miR-10b靶向IGF-1R調控乳腺癌合并2型糖尿病患者癌細胞的增殖和轉移

楊 欣, 穆 飛, 尼加提·塔西甫拉提, 哈依納爾·卡克贊, 郭晨明

(新疆醫科大學第一附屬醫院昌吉分院甲狀腺乳腺外科, 新疆 昌吉 831100)

乳腺癌在全球新發腫瘤中排第一位,2020年已有超過230萬的新確診病例。近年來中國女性乳腺癌發病率顯著增高,死亡率約為6.9%[1],高達15%的乳腺癌患者患有2型糖尿病[2]。與乳腺癌不合并2型糖尿病患者相比,乳腺癌合并2型糖尿病患者的總生存期更差[3]。流行病學研究表明,2型糖尿病與惡性腫瘤的高發病率之間存在相關性,特別是乳腺癌(風險約增加1.2～1.5倍)[4],兩者均有肥胖、吸煙、飲酒、飲食等共同的易感因素[5]。研究指出,2型糖尿病與乳腺癌的關聯可能與多種原因有關,包括高血糖、胰島素信號通路、胰島素樣生長因子1(IGF-1)信號通路和內源性性激素的調節[6-7],但具體機制仍有待深入研究。

微小RNA(miRNA)是由大約22個核苷酸結構組成的非編碼單鏈RNA。一個miRNA可直接或間接靶向調控數百個mRNA,形成一個復雜的miRNA-mRNA網絡,以調節細胞過程[8]。Ma等[9]的研究發現,在轉移性乳腺癌細胞中miR-10b過表達與腫瘤的遷移與侵襲相關。另一項研究顯示,miR-10b與乳腺腫瘤發生腦轉移呈正相關[10]。然而,miR-10b在乳腺癌合并2型糖尿病患者中的具體作用機制尚不明確。本研究分析乳腺癌合并2型糖尿病患者的組織樣本,進一步探討miR-10b在乳腺癌合并2型糖尿病患者中調節胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)信號通路中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年7月-2019年12月新疆醫科大學第一附屬醫院乳腺外科26例合并2型糖尿病的乳腺癌女性患者(病例組)癌組織及相關的臨床病理資料,對照組樣本為相應的癌旁組織。所有新鮮乳腺組織都是一份病理包埋,一份迅速轉入液氮中,-80℃儲存備用。本研究經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審批(審批號:201112013RXW),并獲得所有受試者的書面知情同意。

1.2 試劑與儀器HEK293T細胞、MCF-7細胞(武漢普諾塞公司);MEM、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸緩沖液、青霉素、鏈霉素、嘌呤霉素(美國Gibco公司)。逆轉錄試劑盒(miScript II RT Kit50)、PCR試劑盒(QuantiNova SYBR Green PCR Kit500、miScript SYBR Green PCR Kit200)均購于美國Qiagen公司;PCR試劑盒TRIzol(美國Invitrogen公司);PCR引物(北京天根生化科技有限公司);磷酸酶抑制劑混合物(HaltTMPhosphatase Inhibitor Cocktail)BCA法蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術公司);MTT試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司);抗IGF-1R抗體和二抗(英國Abcam公司);熒光素酶報告載體[pGL3-IGF-1R-3′UTR野生型(Wt)、pGL3-IGF-1R-3′UTR突變型(Mut)和pGL3-IGF-1R-3′UTR空載型(NC)]購自上海吉凱基因科技有限公司。圖像采集系統(Leica DM3000),熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96),電泳儀(Bio-RadPowerPac HC),凝膠成像儀(Bio-RadChemiDoc MP),超低溫冰箱(Thermo Forma 995),Dual-Luciferase?報告分析系統(Promega E1910)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與分組 從癌癥細胞系百科全書(Cancer cell line encyclopedia,CCLE)數據集(https://portals.broadinstitute.org/ccle/about)獲得乳腺腫瘤的常用細胞miRNA表達矩陣。在乳腺惡性腫瘤常用細胞中,發現MCF-7細胞中miR-10b表達水平最高,因此選取MCF-7細胞用于后續試驗。細胞在含有10%胎牛血清的MEM培養基中培養,置于恒溫培養箱中(37℃、5%CO2),隔天換液1次,待細胞生長至80%密度時傳代培養。細胞分為normal組(不做轉染)、miR-10b-mimic組(轉染空載病毒)、miR-10b-inhibitors組(轉染miR-10b抑制劑),按照分組名稱進行慢病毒轉染。

1.3.2 細胞增殖能力檢測 取5×103細胞/孔種植于96孔培養皿上,在37℃,5%CO2下生長8 h,去上清,用新鮮培養基代替,添加25 μL MTT溶液(5 mg/mL),37℃下孵育4 h,去上清,向每孔中加入100 μL二甲基亞砜。用旋轉振動篩劇烈攪拌30 min。用5.5 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L葡萄糖分別刺激人MCF-7細胞8 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h。用酶標儀測量595 nm處的吸光度。

