基于網絡藥理學探討巴蜀顆粒防治新型冠狀病毒肺炎的潛在物質基礎初探

古麗再帕爾·托合尼亞孜, 陳 偉, 王 楠, 馬 芹

(1新疆醫科大學藥學院, 烏魯木齊 830017; 2新疆華世丹藥物研究有限責任公司, 烏魯木齊 830011)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染導致的肺炎,是一種急性呼吸道傳染病,以發熱、干咳、乏力等為主要表現,少數患者會伴有鼻塞、流涕等上呼吸道癥狀,重癥患者可出現全身炎癥反應綜合征(SIRS)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等[1]。SARS-CoV-2入侵人體細胞過程中,病毒膜衣殼上的刺突蛋白(S蛋白)與人血管緊張素轉換酶2(ACE2)作為受體結合完成附著,進入細胞后基因組釋放到胞質中,開始編碼能精確剪切復制酶多肽的剪切酶,即為木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLpro)和3C樣蛋白酶(3CLpro)[2-5]。這些蛋白在SARS-CoV-2的治病過程中發揮著至關重要的作用。SARS-CoV-2入侵人體后患者血漿中細胞因子和趨化因子水平顯著上升,即產生炎癥因子風暴[6]。巴蜀顆粒由巴旦仁、蜀葵子、神香草、睡蓮花、甘草浸膏、阿拉伯膠6種藥材組成,臨床上多用于感冒、咳嗽、痰多及哮喘的治療。巴旦仁、蜀葵子和甘草浸膏可解表散寒,宣肺止咳,潤喉解渴共為君藥;神香草、 睡蓮花疏散風寒,祛痰平喘,散氣止痛共為臣藥;阿拉伯膠宣肺下氣、止咳化痰、利咽止痛共為佐藥;甘草浸膏又兼使藥,諸藥相須相佐,相輔相成,共奏辛溫解表,宣肺散邪之功。諸藥合用具有解表散寒、調節異常氣質、止咳祛痰、宣肺止喘、利咽止痛之功效。本研究通過網絡藥理學、分子對接和細胞炎癥模型初步探究巴蜀顆粒治療COVID-19的活性成分物質基礎,揭示其作用機制和相關信號通路。

1 材料與方法

1.1 材料中藥系統藥理學數據庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database, TCMSP),中醫藥整合藥理學研究平臺(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP),Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanismof Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM),中藥藥理數據庫(Traditional Chinese Medicines Integrated Database,TCMID),UniProt數據庫,疾病數據庫(GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank),String數據庫、Pubchem數據庫。AutoTools(1.5.7版)、PyMOL(1.0.0版)、Cytoscape(3.8.0版)網絡分析軟件,Imag軟件,raphPadPrism8軟件。Raw264.7細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司),巴蜀顆粒(華世丹藥物研究有限責任公司);RPMI-1640培養基(Gibco公司),胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司),LPS(Sigma-Aldrich公司),槲皮素、山奈酚、木犀草素(中國食品藥品檢定研究院),BCA蛋白測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),Phospho-NF-κBp65抗體、NF-κB p65抗體(AffinityBioscienc公司),iNOS抗體、β-actin抗體(Boster Biological Technology公司)。

1.2 巴蜀顆粒中6種藥材的成分收集與篩選通過TCMSP、TCMIP、BATMAN-TCM、TCMID數據庫分別搜索巴蜀顆粒6種藥材中的化學成分,其中巴旦仁、蜀葵子、神香草、睡蓮花、阿拉伯膠未完整收錄于這4個數據庫中,故采用在中國知網上查詢已發表的相關文獻來進行化學成分搜集,以藥物口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18作為篩選標準來選出巴蜀顆粒中的有效成分群,然后再通過數據庫尋找該成份。

1.3 巴蜀顆粒中生物活性成分的靶點預測通過利用TCMSP數據庫的靶點預測功能搜集出巴蜀顆粒中所含有化學成分的靶點蛋白,再用UniProt數據庫對所預測的潛在靶點以“Homo sapiens”篩選并進行基因-蛋白名稱轉化,即將全部蛋白名稱轉換為基因標準化的名稱。

