乳及乳制品三聚氰胺檢測中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的運用

◎ 王飛雄

（高培（廣州）乳業(yè)有限公司，廣東 廣州 511300）

三聚氰胺也被稱之為密胺，相對分子量為126.12，屬于三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物。目前，在化工、醫(yī)藥、食品生產(chǎn)以及涂料等領(lǐng)域中，對于三聚氰胺的使用量相對較高。其中，部分食品企業(yè)在乳與乳制品生產(chǎn)過程中，為了提高食品中的蛋白質(zhì)含量，加入了一定含量的三聚氰胺。三聚氰胺具備一定的毒性，對人體的生命健康安全造成影響。部分生產(chǎn)廠家為了降低成本，在檢測三聚氰胺的過程中采取了凱式定氮法，該方法僅能檢測物品的含氮量，為此，本研究通過利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，完成乳與乳制品三聚氰胺檢測工作，確保乳與乳制品的食用安全[1]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

采用LCMS-8040高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀、MS3Digital漩渦混合器、ME303電子天平、B-400粉碎均質(zhì)機、CF16RXII高速離心機以及L22-500B超聲波清洗機。以液態(tài)乳、酸奶作為樣品。由德國采購純度為99.5%的三聚氰胺，乙腈與乙酸為色譜純，0.22 μm微孔濾膜、純度達到90%的二氯甲烷、乙酸銨、鹽酸。

1.2 標準溶液的配制

①標準儲備液。稱取0.1 mg三聚氰胺標準品置于100 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液（體積比1∶1）溶解并定容至刻度，制備質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，保存到溫度為20 ℃的避光環(huán)境中。②三氧乙配溶液（1%）的配制。準確稱取三氧乙酸2.5 g（精確至0.1 mg）于250 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻后備用。③標準曲線繪制。采取流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋，配置0.40、0.80、2.00、4.00 μg/mL，進樣10 μL，保留時間7.8 min定性，峰面積定量，回歸方程Y=1.8×10-4X-0.36（r=0.999）。

1.3 樣品前處理

在實驗檢測前，準確稱取0.5 g樣品，使用15 mL的具塞塑料離心管吸入10 mL比例為1∶1的乙腈-水溶液，渦旋時間控制在30 s，利用超聲提取25 min，使溶液以8 000 r/min離心10 min，提取液轉(zhuǎn)入25 mL比色管后，加入10 mL二氯甲烷，再加入150 μL HCl(1 mol/L)，進行密封處理振蕩2 min，取出1 mL上清液，并加入4 mL的乙腈完成稀釋，使用0.22 μm濾膜完成過濾[2]。

1.4 色譜分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLCBEHHILIC（2.1×75 mm,1.7 μm）；柱溫：0～40 ℃；流速：0.6 mL/min；流動相：由80%乙腈和20%水混合；進樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子檢測模式；離子源溫度控制在150 ℃；毛細管電壓控制為3.5 kV；脫溶劑溫度控制在550～600 ℃，萃取電壓控制在3～5 V；脫溶劑氣為N2、錐孔氣為N2；脫溶劑與錐孔氣流速分別控制在600 L/h與50 L/h；碰撞氣屬于高純氬氣，碰撞室壓力控制在35 MPa；離子對駐留時間控制在0.16 s。離子監(jiān)測條件如表1所示。

表1 離子監(jiān)測條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的選擇

乳與乳制品中包含了大量的蛋白質(zhì)以及脂肪，在實驗中需對樣品進行提前處理。降低基質(zhì)效應(yīng)，促使實驗檢測靈敏度得到提高。在研究中使用液液萃取、超聲波萃取等方式，結(jié)合三聚氰胺可溶于乙腈的特點，而乙腈則具備蛋白質(zhì)沉淀作用，為此提取液選擇以乙腈-水溶液為主，根據(jù)GB 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》，乙腈-水比例分別控制為8∶2、7∶3、5∶5。最終實驗結(jié)果顯示，乙腈-水溶液比例控制在5∶5，三聚氰胺提取效率達到最高，乳與乳制品中的蛋白質(zhì)沉淀效果達到最佳。在超聲波提取作業(yè)開展中，主要是為了提高三聚氰胺的提取效率。在實驗中，超聲波提取時間控制在25 min，三聚氰胺提取效率達到最高，超出25 min無法提高三聚氰胺提取效率。乳與乳制品取樣時，發(fā)現(xiàn)樣品中含有3%脂肪含量，通過使用二氯甲烷以液液萃取方式去除脂肪，提取液用乙腈以1∶4倍稀釋，避免對實驗過程造成干擾[3-4]。

