海水中BP-3濃度分別高達(dá)1233和55.7 ng/L (Kung, 2018; Pei, 2023)。在智利和哥倫比亞的海洋沉積物中發(fā)現(xiàn)BP-3、4-MBC和EHMC的最高濃度分別為2.5、7.9和17.8 ng/g(DW) (Rodil, 2009), 而EHMC在中國香港和珠江口的海洋沉積物中甚至分別達(dá)到447 ng/g和0.5 mg/g(DW) (Tsui, 2015; Huang, 2016)。以上數(shù)據(jù)顯示, 這類新興的環(huán)境污染物在水體中廣泛存在, 對水生生態(tài)系統(tǒng)安全造成威脅。

近年來, 越來越多的研究開始關(guān)注有機(jī)紫外吸收劑BP-3、4-MBC和EHMC污染對水生動(dòng)物造成的負(fù)面影響, 包括發(fā)育毒性、生殖毒性、內(nèi)分泌毒性和神經(jīng)毒性等。例如, 在4-MBC暴露下, 塞內(nèi)加爾鰨()的體長縮短、CAT活性下降和氧化損傷增加(Araújo, 2021)。EHMC導(dǎo)致斑馬魚()孵化延遲、畸形增加、多種抗氧化酶活性降低(Nataraj, 2020)。BP-3和4-MBC暴露會(huì)影響大型溞()的蛻皮和發(fā)育, 并上調(diào)內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)(Lambert, 2021)。BP-3能通過MAPK/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)斑馬魚腸神經(jīng)系統(tǒng)異常發(fā)育(Wang, 2021)。然而, 關(guān)于BP-3、4-MBC和EHMC對海洋無脊椎動(dòng)物的毒性研究鮮有報(bào)道。

菲律賓蛤仔() (俗稱花蛤、雜色蛤)目前已成為世界范圍內(nèi)的重要養(yǎng)殖貝類之一, 也常被用作毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)對象和環(huán)境指示物種(Marisa, 2021)。鰓作為濾食性貝類的呼吸和攝食器官, 與海水直接接觸, 在對外源污染物的攝入、富集和解毒代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Li, 2020)。本研究將菲律賓蛤仔暴露于不同濃度的三種有機(jī)紫外吸收劑(BP-3、4-MBC和EHMC)海水溶液中, 檢測鰓組織抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化水平和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的劑量和時(shí)間特異性變化, 并通過第二代整合生物標(biāo)志物響應(yīng)法(IBRv2)來比較分析菲律賓蛤仔對BP-3、4-MBC和EHMC的綜合毒性響應(yīng), 為典型有機(jī)紫外吸收劑對海洋無脊椎動(dòng)物的毒性效應(yīng)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

有機(jī)紫外吸收劑: BP-3 (CAS#131-57-7, 純度≥98%)、4-MBC (CAS#36861-47-9, 純度≥98%)、EHMC (CAS#5466-77-3, 純度≥98%)和內(nèi)標(biāo)BP-3-d5(純度≥ 99%)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。二甲基亞砜(DMSO, 純度≥99%)、純水、丙酮和甲醇均購自美國Thermo公司。本研究中各組DMSO最終濃度均低于0.001%, 以避免溶劑效應(yīng)的干擾(Aguirre- Martínez, 2016)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