1.3.3 細胞凋亡檢測 將每組制備的單細胞懸浮液離心,抽吸上清液。加入緩沖液,重懸細胞,將細胞濃度調整為1×106細胞/mL。按照Annexin V-FITC-PI試劑盒說明書進行染色,流式細胞術檢測凋亡細胞比例。

1.3.4 細胞遷移能力檢測 轉染后用胰蛋白酶消化細胞,懸浮于無血清培養基中,將細胞懸液加入鋪好基質膠的上室,將含20%胎牛血清的600 μL培養液加入下室。常規培養24 h后,擦去表面基質膠和上室內的細胞。結晶紫染色24 h后計算上腔室遷移細胞的體積。

1.3.5 qRT-PCR 按照TRIzol試劑說明書從病例組和對照組乳腺組織中分離總RNA,利用分光光度儀對總RNA的純度及濃度進行檢測。實施反轉錄后檢測miR-10b和IGF-1R的含量。引物序列如下: Hsa-miR-10b-5P, UACCCUGUAGAACCGA-AUUUGUG;U6,CGCTTCGGCAGCACATATAC;microRNA的另一條引物為通用引物。IGF-1R上游引物,CCGCTGCCAGAAAATGTGCCCA;下游引物,TGTCGTTGTCAGGCGCGCTG;GAPDH上游引物,GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;下游引物,TGGTGAAGACGCCAGTGGA。本實驗miR-10b以U6為內參基因,IGF-1R以GAPDH為內參基因。采用2-△△Ct法測定基因的相對表達水平。

1.3.6 Western-blot檢測IGF-1R蛋白 取MCF-7細胞用液氮研磨后加入磷酸酶抑制劑混合物和RIPA裂解液進行蛋白裂解,離心,獲取組織蛋白,采用BCA比色法計算蛋白濃度。蛋白樣品采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離,轉移到聚偏氟乙烯膜上,用5%脫脂牛奶密封2 h后與稀釋后的一抗IGF-1R(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)在4℃搖床孵育過夜,室溫下TBST洗滌5次×5 min,隨后用稀釋AP標記的對應二抗(1∶2 000)在搖床上室溫孵育2 h,用TBST洗滌5次×5 min,用AP-NBT/BICP顯色法檢測,用Image J對圖像進行灰度分析。

1.3.7 熒光素酶報告基因實驗 將HEK293T細胞種植在24孔生長板上,與pGL3-IGF-1R-3′UTR Wt或pGL3-IGF-1R-3′UTR Mut共轉染,并轉染miR-10b質粒及匹配空載質粒。轉染后繼續培養48 h,通過Dual-Luciferase?報告分析系統評估熒光素酶活性。

1.3.8 免疫組織化學 組織常規石蠟包埋制成切片。將50 μL的抗體加入切片,室溫下接種30 min,用PBS沖洗,取連續切片,二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、抗原修復、山羊血清封閉后加入IGF-1R抗體,37℃孵育10～15 min,DAB顯色、復染、脫水、透明、封片。采用Image J軟件對各組免疫組化切片進行半定量分析,在200×倍鏡下,陽性細胞可被染成棕黃色顆粒。

2 結果

2.1 病例組和對照組乳腺組織中miR-10b與IGF-1R表達水平比較與對照組相比,病例組乳腺癌組織中可見大量具有細胞異型性的腫瘤細胞。與對照組相比,病例組乳腺癌組織中IGF-1R表達水平顯著降低,miR-10b表達水平顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.01～0.05)(圖1)。

注: A, 病例組與對照組乳腺組織HE染色; B, 病例組與對照組乳腺組織中miR-10b的表達水平; C, 病例組與對照組乳腺組織免疫組化結果; D, 病例組與對照組乳腺組織中IGF-1R的表達水平;與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.2 不同葡萄糖濃度刺激對MCF-7細胞增殖的影響25 mmol/L葡萄糖濃度刺激下,MCF-7細胞增殖能力明顯增加;50 mmol/L葡萄糖濃度刺激下細胞的增殖能力低于5.5 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖濃度刺激(圖2A)。miR-10b抑制劑轉染中MCF-7細胞的增殖能力隨著葡萄糖濃度的增加而降低(圖2B)。因此,以25 mmol/L葡萄糖濃度作為高糖環境進行后續實驗。

注: A, 不同葡萄糖濃度和時間對MCF-7細胞增殖的影響; B, 不同葡萄糖濃度和時間對miR-10b抑制劑轉染中MCF-7細胞增殖的影響; *P<0.05; **P<0.01。

2.3 miR-10b對MCF-7細胞凋亡的影響與normal組比較,25 mmol/L葡萄糖濃度下miR-10b-inhibitors組MCF-7細胞凋亡率升高,差異有統計學意義(P<0.05);與miR-10b-mimic組比較,25 mmol/L葡萄糖濃度下miR-10b-inhibitors組MCF-7細胞凋亡率明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01)(圖3)。

