復方苦參注射液對原發性肝癌pokemon表達的影響機制

張全樂, 劉 剛, 邢雅娟, 郭 紅, 李 亞

(滄州中西醫結合醫院消化科, 河北 滄州 061000)

原發性肝癌是肝細胞或肝內膽管細胞發生的癌變,主要包括肝細胞癌、肝內膽管癌和混合型肝細胞癌-膽管癌3種不同病理學類型[1]。原發性肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一,其發病率居惡性腫瘤第6位,在惡性腫瘤引起的死亡原因中居第4位[2]。目前,原發性肝癌常見治療方法包括肝切除術、肝移植術、消融治療、經導管肝動脈化療栓塞術(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)、 放射治療、系統抗腫瘤治療等,針對不同分期的肝癌患者選擇合理的治療方法可達到最佳的療效[3]。但由于大多數肝癌患者確診時已為中晚期,常常合并肝硬化、血小板降低、凝血功能障礙等禁忌癥,且受到病灶位置、數量、合并疾病所限,不能行手術切除、肝移植等治療措施,臨床預后較差[4]。復方苦參注射液是以苦參為主要成分的中藥制劑,具有抑制腫瘤細胞增殖、血管形成、上皮間質轉化等作用[5]。研究顯示,復方苦參注射液對肝癌有明顯的抑制作用,但其作用機制尚不完全清楚[6]。本研究探究復方苦參注射液聯合TACE治療原發性肝癌的治療效果及作用機制,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2018年1月-2021年12月河北省滄州中西醫結合醫院消化科收治的100例原發性肝癌患者為研究對象,其中男性61例,女性39例,年齡39～78歲,平均年齡(48.9±9.9)歲。原發性肝癌診斷標準[3]:(1)肝臟結節符合CT增強的典型影像學表現;(2)肝臟結節CT影像學表現不典型者,通過肝臟穿刺活組織檢查病理證實。以上標準符合其一即可診斷為肝癌。納入標準:(1)靶病灶2 cm～8 cm;(2)存在手術切除或肝移植禁忌癥或不同意以上治療。排除標準:(1)腫瘤巨大,占肝臟體積超過70%;(2)門靜脈主干或主要分支、下腔靜脈、膽管癌栓形成;(3)食管胃底靜脈重度曲張;(4)Child-Pugh肝功能分級為C級;(5)大量腹水;(6)腎功能不全;(7)全身一般狀況差,不能耐受介入治療;(8)碘造影劑過敏;(9)參與其它肝癌治療臨床研究。本研究通過滄州中西醫結合醫院倫理委員會審批,患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器pokemon ELISA試劑盒(英國ABCAM公司);Trizol RNA試劑(南京金思特公司);MmLV逆轉錄酶、RNasin、Taq酶、羊抗兔二抗(加拿大Fermentas公司);兔抗人pokemon一抗(英國ABCAM公司);pokemon上下游引物(上海生工公司);DNA凝膠回收試劑盒(美國Axygen公司);PCR儀(美國Bio-Rad公司);凝膠圖像分析儀(上海培清公司);DNM-9602A酶標分析儀(北京普朗新技術公司)。

1.3 治療方法將100例原發性肝癌患者隨機分為治療組與對照組,每組50例。對照組單純行TACE治療,具體操作如下:穿刺股動脈置管成功后,進行肝固有動脈造影確定腫瘤位置及血管供應情況。將藥物(由40 mg 5-氟尿嘧啶,上海旭東海普藥業有限公司;90 mg順鉑,廣東嶺南制藥有限公司;20 mg多柔比星,輝瑞制藥有限公司;10 mL超液化碘油,上海旭東海普藥業有限公司混合而成)沿導管緩慢注入血管內,然后在供血動脈處行栓塞術。每4周為1個周期,連續治療2個周期。治療組在TACE治療的基礎上,加用復方苦參注射液治療(山西振東制藥股份有限公司),具體用法如下:0.9%氯化鈉注射液200 mL+復方苦參注射液20 mL,靜脈滴注,每日1次,連續10 d為1個周期,間隔4周治療1次,連續治療2個周期。

1.4 指標的測定

1.4.1 肝癌患者血清中pokemon表達量檢測 治療前1天及治療結束后1個月抽取患者空腹靜脈血5 mL,靜置20 min后, 4℃下2 000 r/min離心10 min,取上清液,采用酶聯免疫吸附法,按照試劑盒說明書操作檢測血清中pokemon表達量。