菲律賓蛤仔[(3.61±0.14) cm]購自福州市西營里水產(chǎn)市場。在暴露實(shí)驗(yàn)之前, 將菲律賓蛤仔置于40 L塑料養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)一周, 連續(xù)曝氣, 水溫控制在(15±1) °C, 鹽度32, pH 8.1～8.3, 溶解氧(8.0±1.0) mg/L。每日人工投喂螺旋藻粉兩次[30 mg/(ind./d)]。暫養(yǎng)結(jié)束后, 將菲律賓蛤仔暴露于不同濃度(0、1、10和100 μg/L)的BP-3、4-MBC和EHMC海水溶液中28 d, 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)(每個(gè)重復(fù)50只貝)。其中, 1 μg/L為3種有機(jī)紫外吸收劑的水環(huán)境常見濃度(Balmer, 2005; Richardson, 2011), 10和100 μg/L僅能在極端環(huán)境檢測到(Mao, 2019; Huang, 2021)。每天更換全部海水并加入適量的污染物, 以保持BP-3、4-MBC和EHMC的濃度相對穩(wěn)定。每周采集一次水樣凍于?80 °C冰箱, 留待測定紫外吸收劑的實(shí)際濃度。在暴露1 d、7 d和28 d時(shí), 從每個(gè)平行組中隨機(jī)選擇10只菲律賓蛤仔, 解剖收集鰓組織, 置于?80°C中凍存。

1.3 暴露溶液中紫外吸收劑的定量

采用固相萃取法(SPE)對水樣(5 mL,=3)進(jìn)行富集和凈化。用4 mL甲醇和LC級(jí)純水對OASIS?HLB (500 mg, 6 mL)固相萃取柱(Waters, USA)進(jìn)行預(yù)處理。在水樣中加入內(nèi)標(biāo)BP-3-d5并將pH調(diào)整為3.0。裝樣后, 用5 mL水清洗試劑盒, 然后用4 mL丙酮/甲醇(1︰1,/)和6 mL甲醇洗脫, 洗脫液于1 mL水/甲醇(1︰1,/)中在氮?dú)饬?40 °C)下輕輕干燥。參照Fisch等(2021)描述的方法, 在Waters ACQUITY UPLC?H-Plus Class高效液相色譜系統(tǒng)與Waters? XevosTM TQ-XS質(zhì)譜儀(TQ-XS/MS) (Milford, MA, USA)上進(jìn)行定量分析。目標(biāo)物質(zhì)在色譜柱ACQUITY UPLC?C18 (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm粒徑) (Waters, Ireland)上進(jìn)行色譜分離。BP-3、4-MBC和EHMC的平均回收率分別為89%、92%和97%。BP-3、4-MBC和EHMC的檢出限定義為信噪比3︰1, 分別為1.5、4.2和1.5 ng/L。

1.4 鰓組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測

稱取100 mg鰓組織, 將樣品加入液氮后研磨, 根據(jù)質(zhì)量體積比加入9倍預(yù)冷的PBS緩沖液, 旋渦振蕩器充分混勻, 制備組織勻漿液。冰上靜置5 min后, 3 000 r/min、4 °C離心10 min, 取上清液用于酶活性檢測。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性以及谷胱甘肽還原酶(GSH)、丙二醛(MDA)含量的測定均采用比色法, 所用檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 熒光定量PCR

鰓組織總RNA采用Fast Pure? Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2 (南京諾唯贊生物科技有限公司)試劑盒提取。RNA完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 純度用NanoDrop ND-2000c儀器(賽默飛世爾科技公司)進(jìn)行定量。使用HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (gDNA wiper) (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。使用ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)在Roche Light Cycle? 480 Ⅱ熒光定量PCR儀(瑞士羅氏)上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以作為內(nèi)參基因, 采用2–ΔΔCt法來計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量(Livak, 2001; Volland, 2017)。引物通過NCBI網(wǎng)站的在線工具Primer-Blast設(shè)計(jì), 目標(biāo)及內(nèi)參基因的引物序列見表1。

表1 引物序列

Tab.1 The primer sequences

1.6 第二代整合生物標(biāo)志物響應(yīng)法(IBRv2)

整合生物標(biāo)志物響應(yīng)法(Integrated Biomarker Response, IBR)由法國生態(tài)毒理學(xué)家Benoit Beliaeff和Thierry Burgeot首創(chuàng), 經(jīng)過Wilfried Sanchez等改良后形成IBRv2法, 用于全面評(píng)估各種毒理因子對生物的毒害效應(yīng)。本研究將SOD、CAT、GPx、GST的酶活性和GSH、MDA含量, 以及、、、、和基因轉(zhuǎn)錄水平這12個(gè)指標(biāo)全部帶入, 計(jì)算菲律賓蛤仔鰓組織的IBRv2指數(shù)。