2.2 色譜條件優(yōu)化

三聚氰胺具備親水性與強極性特點，在C18色譜柱上難以實現(xiàn)保存。為此，在實驗過程中，利用親水作用色譜柱（HILIC），可保留三聚氰胺，達到分離檢測定性量目的。流動相選擇時，應(yīng)考慮流動相對組分的洗脫能力，確保離子化效率得到有效提高。為此，分別選擇了0.1%、0.2%的甲酸-水與5 mol/L、10 mol/L醋酸銨、甲醇以及乙腈。發(fā)現(xiàn)正離子模式下常用的甲酸-水對出峰影響相對較低，10 mol/L醋酸銨溶液對出峰影響較為顯著，乙腈作為流動性有機相優(yōu)于甲醇，最后維持流動性體系10 mol/L醋酸銨溶液的基礎(chǔ)上，選擇乙腈-水溶液流動性配比，確定本文研究中1.4的流動性比例與梯度。三聚氰胺標準溶液的離子流色譜如圖1所示。

圖1 三聚氰胺標準溶液的離子流色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在實驗中配置濃度達到500 μg/mL的三聚氰胺標準溶液，以質(zhì)譜正負離子模式為基礎(chǔ)，對樣本進行全面掃描。由于正離子模式實驗靈敏度相對較高，所以在實驗中采取ESI源正離子模式掃描。通過對三聚氰胺分子量126.12掃描后，找出母子離子，使用產(chǎn)物離子模式掃描找出2個子離子峰，對離子與電壓進行優(yōu)化與微調(diào)，從而獲得m/z67定性子離子與m/z84定量子離子。在實驗中確定離子駐留時間以及碰撞電壓，明確母子離子電壓質(zhì)譜參數(shù)，為三聚氰胺檢測創(chuàng)造條件。各項參數(shù)如表2所示。

表2 三聚氰胺檢測質(zhì)譜參數(shù)表

2.4 標準曲線及方法檢測限

在實驗檢測工作開展中，利用UPLC-MS/MS完成質(zhì)量濃度0.5～100 μg/L的三聚氰胺標準工作液測定工作，定量離子峰面積為Y，10%標準溶液質(zhì)量溶度設(shè)置為X，獲取線性方程組Y=372.0X-57.50，線性關(guān)系（r=0.999），在空白基質(zhì)樣品中，逐級加入三聚氰胺標準溶液，在信噪比（S/N）大于10，濃度達到5 μg/kg時，最終方法檢出限（LOD，S/N= 3）為0.005 mg/kg，定量限（LOD，S/N=10）為0.001 7 mg/kg。

2.5 方法的精密度和回收率

在乳與乳制品檢測工作開展中，以液態(tài)乳以及酸奶為樣品，根據(jù)本文2.1樣品前處理的選擇完成樣品處理作業(yè)，利用LC-MS/MS完成分析。在相同條件、同一時間下，每個濃度水平重復(fù)測定次數(shù)控制在6次以上，每一次檢測后計算出回收率與（RSD）相對標準偏差。計算結(jié)果如表3所示。根據(jù)表3中的各項數(shù)據(jù)信息，發(fā)現(xiàn)樣品檢測回收率控制在91.0%～97.5%之間，標準偏差小于9.05%，從而證明液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測效果較為顯著。

表3 回收率與（RSD）相對標準偏差表

3 結(jié)語

綜上所述，在乳與乳制品三聚氰胺檢測工作開展中，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的有效運用，以乙腈-水溶液（5∶5）作為提取液，通過液液萃取完成乳與乳制品蛋白質(zhì)以及脂肪提取，利用稀釋完成樣品實驗。在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法使用的過程中，整體操作較為簡易，減少了各種試劑以及材料的使用，增強了三聚氰胺檢測定性與定量的準確度，滿足三聚氰胺檢測標準要求[5]。