1.4.2 HepG2細胞中pokemon mRNA表達量檢測 培養肝癌HepG2細胞株,分為空白對照組、陰性對照組和實驗組。空白對照組加入不含藥物的培養基,陰性對照組及實驗組在使用培養基的基礎上,分別加入0.9%氯化鈉注射液及濃度為5 mg/mL的復方苦參注射液2 mL孵育24 h。采用Trizol法提取各組細胞的總RNA,逆轉錄合成cDNA,然后使用pokemon及內參β-actin的上下游引物進行PCR擴增。取5 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外凝膠成像儀上進行拍照,QuantiScan軟件分析電泳條帶灰度值,計算mRNA表達的相對強度。mRNA表達的相對強度=pokemon條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.4.3 HepG2細胞中pokemon蛋白表達量檢測 采用RIPA裂解液提取“1.4.2”項下各組細胞中的總蛋白,Bradford法測定蛋白濃度,置于-80℃冰箱保存備用。進行Western blot時,首先制作10%分離膠和5%濃縮膠,從冰箱中取出蛋白樣品,加入5×SDS緩沖液,煮沸5 min,然后進行上樣,每個孔的上樣量為40 μg。設置起始電壓為8 V/cm,當溴酚蘭進入分離膠時電壓調整為15 V/cm,電泳至溴酚蘭涌出時結束。電泳完畢后將凝膠中蛋白轉移至NC膜上,5%的封閉液封閉2 h后,加入一抗(兔抗人pokemon蛋白多克隆抗體,1∶200),4℃過夜;洗膜,再加入二抗(羊抗兔IgG-HRP,1∶10 000)孵育1 h,洗膜后進行ECL顯色,計算pokemon蛋白表達的相對強度。pokemon蛋白表達的相對強度=pokemon條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.4.4 HepG2細胞增殖檢測 收集對數生長期的HepG2細胞,以5 000個/孔接種至96孔板,每孔加入100 μL,5%CO237℃孵育至細胞單層鋪滿孔底,將細胞分為3組,即空白對照組、陰性對照組和實驗組。空白對照組為不含藥物的培養基,陰性對照組及實驗組為分別加入0.9%氯化鈉注射液或含5 mg/mL的復方苦參注射液各100 μL,5%CO237℃孵育24 h,棄去培養基,PBS清洗3次,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL繼續培養2 h,棄去MTT,各孔加入150 μL的DMSO,室溫下低速震蕩10 min,用酶標儀測定490 nm處各孔的吸光(OD)值,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=1-OD實驗組或陰性對照組/OD空白對照組×100%。

1.4.5 臨床有效率的測定 采用肝臟多層螺旋CT測定治療前及治療后1個月腫瘤病灶變化,腫瘤病變按照國際通用的實體瘤療效評價標準1.1(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST 1.1)[7]進行評估,分為完全緩解(Complete remission,CR):腫瘤完全消失,持續>4周;部分緩解(Partial remission,PR):腫瘤病灶長徑總和減少≥30%,維持>4周;疾病穩定(Stabilization of disease,SD):腫瘤病灶總和減少但未達到 PR;疾病進展(Progression disease,PD):腫瘤基線病灶長徑增加≥20%,或出現新病灶。臨床有效率=(CR+PR)/總病例數×100%。

2 結果

2.1 兩組治療效果比較治療組臨床有效率為88%(44/50);對照組有效率為70%(35/50),兩組比較差異有統計學意義(P=0.048),見表1。

2.2 影響治療效果變量分析將年齡(>45歲vs≤45歲)、性別(男性vs女性)、腫瘤位置(肝左葉vs肝右葉)、腫瘤大小(2 cm<直徑≤5 cmvs5 cm<直徑<8 cm)、腫瘤數量(1～3個vs大于3個)、pokemon表達量、治療方式(復方苦參注射液聯合TACEvsTACE)7個因素,進行單因素條件Logistic回歸分析。結果顯示,pokemon表達量、復方苦參注射液治療為影響患者治療效果的變量,其OR分別為1.698(95%CI:1.004～5.886)、4.518(95%CI:2.347～6.271),見表2。

表2 影響治療效果變量分析

2.3 兩組pokemon的表達量比較治療組治療前pokemon表達量為(122.35±16.12) ng/mL,治療后pokemon的表達量為(20.90±1.94) ng/mL,治療前后相比,差異有統計學意義(t=6.059,P=0.000 2);對照組治療前pokemon的表達量為(110.92±13.98) ng/mL,治療后pokemon的表達量分別為(31.90±3.11) ng/mL,治療前后相比,差異有明顯統計學意義(t=5.058,P=0.001);治療組與對照組治療后pokemon表達量相比,差異有統計學意義(t=-2.905,P=0.017),見表3。

表3 兩組pokemon表達量比較

2.4 實驗組與陰性對照組HepG2細胞增殖抑制率比較實驗組HepG2細胞增殖抑制率在24、48、72 h時高于陰性對照組(F=196.98,P=0.000;F=129.73,P=0.000;F=7.86,P=0.049);在96、120 h時實驗組與陰性對照組HepG2細胞增殖抑制率比較差異無統計學意義(P>0.05),見表4。