計(jì)算方法如下:

(1) 數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化

Y= lg(X/0), (1)

其中,X為某一生物標(biāo)志物在某暴露條件下的均值,0為對照組平均值,Y為標(biāo)準(zhǔn)化值。

(2) 數(shù)值均一化

Z= (Y–) /, (2)

其中,為所有暴露條件下的總均值,為所有暴露條件下的總標(biāo)準(zhǔn)差,Z為均一化值。

(3) 賦值

=Z–0, (3)

其中,0為對照組某生物標(biāo)志物均一化值,為某生物標(biāo)志物在某暴露條件下的生物標(biāo)志物偏差系數(shù), 正值代表誘導(dǎo), 負(fù)值代表抑制。

(4) 計(jì)算IBRv2值

IBRv2 =Σ|/. (4)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有數(shù)據(jù)分析均通過SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)。數(shù)據(jù)的方差齊性和正態(tài)性首先采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和Levene’s檢驗(yàn)。對照組與實(shí)驗(yàn)組間的數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 差異顯著性通過Tukey’s HSD檢驗(yàn), 顯著性水平為<0.05。

2 結(jié)果

2.1 暴露溶液中紫外吸收劑水平分析

暴露溶液中紫外吸收劑的實(shí)際濃度見表2。結(jié)果表明, 實(shí)際的BP-3水平相對穩(wěn)定, 與暴露試驗(yàn)期間的BP-3標(biāo)定濃度接近; 換水后4-MBC的測量濃度基本與標(biāo)準(zhǔn)值相當(dāng), 而在下一次換水前4-MBC的測量濃度下降了約20%; EHMC換水前、后實(shí)際暴露濃度分別為標(biāo)定濃度的50%～95.3%和30%～68.9%。

表2 暴露溶液中的紫外吸收劑濃度

Tab.2 Concentrations of UV filters in exposure solutions

2.2 鰓組織抗氧化酶活性分析

如圖1所示, 在BP-3、4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織SOD活性在1 d時(shí)顯著上升(<0.05), 隨著暴露時(shí)間的延長恢復(fù)到接近或低于對照組水平(除1 μg/L 4-MBC組暴露28 d仍高于對照組水平)(<0.05)。BP-3和4-MBC暴露1 d時(shí)CAT活性受到明顯抑制(<0.05), 7 d和28 d時(shí)恢復(fù)到對照組水平, 而EHMC暴露對CAT活性無顯著影響。在BP-3、4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織GPx活性在1 d和7 d時(shí)無顯著變化(除1 μg/L BP-3組暴露7 d仍高于對照組水平), 隨著暴露時(shí)間的延長, GPx活性低于對照組水平(<0.05)。4-MBC暴露1 d時(shí)GSH含量顯著下降, 隨著暴露時(shí)間的延長, GSH含量恢復(fù)到接近或低于對照組水平(除1 μg/L 4-MBC組暴露28 d仍高于對照組水平) (<0.05); 而在BP-3和EHMC脅迫下, 鰓組織GSH含量在1 d時(shí)無顯著變化, 隨著暴露時(shí)間的延長, GSH含量恢復(fù)到接近或低于對照組水平(除1 μg/L BP-3組暴露7 d仍高于對照組水平) (<0.05)。BP-3、4-MBC和EHMC暴露對GST活性無顯著影響(除1 μg/L EHMC組暴露7 d低于對照組水平)。

圖1 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段對菲律賓蛤仔鰓SOD、CAT、GPx、GST活性和GSH含量的影響(1 d、7 d和28 d)

注: 不同字母表示組間顯著性差異(<0.05)。下同

2.3 鰓組織MDA含量分析

與對照組相比, BP-3 (100 μg/L)和4-MBC (10和100 μg/L)暴露組在1 d時(shí)MDA含量顯著降低(<0.05), 而隨著暴露時(shí)間延長, BP-34-MBC和EHMC各暴露組與對照組相比無顯著性差異(圖2)。