1.4 新型冠狀病毒肺炎發病相關基因靶點的獲取在GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank等疾病數據庫中以“COVID-19、SARS-Cov-2、Novelcoronavirus”為關鍵詞搜集已知的與新冠病毒肺炎感染及發病相關的靶點基因的搜集和篩選,刪除重復的基因,構建新冠病毒肺炎相關基因數據庫。

1.5 構建巴蜀顆粒顆粒藥物-成分-點網絡與PPI網絡將“1.3”項下中的藥物成分相關基因與“1.4”項下中的發病相關靶基因取交集,通過String數據庫對這些共同的交集基因進行蛋白-蛋白相互作用分析。對置信度得分≥0.95設定閾值,對蛋白相互作用進行篩選。以“Human Sapiens”為關鍵詞篩選得到COVID-19感染及發病相關的主要靶基因,構建成蛋白-蛋白相互作用的網絡圖。采用Cytoscape 3.8.0軟件進行藥物-成分-靶點-疾病網絡的構建與可視化,通過Bisogenet插件對潛在靶點進行蛋白互作網絡(PPI)的構建,繪制核心蛋白互作網絡圖。

1.6 GO富集分析與KEGG通路富集分析采用Rx64軟件對“1.5”項下獲得的潛在靶點交集進行基因本體論富集分析(GO)和京都基因與基因組百科全書信號通路富集(KEGG)分析,設定閾值P≤0.05, 篩選具有顯著性差異的生物過程和靶點,P值越小,表明富集顯著程度越高。

1.7 核心成分-靶點分子對接通過PubChem數據庫將“藥物-成分-靶點網絡圖”中的關鍵活性成分的2D結構式下載下來后,用Chem3D軟件進行3D優化,使結構式能量最小化作為對接配體。再把COVID-19感染發病相關的3CLpro、ACE2、PLpro蛋白靶點分子結構在PDB數據庫中找到,用AutoTools 對其晶體結構蛋白進行預處理,計算電荷,作為用于做分子對接的受體。得到的配體和受體使用Autodock Vina進行對接,再用PyMOL軟件對其分子對接結果進行構象作圖。

1.8 巴蜀顆粒和活性成分對LPS刺激的巨噬細胞炎癥調控蛋白的影響將Raw264.7細胞以每孔1×106個接種至6孔板,培養8h,貼壁,分為8組:空白組、LPS刺激組、巴蜀顆粒(高、中、低劑量)和LPS共刺激組、槲皮素和LPS共刺激組、山奈酚和LPS共刺激組、木犀草素和LPS共刺激組。在對應組別中分別加入巴蜀顆粒(高劑量200 μg/mL、中劑量100 μg/mL、低劑量10 μg/mL)、槲皮素、山奈酚、木犀草素終濃度10 μg/mL的藥物溶液孵育0.5 h,再加入終濃度5 μg/mL LPS溶液,孵育24 h后,棄去上清,加入細胞裂解液,用BCA法對每組進行蛋白總濃度檢測。加入上樣緩沖液,100℃煮樣10 min,以每組總蛋白蛋白上樣量為20 μg,逐個加入至10% SDS-PAGE凝膠樣品槽內,進行Western-blot蛋白檢測;用凝膠成像系統曝光成像,將曝光后的條帶用 ImageJ 軟件進行灰度值分析,Graph Pad Prism8軟件進行t檢驗分析。

2 結果

2.1 巴蜀顆粒中藥物的活性成分與靶點檢索到巴蜀顆粒中6種中藥化學成分共144個,其中巴旦仁26個,甘草92個,蜀葵子11個,神香草7個,睡蓮花8個。通過TCMSP數據庫4查詢作用靶點,去除重復的成分和靶點后共獲得藥物成分115個,靶點295個。通過Uniprot數據庫中的人屬基因-蛋白名稱轉化后得到的巴蜀顆粒中活性成分的靶點238個,篩選出對應的活性成分101個。