表4 實驗組及陰性對照組HepG2細胞增殖抑制率

2.5 三組HepG2細胞pokemon mRNA表達量比較空白對照組細胞pokemon mRNA表達的相對強度為(0.68±0.12),陰性對照組細胞pokemon mRNA表達的相對強度為(0.60±0.18),實驗組細胞表達的相對強度為(0.17±0.01)。三者相比,實驗組細胞pokemon mRNA表達的相對強度明顯低于空白對照組及陰性對照組(F=12.721,P=0.001),而空白對照組與陰性對照組相比,差異無統計學意義(F=2.468,P=0.340),見圖1。

圖1 三組HepG2細胞pokemon mRNA(A)及蛋白(B)表達量

2.6 三組HepG2細胞pokemon蛋白表達量比較空白對照組pokemon蛋白表達的相對強度為(11.87±2.63),陰性對照組相對強度為(12.05±1.97),實驗組相對強度為(8.47±0.87)。三者相比,實驗組細胞pokemon蛋白表達的相對強度明顯低于空白對照組及陰性對照組(F=10.409,P=0.003),而空白對照組與陰性對照組相比,差異無統計學意義(F=2.357,P=0.364),見圖1。

3 討論

復方苦參注射液由苦參、白土苓組成,主要活性成分為氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿[8]。研究顯示,復方苦參注射液對肝癌有明顯的抑制作用。陽衛立等[9]通過對復方苦參注射液聯合肝動脈化療栓塞術治療原發性肝癌的臨床療效及安全性meta分析顯示,復方苦參注射液聯合TACE療法能明顯改善原發性肝癌患者的臨床療效和遠期生活質量,提高患者的1年生存期,減少TACE治療的臨床不良反應。姚華等[10]研究顯示,復方苦參注射液聯合TACE臨床總有效率、腫瘤控制率、AFP降低值、腫瘤體積縮小值、MELD評分降低值及KPS增高值均明顯升高,且CD4+、CD4+/CD8+、CD3+T淋巴細胞及自然殺傷細胞等免疫指標亦明顯增高,以上指標均優于單獨TACE治療。本研究顯示,復方苦參注射液聯合TACE治療臨床有效率亦高于單獨TACE治療,進一步通過Logistic回歸分析影響治療效果的變量發現,復方苦參注射液治療為影響患者治療效果的變量。由此可見,復方苦參注射液可明顯提升TACE的治療效果,延長患者的生存期,改善患者的生活質量和免疫狀態。但不同臨床研究報道的臨床有效率存在差異,推測可能與研究方法、病例選擇、樣本數量、統計性方法不同有關。另外,目前復方苦參注射液聯合TACE治療肝癌仍缺乏高質量的循證醫學研究證據,有待于進一步研究。

復方苦參注射液對肝癌細胞生長抑制的作用機制尚未完全明確。張大為等[11]研究表明,復方苦參注射液對肝癌 HepG2細胞增殖、侵襲具有抑制作用,且該作用與抑制JAK2/STAT3信號通路有關。陽衛立等[12]研究發現,復方苦參注射液可誘導LC3及SQSTM1的轉錄水平升高,導致細胞發生自噬現象,從而抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖,且作用呈濃度依賴性。復方苦參注射液對肝癌細胞中pokemon的作用尚未明確,本研究選擇pokemon作為復方苦參注射液的可能作用靶點進行檢測,基于以下考慮:(1)pokemon基因控制著肝癌細胞突變的整個過程,c-myc、H-ras、N-ras等癌基因不具備類似的功能[13-15]。(2)本研究單因素條件Logistic回歸分析結果顯示,pokemon表達量、復方苦參注射液治療為影響患者治療效果的變量,兩種變量之間可能存在相關性。(3)本課題組既往研究顯示,肝癌組織中pokemon mRNA及蛋白表達均高于癌旁組織,且pokemon的表達量與患者腫瘤大小有關,而與患者年齡、腫瘤組織分化程度、門靜脈癌栓形成、淋巴結轉移、肝外遠處轉移以及腫瘤TNM分期均無相關性。肝癌患者血清中pokemon表達量高于良性肝病患者及正常人,且pokemon的表達量與腫瘤直徑有關[16-17]。這提示pokemon基因的表達與肝癌存在密切關系,其在肝癌中表達量增加可能與肝癌細胞的惡性增殖有關。本研究顯示,在體內復方苦參注射液治療后pokemon的表達量較治療前明顯降低;在體外復方苦參注射液能明顯抑制HepG2細胞的生長活性, 復方苦參注射液干預的HepG2細胞中pokemon mRNA及蛋白表達強度明顯低于空白對照組及陰性對照組。由此推測復方苦參注射液通過影響pokemon表達,繼而抑制肝癌細胞的增殖。

綜上所述,復方苦參注射液對原發性肝癌有一定的臨床療效,其機制可能與減少肝癌細胞中pokemon的表達量有關。