2.4 鰓組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)分析

如圖3所示, 在BP-3、4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織(除10 μg/L BP-3組、1 μg/L 4-MBC組顯著上調(diào))(除100 μg/L EHMC組顯著上調(diào))基因相對表達(dá)量在1 d時(shí)顯著下調(diào)(<0.05), 7 d時(shí)(除10 μg/L EHMC組顯著下調(diào))(除各濃度BP-3組顯著下調(diào))(除1、10 μg/L BP-3組顯著下調(diào))基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05)。BP-3、4-MBC和EHMC暴露1 d時(shí)基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(<0.05), 隨著暴露時(shí)間的延長恢復(fù)到接近或高于對照組水平(除各濃度組BP-3暴露7 d低于對照組水平) (<0.05)。在BP-3和4-MBC脅迫下, 鰓組織基因相對表達(dá)量在1 d時(shí)顯著下調(diào)(除10 μg/L BP-3組顯著上調(diào)) (<0.05), 隨著暴露時(shí)間的延長恢復(fù)到接近或高于對照組水平(<0.05); 而EHMC暴露7 d下調(diào)了基因相對表達(dá)量(除100 μg/L EHMC組顯著上調(diào)) (<0.05), 28 d時(shí)高于對照組水平(<0.05)。BP-3暴露1 d和7 d時(shí)下調(diào)了基因相對表達(dá)量(<0.05), 暴露至28 d時(shí)則高于對照組水平(<0.05); 在4-MBC和EHMC脅迫下, 鰓組織基因相對表達(dá)量在7 d時(shí)顯著上調(diào)(<0.05), 28 d時(shí)顯著下調(diào)(<0.05)。

圖2 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段對菲律賓蛤仔鰓MDA含量的影響(1 d、7 d和28 d)

圖3 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段對菲律賓蛤仔鰓細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53、gadd45、cdk、fas、caspase-2和bcl-2表達(dá)量的影響(1 d、7 d和28 d)

2.5 IBRv2分析

如圖4所示, 雷達(dá)圖展示出不同濃度的三種紫外吸收劑暴露1、7和28 d菲律賓蛤仔鰓中生物標(biāo)志物的偏差系數(shù), 反映出不同生物標(biāo)志物對不同濃度紫外吸收劑暴露的響應(yīng)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 暴露于1 μg/L的三種紫外吸收劑中, 1 d時(shí)SOD活性、GSH含量和轉(zhuǎn)錄水平變化幅度較大; 7 d時(shí)和轉(zhuǎn)錄水平變化幅度較大; 28 d時(shí)和轉(zhuǎn)錄水平變化幅度較大。暴露于10 μg/L的三種紫外吸收劑中, 1 d時(shí)主要是GSH含量變化幅度最大; 7 d時(shí)GST活性、和轉(zhuǎn)錄水平變化幅度較大; 28 d時(shí)CAT和GPx活性以及轉(zhuǎn)錄水平變化幅度較大。暴露于100 μg/L的三種紫外吸收劑中, 1 d時(shí)主要是MDA含量變化幅度最大; 7 d時(shí)主要是GPx和GST活性以及轉(zhuǎn)錄水平變化幅度較大; 28 d時(shí)主要是GPx活性和轉(zhuǎn)錄水平變化幅度較大。

圖4 不同濃度的BP-3、4-MBC和EHMC暴露及不同暴露階段菲律賓蛤仔鰓組織生物標(biāo)志物偏差系數(shù)(1 d、7 d和28 d)