注: A和B, 25 mmol/L葡萄糖濃度下轉染不同質粒的MCF-7細胞的細胞流式圖; C, 細胞凋亡檢測結果; 與normal組比較, *P<0.05; 與miR-10b-mimic組比較, **P<0.01。

2.4 miR-10b對MCF-7細胞遷移的影響25 mmol/L葡萄糖濃度下,與miR-10b-mimic組比較,miR-10b-inhibitors組MCF-7細胞數量減少,遷移能力降低,差異具有統計學意義(P<0.001)(圖4)。

注:與miR-10b-mimic組比較, ***P<0.001。

2.5 不同葡萄糖濃度刺激對MCF-7細胞中IGF-1R表達的影響25 mmol/L葡萄糖濃度下,miR-10b-inhibitors組中IGF-1R mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)(圖5)。

2.6 miR-10b的靶點分析與miR-10b-mimic組比較,在miR-10b-inhibitors組中pGL3-IGF-1R-3′UTR Wt的熒光素酶活性被顯著抑制(P<0.05),而pGL3-IGF-1R-3′UTR Mut的熒光素酶活性未受影響(P>0.05)(圖6、表1)。

表1 miR-10b靶基因預測和熒光素酶測定數據

注: 與miR-10b-mimic組比較, *P<0.05。

3 討論

乳腺癌是女性中發病率最高的一種惡性腫瘤,發生轉移是患者治療失敗和死亡的主要原因。miRNAs是一類小分子非編碼調控RNA,在乳腺癌中發揮著致癌基因或抑癌基因的作用。研究發現miRNA-10b在晚期及轉移性乳腺癌組織中過表達,可能與乳腺癌的轉移密切相關[11]。Tahiri等[12]研究發現miRNA-10b在晚期乳腺癌中高表達,可作為早期乳腺癌轉移的特征分子標志物。Ma等[9]的研究發現,miRNA-155、miRNA-9a和miRNA-10b在乳腺癌細胞中高表達,而只有miRNA-10b在轉移性乳腺癌細胞中有特異性高表達。

流行病學調查資料顯示,女性糖尿病患者患乳腺癌的風險率比單純患乳腺癌女性高20%,且以2型糖尿病為主[13],江燕麗等[14]研究發現合并糖尿病的乳腺癌患者淋巴結3枚以上轉移率為33.3%,高于無糖尿病的乳腺癌患者的12.0%,合并糖尿病的乳腺癌患者Ⅲ級腫瘤浸潤率為46.7%,高于無糖尿病的乳腺癌患者的22.7%。以上結果提示糖尿病會增加乳腺癌的發病,并且能促進乳腺癌的浸潤轉移,盡管糖尿病-癌癥的流行病學關系已經被熟知,但聯系這些疾病的機制尚不明確。糖尿病存在胰島素抵抗和葡萄糖清除減少,同時產生干擾胰島素信號傳導的細胞因子,而胰島素樣生長因子1型(IGF-1)信號通路就成了糖尿病和癌癥的病理生理過程的主要調控因子。有研究報道約75%的乳腺癌患者的組織或細胞中胰島素/IGF-1R信號通路被顯著激活[15]。本研究結果顯示,相較于癌旁組織,IGF-1R在合并2型糖尿病的乳腺癌患者的癌組織中的表達反而降低。Hou等[16]報道MicroRNA-10b通過直接靶向IGF-1R來抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,提示IGF-1R的表達水平與miR-10b的表達可能相關。有研究報道miR-10b表達提高了膀胱癌、鼻咽癌和胃癌細胞的遷移和侵襲能力[17-19]。研究發現,miR-10b表達的恢復增強了肝細胞癌的增殖、遷移和侵襲[20-21]。為了進一步證明miR-10b在合并2型糖尿病的乳腺癌患者中如何調控IGF-1R,進而影響乳腺癌細胞增殖和侵襲能力,本研究通過熒光素酶報告基因實驗驗證,結果表明miR-10b與IGF-1R存在直接靶向調控關系,并采用體外實驗,利用高含量葡萄糖培養乳腺癌細胞來模擬合并2型糖尿病的乳腺癌體內環境。建立了穩定轉染miR-10b抑制劑(miR-10b-inhibitors組)和轉染空載病毒(miR-10b-mimic組)的細胞。結果顯示,miR-10b-inhibitors組在25 mmol/L濃度的葡萄糖培養條件下,乳腺癌細胞中IGF-1R的含量上升,MCF-7細胞增殖能力下降,細胞垂直遷移能力下降,凋亡增加。表明在高糖環境下,miR-10b直接靶向IGF-1R促進了乳腺癌細胞的生長和遷移。

綜上所述,在高糖環境中靶向抑制乳腺癌細胞miR-10b的表達,會促進IGF-1R的表達從而使得乳腺癌細胞增殖被抑制,凋亡增加,侵襲能力下降,miR-10b具有靶向IGF-1R調控高糖環境下乳腺癌細胞的增殖和轉移,為研究糖尿病和癌癥之間的作用機制提供新的思路。