2.2 新型冠狀病毒肺炎相關基因按照“1.4”項下方法在5個疾病數據庫中搜集COVID-19相關基因靶點,其中GeneCards數據庫1 812個,PharmGkb數據庫8個,Drugbank數據庫25個,OMIM數據庫2個,TTD數據庫67個。除去重復的基因靶點,共獲得1879個相關疾病基因靶點,見圖1。

圖1 新型冠狀病毒肺炎相關基因韋恩圖

2.3 巴蜀顆粒治療COVID-19的潛在基因將巴蜀顆粒活性化成分相關基因與COVID-19發病相關基因取交集,共獲得巴蜀顆粒治療新型冠狀病毒肺炎的潛在基因66個,見圖2。

圖2 巴蜀顆粒與新冠肺炎基因交集韋恩圖

2.4 巴蜀顆粒治療COVID-19的藥物成分-靶點-疾病網絡將藥物成分相關基因與發病相關靶基因取交集后的基因與藥物成分導入到Cytoscape軟件中,構建藥物成分-靶點-疾病網絡圖。網絡圖中有167個節點,751條邊。根據網絡的拓撲學性質度值排序確定關鍵節點,度值大于等于2倍中位數的成分有3個,見表1;基因有14個,分別是ESR1、AR、NOS2、RELA、F10、GSK3B、SCN5A、DPP4、F2、BCL2、TNF、AKT1、HMOX1、SLC6A4,為網絡中的較關鍵的基因節點是網絡中關鍵的基因節點,見圖3。

表1 巴蜀顆粒治療新冠肺炎潛在活性成分

圖3 巴蜀顆粒治療新冠肺炎的藥物成分-靶點-疾病網絡圖

2.5 蛋白相互作用網絡分析通過String數據庫對66個共同的交集基因進行蛋白-蛋白相互作用分析,再對關鍵靶點進行蛋白相互作用網絡的構建,根據網絡的拓撲學性質篩選出核心網絡,見圖4-7。蛋白互作網絡中最終篩選出核心蛋白有STAT3、MAPK1、JAK1、IL-2。

圖4 巴蜀顆粒與新冠肺炎交集基因的PPI網絡圖

圖5 靶點蛋白相互作用網絡圖

圖6 一次篩選后的蛋白相互作用網絡圖

圖7 二次篩選后的蛋白相互作用網絡圖

2.6 GO富集分析運用Bioconductor 生信軟件包,借助R語言對66個交集靶點基因進行GO功能富集分析,2 140個GO項被顯著富集(P<0.001),其中2 041項在生物過程(Biological Process,BP)中,17項在細胞組成(Cell Component,CC)中,82個在分子功能(Molecular Function,MF)中,見圖8。

圖8 巴蜀顆粒治療新冠肺炎作用靶點的GO富集分析

2.7 KEGG通路富集分析運用Rx64對獲得的66個交集靶點基因進行KEGG通路富集分析,得到148條信號通路(P<0.001),見圖9。分析巴蜀顆粒治療新冠肺炎作用靶點的前30個基因通路中發現包含有hsa05171:冠狀病毒病-新型冠狀病毒肺炎、hsa05164:甲型流感病毒病、hsa05167:卡波西肉瘤-相關的皰疹病毒感染、hsa05163:人巨細胞病毒感染、hsa05160:丙型肝炎、hsa05162:麻疹、hsa05161:乙型肝炎、hsa05169:愛潑斯坦-巴爾病毒感染等多種病毒引起疾病相關信號通路;包含一些寄生蟲和細菌感染引起的疾病相關信號通路;以及hsa04064:NF-κB信號通路、hsa04657:白細胞介素-17信號通路、hsa04668:TNF信號通路、hsa04620:Toll樣受體信號通路、hsa04660:T細胞受體信號通路等炎癥相關信號通路。