對環(huán)境常見濃度1 μg/L的三種紫外吸收劑暴露下菲律賓蛤仔鰓組織的12種生物標(biāo)志物響應(yīng)的偏差系數(shù)絕對值進(jìn)行求和, 得到1 μg/L三種紫外吸收劑在暴露1 d、7 d和28 d的IBRv2指數(shù)(圖5)。結(jié)果顯示, 三種紫外吸收劑的IBRv2值在暴露1 d時(shí)為BP-3 (1.20) > 4-MBC (1.08) > EHMC (0.79); 暴露7 d時(shí)為BP-3 (1.21) > EHMC (0.89) > 4-MBC (1.18); 暴露28 d時(shí)為BP-3 (1.09) ≈ 4-MBC (1.10) ≈ EHMC (1.04)。

圖5 1 μg/L BP-3、4-MBC和EHMC暴露下菲律賓蛤仔鰓組織的第二代整合生物標(biāo)志物響應(yīng)(IBRv2)指數(shù)(1 d、7 d和28 d)

3 討論

由于有機(jī)紫外吸收劑的廣泛使用、在水環(huán)境中的普遍存在和潛在的生態(tài)毒性效應(yīng), 近年來它們潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)已成為環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(Kwon, 2021)。然而, 目前有關(guān)有機(jī)紫外吸收劑對海洋無脊椎動(dòng)物的毒性效應(yīng)研究鮮見報(bào)道。本研究從誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩方面闡釋BP-3、4-MBC和EHMC三種有機(jī)紫外吸收劑對菲律賓蛤仔鰓組織的毒性效應(yīng), 旨在揭示常見有機(jī)紫外吸收劑對海洋無脊椎動(dòng)物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

抗氧化系統(tǒng)可以通過酶和非酶調(diào)節(jié)保護(hù)生物體免受氧化損傷并維持氧化還原平衡(Birnie-Gauvin, 2017)。SOD和CAT是動(dòng)物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的第一道防線, SOD可以加速自由基轉(zhuǎn)化為H2O2, CAT能夠?qū)2O2分解成水, 從而清除ROS減少機(jī)體氧化應(yīng)激損傷(Lesser, 2006)。在本研究中, 三種紫外吸收劑短期暴露顯著誘導(dǎo)了鰓組織SOD酶活性升高, 隨著暴露時(shí)間延長SOD酶活性恢復(fù)到接近或低于對照組水平, 并且高濃度暴露組的抑制作用更加顯著, 表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量特異性變化, 這與高濃度BP-3暴露28 d后的鯽魚組織SOD活性下降的結(jié)果一致(Liu, 2015)。本研究發(fā)現(xiàn)短期的BP-3和4-MBC暴露會(huì)抑制鰓中CAT活性, 隨著暴露時(shí)間的延長, 所有處理組的CAT活性均與對照組無顯著性差異。Campos等(2017)將搖蚊四齡幼蟲()暴露于4-MBC中48 h后也觀察到CAT活性下降。長時(shí)間暴露下, CAT活性的恢復(fù)可能是機(jī)體面對紫外吸收劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生的適應(yīng)性響應(yīng)(Zhang, 2014a)。一項(xiàng)近期研究同樣發(fā)現(xiàn), 4-MBC暴露15 d后不會(huì)導(dǎo)致斑馬魚5 dpf (days post fertilization, 受精后天數(shù))幼蟲的CAT活性變化(Prakash, 2022)。GPx和GSH一起參與H2O2的分解, 作為共同底物清除過多的ROS來防止氧化性細(xì)胞損傷(Binelli, 2011)。有研究表明, 暴露于BP-34-MBC和EHMC的嗜熱四膜蟲() GPx活性在24 h后均未見明顯變化, 這與本研究結(jié)果一致(Gao, 2013)。但是在28 d時(shí)暴露于100 μg/L的3種紫外吸收劑的鰓中GPx活性顯著降低, 這與BP-3暴露30 d后的斑馬魚GPx活性顯著降低結(jié)果一致(Velanganni, 2021), 這些結(jié)果顯示紫外吸收劑長期暴露會(huì)導(dǎo)致GPx活性下降, 并表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。此外, 在本研究中高濃度的4-MBC和EHMC暴露28 d時(shí), 會(huì)導(dǎo)致鰓中GSH含量顯著下降。作為維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的重要物質(zhì), GSH含量的減少會(huì)破壞機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng), 導(dǎo)致氧化應(yīng)激(Lushchak, 2012)。GST是一種Ⅱ相代謝酶, 能催化外源物質(zhì)與GSH結(jié)合, 加速排出體外從而達(dá)到解毒代謝的目的。本研究發(fā)現(xiàn)在整個(gè)暴露期間, 大多數(shù)濃度組的GST活性均無顯著變化。與本研究結(jié)果相似, 有研究報(bào)道將搖蚊四齡幼蟲暴露在不同濃度BP-3或OC中, 48 h內(nèi)同樣未觀察到GST活性顯著變化(Campos, 2017)。這些結(jié)果說明GST可能不是典型有機(jī)紫外吸收劑污染的敏感生物標(biāo)志物。

MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物, 其含量變化可反映膜系統(tǒng)遭受氧化傷害的程度。本研究發(fā)現(xiàn)在100 μg/L的BP-3和4-MBC暴露1 d時(shí)菲律賓蛤仔鰓中MDA含量顯著降低, 7 d和28 d時(shí)無顯著性變化。與本研究結(jié)果相似, 有學(xué)者將10 μg/L的BP-3脅迫黃尾藍(lán)魔魚7 d后, 在其肝臟內(nèi)未觀察到MDA含量顯著變化(柯懷泱等, 2022)。本研究結(jié)果說明紫外吸收劑短期暴露會(huì)提高抗氧化防御能力, 降低脂質(zhì)過氧化水平; 隨著暴露時(shí)間延長, 機(jī)體面對有機(jī)紫外吸收劑引起的氧化應(yīng)激做出適應(yīng)性防御, 導(dǎo)致鰓中脂質(zhì)過氧化水平恢復(fù)至對照組水平。

細(xì)胞凋亡是一種基因調(diào)控的能使細(xì)胞產(chǎn)生主動(dòng)而有序的死亡的細(xì)胞自殺機(jī)制, 主要分為內(nèi)源性途徑[線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激誘導(dǎo)途徑]和外源性途徑(死亡受體途徑) (Redza-Dutordoir, 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)三種紫外吸收劑暴露可能通過線粒體途徑和介導(dǎo)的死亡受體途徑誘導(dǎo)菲律賓蛤仔鰓組織細(xì)胞凋亡。

可調(diào)控多個(gè)下游基因的轉(zhuǎn)錄, 包括、、等, 誘導(dǎo)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。腫瘤抑制基因能阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡(魏永永等, 2012)。是調(diào)控的生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)型基因, 其可介導(dǎo)DNA修復(fù)、細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。能控制細(xì)胞周期進(jìn)程?？沟蛲龀蓡T在線粒體外膜發(fā)揮作用, 以保持膜的完整性。本研究結(jié)果顯示, 長期暴露于高濃度的三種紫外吸收劑中, 鰓內(nèi)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)并呈濃度依賴性升高, 這表明紫外吸收劑暴露可導(dǎo)致的激活, 從而通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)暴露于100 μg/L三種紫外吸收劑1 d時(shí)菲律賓蛤仔鰓內(nèi)和基因相對表達(dá)量顯著下調(diào), 而隨著暴露時(shí)間延長顯著上調(diào)。有研究報(bào)道下調(diào)能促進(jìn)細(xì)胞補(bǔ)償性增殖;上調(diào)在一定程度上能降低細(xì)胞凋亡比例(Zhang, 2014b; 呂童歆等, 2023)。此外, 先前研究發(fā)現(xiàn)將菲律賓蛤仔暴露于高濃度4-MBC (10和100 μg/L) 7 d時(shí)編碼基因顯著高表達(dá)(Santonocito, 2020)。這些下游基因的顯著表達(dá)可能和被激活有關(guān), 進(jìn)一步說明和參與線粒體途徑的細(xì)胞凋亡(曾小莉, 1999; Schade, 2019)。此外,可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因的轉(zhuǎn)錄, 調(diào)控細(xì)胞凋亡(Wei, 2021)。Bcl-2是這個(gè)家族中抗凋亡因子, 主要存在于線粒體膜上, 通過與促凋亡因子Bax形成二聚體從而起到抑制凋亡的作用(Czabotar, 2014)。在本研究中, 暴露于高濃度4-MBC和EHMC (10和100 μg/L)7 d時(shí)鰓內(nèi)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)。與此相似, 在10和100 μg/L的4-MBC暴露7 d后, 菲律賓蛤仔消化腺中基因表達(dá)量顯著增加(Santonocito, 2020)。因此, 機(jī)體可能通過上調(diào)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來抑制紫外吸收劑短期暴露導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。有研究表明, 丙硫菌唑通過上調(diào)表達(dá), 下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡(Shen, 2021), 這與本研究28 d時(shí)觀察到鰓組織內(nèi)基因的上調(diào)表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平下降的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明, 長期高濃度的4-MBC和EHMC暴露能激活通路, 削弱的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。而在本研究中, BP-3暴露組抗細(xì)胞凋亡基因相對表達(dá)量短期內(nèi)顯著下調(diào), 繼續(xù)暴露至28 d時(shí)則顯著上調(diào)。這結(jié)果表明, 長期暴露于BP-3后, 菲律賓蛤仔可能通過上調(diào)鰓內(nèi)表達(dá)來阻遏細(xì)胞凋亡(Novo, 2006)。

介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是重要的死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一(Pallepati, 2011)。是癌細(xì)胞中應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所需的起始Caspase, 與等的表達(dá)密切相關(guān)(Zhivotovsky, 2005; Baptiste-Okoh, 2008)。在本研究中, 暴露1 d時(shí)100 μg/L的4-MBC和EHMC顯著下調(diào)了鰓內(nèi)基因相對表達(dá)量, 但在7 d和28 d時(shí)均被顯著誘導(dǎo), 這說明被胞外刺激激活向胞內(nèi)傳遞更多信號(hào)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Elmore, 2007)。有研究報(bào)道H2O2暴露后, 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中基因表達(dá)量顯著上調(diào), 而抑制基因表達(dá)在一定程度上能降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比例(靳青等, 2022)。因此, 本研究中有機(jī)紫外吸收劑也可能是通過上調(diào)的表達(dá)從而激活死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外, 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 菲律賓蛤仔暴露于100 μg/L的BP-3和4-MBC 1d時(shí)鰓組織中基因相對表達(dá)量顯著下調(diào), 而暴露于10 μg/L和100 μg/L三種紫外吸收劑28 d時(shí)鰓內(nèi)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)。同樣, 朱含開等(2008)發(fā)現(xiàn)五氯酚暴露能引起斑馬魚胚胎表達(dá)上調(diào)增加細(xì)胞凋亡。已有研究證實(shí), 通過膜的死亡受體作用,被細(xì)胞外部因子活化后激活, 誘導(dǎo)死亡受體途徑的細(xì)胞凋亡; 這兩種還可通過Bid裂解激活線粒體途徑(Pallepati, 2010)。綜上所述, 本研究結(jié)果表明, 三種紫外吸收劑的長期暴露可上調(diào)鰓內(nèi)和表達(dá), 既能激活死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 又可增加線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