圖9 巴蜀顆粒治療新冠肺炎作用靶點的KEGG富集分析

2.8 核心成分-靶點分子對接一般認為配體與受體結合的構象穩定時能量越低,發生作用的可能性越大。3CLpro與臨床推薦藥物Paxlovid的分子對接結合能為-7.0 kcal/mol,本研究選擇的槲皮素、山奈酚、木犀草素3個活性成分與受體蛋白的結合能均小于-7.0 kcal/mol,表明以上3個活性成分有著治療新冠肺炎的潛力,見表2。

表2 巴蜀顆粒活性成分作用于COVID-19中靶點的分子對接位點及結合能

2.9 巴蜀顆粒和篩選潛在成分對LPS刺激的巨噬細胞iNOS、p65調控蛋白的影響選擇NOS2(iNOS)和RELA(p65)進行Western-blot蛋白檢測,結果表明巴蜀顆粒高、中、低劑量組均可降低由LPS刺激而增多的iNOS的表達量,還可以降低p65蛋白的磷酸化,且具有劑量依賴性,見圖10-12。3個活性成分的對照組iNOS和p-p65蛋白的表達量降低,差異均具有顯著性,見圖13-15。

圖10 巴蜀顆粒對iNOS、p-65蛋白調控電泳圖

圖11 巴蜀顆粒對iNOS蛋白表達量變化的影響

圖12 巴蜀顆粒對p-p65/p65蛋白表達量變化的影響

圖13 活性成分對iNOS、p-65蛋白調控電泳圖

圖14 活性成分對iNOS蛋白表達量變化的影響

圖15 活性成分對p-p65/p65蛋白表達量變化的影響

3 討論

新冠肺炎成為世界性流行病。金花清感顆粒、蓮花清溫膠囊、清肺解毒湯、宣肺敗毒顆粒、化濕敗毒顆粒等中藥在新冠肺炎的防治中發揮了重要的作用。研究發現可結合分子生物學、網絡藥理學和分子對接分析用來探索中藥方劑治療新冠肺炎的潛在分子機制[7]。本課題組前期研究發現復方巴旦仁顆粒含有大量黃酮類成分如槲皮素、山奈素和鼠李糖苷,對小鼠有明顯的止咳化痰作用[8]。

本研究通過細胞炎癥模型驗證巴蜀顆粒對iNOS表達和p65蛋白磷酸化有顯著抑制作用。新冠病毒復制觸發單核細胞、巨噬細胞、粒細胞的活化,導致細胞因子風暴,大量分泌包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α的促炎細胞因子,趨化因子等,進而導致組織的重度炎癥和組織纖維化及肺炎[9-10]。SARS-CoV-2感染會觸發NF-κB和Toll樣受體信號通路的激活,以誘導氧化應激和超炎癥反應,最終導致急性肺損傷,即可認為炎癥治療在COVID-19治療中至關重要[11]。網絡藥理學與分子對接的方法,以分子對接中配體分子與受體蛋白之間的最優結合能小于SARS-Cov-2的臨床推薦化學藥物為條件選擇出巴蜀顆粒治療COVID-19的活性成分,槲皮素、山奈酚和木犀草素是巴蜀顆粒治療新冠肺炎最新變異株奧密克戎感染引起癥狀的潛在物質基礎。以上3個活性成分均為天然的黃酮類化合物,具有較強的抗病毒[12-14]、抗炎[15-17]、抗菌[18]、抗癌[19-21]、抗氧化[22-23]等藥理作用。槲皮素可通過調節T淋巴細胞的作用改善肺纖維化大鼠的氣道高反應,使肺纖維化大鼠血清中IL-17表達降低,進而對肺纖維化氣道有較好的治療效果[24]。山奈酚參與抑制一氧化氮和iNOS水平,而一氧化氮和iNOS水平是導致炎癥的氧化應激的關鍵介質[25]。木犀草素的處理可以抑制NF-κB信號通路中IκB激酶β亞基磷酸化,下調TNF-α、IL-6的mRNA水平[26]。本研究結果顯示巴蜀顆粒中的活性成分具有抑制巨噬細胞炎癥反應的作用。