第二代整合生物標(biāo)志物響應(yīng)法(IBRv2)是目前生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域表征某種污染物對受試生物的綜合毒性效應(yīng)常用的研究方法。本研究中通過與參照值比較多種生物標(biāo)志物的偏差系數(shù)發(fā)現(xiàn), 12種不同生物標(biāo)志物對BP-3、4-MBC和EHMC的響應(yīng)情況有明顯差異。暴露在環(huán)境常見濃度1 μg/L的三種紫外吸收劑1 d時(shí), SOD活性、GSH含量和轉(zhuǎn)錄水平指標(biāo)變化幅度大, 而7 d和28 d、、和轉(zhuǎn)錄水平指標(biāo)變化幅度較大, 這表明紫外吸收劑短期暴露主要引起氧化脅迫響應(yīng), 而隨著暴露時(shí)間的延長, 主要的生物學(xué)響應(yīng)與細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外, 本研究發(fā)現(xiàn), 在環(huán)境常見濃度1 μg/L的三種紫外吸收劑短期暴露下, BP-3表現(xiàn)出最強(qiáng)的毒性效應(yīng), 而隨著暴露時(shí)間的延長, 三種紫外吸收劑表現(xiàn)出相近的毒性效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明, 短期暴露于有機(jī)紫外吸收劑會(huì)誘導(dǎo)菲律賓蛤仔鰓組織抗氧化響應(yīng), 而長期高濃度暴露則會(huì)削弱其抗氧化防御能力。BP-3、4-MBC和EHMC可能通過激活線粒體途徑和介導(dǎo)的死亡受體途徑從而誘導(dǎo)菲律賓蛤仔鰓組織細(xì)胞凋亡。IBRv2分析發(fā)現(xiàn)短期暴露環(huán)境常見濃度1 μg/L時(shí), BP-3表現(xiàn)出的綜合毒性效應(yīng)最強(qiáng)。本研究結(jié)果為典型有機(jī)紫外吸收劑BP-3、4-MBC和EHMC的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及對海洋無脊椎動(dòng)物的毒性機(jī)制研究提供了重要參考。

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EFFECT OF THREE ORGANIC ULTRAVIOLET FILTERS ON ANTIOXIDANT CAPACITY AND EXPRESSION OF APOPTOSIS-RELATED GENES IN GILLS OF

ZHANG Wei-Wei1, 2, DONG Fei-Long1, 2, JING Chen1, 2, LIU Shang-Shu1, 2, HU Feng-Xiao1, 2

(1. College of Marine Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2.Key Laboratory of Marine Biotechnology of Fujian Province, Fuzhou 350002, China)

Benzophenone-3 (BP-3), 4-methyl-benzylidene camphor (4-MBC), and 2-ethyl-hexyl-4-trimethoxycinnamate (EHMC) are commonly used organic ultraviolet (UV) filters. Recently, these UV filters have been frequently detected in aquatic environment, posing a potential threat to the safety of aquatic ecosystem. To investigate the effects of the three UV filters on the antioxidant response ofgill and apoptosis-related genes,was exposed to the three filters at environmentally relevant concentrations, and the activity of antioxidant enzymes and transcriptional levels of apoptosis-related genes in gills were investigated. Afterwards, the adverse effects of the filters were compared and analyzed using the Integrated Biomarker Response (IBR) (Version 2) method. Results show that the organic UV filters could induce initial antioxidative response to improve antioxidant capacity, while a long-term exposure to high concentrations of the UV filters could decrease the antioxidant capacity. In addition, the three filters could induce apoptosis in the gill tissue ofvia mitochondria pathway and death receptor pathway. After exposure to the three organic UV filters at common environmental concentration (1 μg/L) for 1 d and 7 d, BP-3 exhibited the strongest toxic effects ongill; and the biomarker responses were similar among the three filters in 28 d. Therefore, the toxicity of organic UV filters depends on chemical species, exposure dose, and exposure duration. This study provides reference data for ecological risk assessment of organic UV filters in aquatic environments.

organic UV filters;; gill; oxidative stress; apoptosis; integrated biomarker response

* 自然資源部東南生態(tài)脆弱區(qū)監(jiān)測修復(fù)工程技術(shù)創(chuàng)新中心自主研究課題, KY-090000-04-2022-017號(hào); 福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目, S202210389038號(hào)。張韋煒, 碩士研究生, E-mail: zhangweiwei0605@126.com

胡豐曉, 博士, 碩士生導(dǎo)師, E-mail: hufengxiao@fafu.edu.cn

2023-06-18,

2023-09-19

Q957; S968.3; Q789

10.11693/hyhz20230600126